引用本文： 宋志芳, 劉德伍, 彭燕, 李津, 章志偉, 寧璞, 劉移峰. miRNA-203轉染誘導人表皮干細胞向汗腺細胞分化的研究. 中國修復重建外科雜志, 2015, 29(3): 343-350. doi: 10.7507/1002-1892.20150073 復制
嚴重燒傷、創傷常造成皮膚組織廣泛缺損，創面修復后，因汗腺缺失或其分泌管道被瘢痕組織堵隔而喪失了分泌汗液的功能，導致患者體溫調節功能障礙。如何修復汗腺等附屬器以實現皮膚的功能重建，是目前醫學研究熱點[1]。近期研究表明miRNA與皮膚再生修復相關[2-3]，作為表皮及毛囊特有的miRNA-203伴隨著表皮分化的開始而表達，即在富含表皮干細胞的表皮基底層低表達，而在富含角質形成細胞的基底上層高表達，提示其可能在皮膚發育中起著增殖和分化的開關作用[4-5]。Nissan等[6]發現miRNA-203能調控胚胎干細胞向角朊細胞的早期定向分化。miRNA-203能否誘導人表皮干細胞向汗腺細胞分化，目前尚不清楚。本研究設計合成了miRNA-203模擬物，通過脂質體轉染將其導入人表皮干細胞，探索體外誘導表皮干細胞向汗腺細胞分化的可能性，為實現創面的功能愈合提供新思路與理論依據。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
0.25 %胰蛋白酶-EDTA、EGF、角質細胞無血清培養基（keratinocyte serum free medium，K-SFM）、FBS、Ⅳ型膠原、Opti-MEM培養基（GIBCO公司，美國）；兔抗人β1整合素（integrin β1，ITGB1）、角蛋白1（cytokeratin 1，CK1）、CK10、CK19、CK18、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、P63（Abgent公司，美國）；辣根過氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）標記的山羊抗兔二步法免疫組織化學檢測試劑盒（PV-9000）、山羊抗兔IgG-HRP二抗、兔抗人β肌動蛋白一抗（北京中杉金橋生物技術有限公司）；FAM標記的人miRNA-203模擬物及FAM標記的對照miRNA（上海吉瑪制藥技術有限公司）；Trizol、脂質體Lipofectamine 2000轉染試劑（Invitrogen公司，美國）；mirVanaTM miRNA純化試劑盒（Ambion公司，美國）；互補DNA反轉錄試劑盒、SYBR Green熒光定量試劑盒（TaKaRa公司，日本）；Super-Bradford 蛋白定量試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司）。
CK40型倒置相差顯微鏡、CKX41型倒置熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）；CO2培養箱（Thermo公司，德國）；FACSCalibur 流式細胞儀（BD 公司，美國）；分光光度計（NanoDrop公司，美國）；7900 HT型熒光定量RT-PCR儀（ABI公司，美國）；Image Pro-plus 6.0圖像分析軟件（Media Cyberneties公司，美國）；電泳儀、電轉儀（北京六一儀器廠）。
1.2 人表皮干細胞的分離培養及鑒定
取2013年9月－11月在南昌大學第一附屬醫院泌尿外科行包皮環切術的5例患者正常包皮組織標本，年齡18～40歲；患者均知情同意，研究方案經醫院醫學倫理委員會審核批準。采用0.25%胰蛋白酶-EDTA聯合消化法分離表皮與真皮，應用Ⅳ型膠原快速黏附法[7]篩選獲得人表皮干細胞，在由EGF、K-SFM組成的培養基中進行體外培養，之后定期換液，倒置相差顯微鏡觀察細胞分離即刻及培養3 d的生物學特性。細胞生長至90%融合時進行消化傳代，取第2代細胞進行后續實驗。采用HRP標記的山羊抗兔二步法免疫組織化學檢測試劑盒行CK19、ITGB1、CK1、CK10、CK18、CEA免疫細胞化學染色鑒定。
1.3 細胞轉染及相關檢測
1.3.1 實驗分組
取第2代人表皮干細胞，按說明書運用脂質體 Lipofectamine 2000轉染試劑進行轉染。根據人源miRNA-203序列，設計并合成其雙鏈模擬物，實驗組和對照組分別轉染FAM標記的人miRNA-203模擬物（n=5）及FAM標記的對照miRNA（n=5）。轉染6 h后倒置熒光顯微鏡下觀察轉染情況，FACSCalibur 流式細胞儀檢測轉染效率，重復3次。轉染72 h后倒置相差顯微鏡觀察兩組細胞形態變化。
1.3.2 轉染后免疫細胞化學染色觀察
兩組細胞轉染后，于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱孵育72 h，以PV-9000二步法行ITGB1、CK19、CK1、CK10、CK18、CEA免疫細胞化學染色觀察，按試劑盒說明書進行操作。
1.3.3 實時熒光定量RT-PCR檢測
取轉染前及實驗組、對照組轉染72 h后的細胞，采用Trizol法分別提取總RNA，用分光光度計定量，甲醛變性膠電泳質檢總RNA的質量。使用 mirVanaTM miRNA純化試劑盒對總RNA進行純化，純化后重新定量。① miRNA-203的mRNA表達檢測：每個樣本各取2 μg總RNA，采用互補DNA反轉錄試劑盒合成總互補DNA，反轉錄產物采用SYBR Green熒光定量試劑盒和熒光定量RT-PCR儀行PCR。人miRNA-203及內參照U6的反轉錄引物和PCR引物均購自上海吉瑪制藥技術有限公司，引物序列見表 1。PCR反應條件：95℃預變性10 min；95℃變性15 s，60℃退火l min，40個循環。每個樣本重復PCR反應3 次。采用Δ 循環閾值（Ct）法處理結果，計算相對表達量2-ΔΔCt。② P63、ITGB1、CK19、CK1、CK10、CK18、CEA的mRNA表達檢測：每個樣本各取2 μg總RNA，以OligdT為反轉錄引物，應用互補DNA反轉錄試劑盒合成總互補DNA。采用引物設計軟件Primer Premier 5.0設計P63、ITGB1、CK19、CK1、CK10、CK18、CEA及內參照β-actin的PCR引物，引物序列由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列見表 1。反轉錄產物采用SYBR Green熒光定量試劑盒和熒光定量RT-PCR儀行PCR。每個樣本重復PCR反應3次。PCR反應條件及表達量計算方法同① 。
表1
實時熒光定量RT-PCR引物序列及產物大小
Table1.
Real-time fluorescence quantitative RT-PCR primer sequences and product sizes
1.3.4 Western
blot檢測提取轉染前及實驗組和對照組轉染72 h后細胞的總蛋白，用二辛丁酸法進行蛋白定量，100℃變性10 min，各取50 μg行PAGE凝膠電泳，轉移至硝酸纖維濾膜上，封閉。分別加入兔抗人P63一抗、兔抗人ITGB1一抗、兔抗人CK19一抗、兔抗人CK1一抗、兔抗人CK10一抗、兔抗人CK18一抗、兔抗人CEA一抗、兔抗人β-actin一抗（稀釋比均為1∶200），4℃孵育過夜；TTBS液沖洗后加入羊抗兔IgG-HRP二抗（稀釋比為1∶5 000），室溫孵育2 h；TTBS液沖洗后曝片，膠片用掃描儀掃描成像，Image Pro-plus6.0圖像分析軟件進行灰度分析，結果以目的蛋白與β-actin的灰度值比值表示。實驗重復3次。
1.4 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；對miRNA-203的mRNA表達與P63的mRNA和蛋白表達分別行Pearson相關分析；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 人表皮干細胞形態學觀察及鑒定
倒置相差顯微鏡觀察示，快速黏附于Ⅳ型膠原的細胞群細胞呈圓形，分散較均勻，細胞體積較小，細胞核大，核質比大，折光性較強（圖 1 a）；孵育3 d后，細胞貼壁牢固并形成明顯克隆，符合表皮干細胞特征（圖 1 b）。免疫細胞化學染色示，CK19、ITGB1呈棕黃色陽性表達，CK1、CK10、 CK18、CEA呈陰性表達，符合表皮干細胞特征。見圖 2。
圖1
人表皮干細胞形態學觀察（倒置相差顯微鏡×100） ? 細胞分離即刻細胞培養3 d? ?圖 2 人表皮干細胞免疫細胞化學染色觀察（倒置相差顯微鏡×100） ? CK19 ITGB1 CK1 CK10 CK18 CEA? ?圖 3 兩組細胞轉染6 h后倒置熒光顯微鏡觀察（×100） ? 實驗組 ? 對照組? ?圖 4 兩組細胞轉染6 h后流式細胞儀檢測 ? 實驗組 ? 對照組? ?圖 5 兩組細胞轉染72 h后倒置相差顯微鏡觀察形態變化（×100） ? 實驗組 ? 對照組
Figure1.
Morphological observation of human epidermal stem cell (Inverted phase contrast microscope×100) ? Cells at immediate after separated Cells cultured for 3 days? ? Fig. 2 Immunohistochemistry staining of human epidermal stem cells (Inverted phase contrast microscope×100) ? CK19 ITGB1 CK1 CK10 CK18 CEA? ? Fig. 3 Inverted fluorescence microscope observation of cells transfected for 6 hours in 2 groups (×100) ? Experimental group ? Control group? ? Fig. 4 Flow cytometry detection of cells transfected for 6 hours in 2 groups ? Experimental group ? Control group? ? Fig. 5 The morphological changes of cells transfected for 72 hours observed by inverted phase contrast microscope (×100) ? Experimental group ? Control group
2.2 細胞轉染及轉染效率
倒置熒光顯微鏡觀察示，實驗組和對照組均可見多數細胞胞質內有熒光顯示（圖 3）；流式細胞儀檢測示，實驗組和對照組轉染后熒光細胞比例分別為41.58%±0.54%和40.84%±0.67%，兩組比較差異無統計學意義（t=1.937，P=0.089），見圖 4。
倒置相差顯微鏡觀察示，實驗組細胞轉染72 h后，細胞大小不一致，分散不均勻，細胞核小，核質比小，且無明顯克隆形成，符合角質形成細胞特征（圖 5 a）；而對照組細胞轉染72 h后仍有克隆形成，符合表皮干細胞特征，轉染前后無顯著差異（圖 5 b）。
2.3 轉染后免疫細胞化學染色觀察
實驗組細胞轉染72 h后免疫細胞化學染色示CK1、CK10、CK18、CEA呈棕黃色陽性表達，CK19、ITGB1呈陰性表達，符合角質形成細胞及汗腺細胞特征（圖 6）；而對照組與轉染前比較無變化。
圖6
實驗組細胞轉染72 h后免疫細胞化學染色觀察（倒置相差顯微鏡×100） ? CK1 ? CK10 ? CK18 ? CEA ? CK19 ? ITB1? ?圖 7 Western blot法檢測各組細胞各蛋白表達 Mr：相對分子質量 1：實驗組 2：轉染前 3：對照組 ? P63 ? CK19 ? ITGB1 ? CK1 ? CK10 ? CK18 ? CEA
Figure6.
Immunocytochemical staining of cells in experimental group transfected for 72 hours (Inverted phase contrast microscope×100) ? CK1 ? CK10 ? CK18 ? CEA ? CK19 ? ITB1? ? Fig. 7 The protein expression of cells by Western blot analysis Mr: Relative molecular mass 1: Experimental group 2: Before transfection 3: Control group ? P63 ? CK19 ? ITGB1 ? CK1 ? CK10 ? CK18 ? CEA
2.4 實時熒光定量RT-PCR檢測
實驗組細胞轉染72 h后，miRNA-203及CK1、CK10、CK18、CEA mRNA的相對表達量均高于轉染前及對照組，而P63、CK19、ITGB1 mRNA的相對表達量均低于轉染前和對照組，比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。對照組與轉染前比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表 2。
表2
實時熒光定量RT-PCR檢測各組各基因表達（n=5，2.5 Western blot檢測
實驗組細胞轉染72 h后，CK1、CK10、CK18、CEA蛋白相對表達量均高于轉染前及對照組，而P63、CK19、ITGB1蛋白相對表達量均低于轉染前和對照組，比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。對照組與轉染前比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表 3、圖 7。
表3
Western blot檢測各組各蛋白表達（n=5，2.6 miRNA-203和P63表達的相關性分析
轉染前后miRNA-203 mRNA表達量與P63的mRNA和蛋白相對表達量均成負相關，轉染前相關系數分別為-0.91（t=3.862，P=0.042）及-0.96（t=5.971，P=0.009）；轉染后相關系數分別為-0.92（t=4.283，P=0.031）及-0.95（t=5.842，P=0.011）。
3 討論
目前對大面積燒傷患者皮膚缺損的修復主要為創面修復，對皮膚功能重建問題仍未解決[8]。患者存活后常由于汗腺缺失，體溫調節功能嚴重受損，生活質量顯著降低[9]。因此，如何實現皮膚附件的功能修復與重建是燒傷創面修復與組織再生研究的熱點及難點[10]。干細胞技術的建立和發展為解決這一難題提供了新的思路，通過干細胞移植誘導再生汗腺是其中的重要方法之一[11-12]。胚胎學上，表皮干細胞與汗腺在發育學上有共同的起源，均起源于外胚層上皮，外胚層上皮細胞通過分裂增殖并內陷在表皮嵴形成上皮細胞索，細胞索的近端發育成導管，末端發育為分泌部，構成汗腺[13]。因此有可能 利用 表皮 干細胞向汗腺細胞定向分化再生汗腺。
miRNA-203是長19～22 nt非編碼單鏈RNA，能與靶mRNA3’UTR區結合在轉錄后水平抑制蛋白質的合成，達到負性調控基因表達的目的[14]。miRNA-203是首個發現在表皮及毛囊表達最豐富的miRNA。若miRNA-203 生物合成所需的Dicer酶或DGCR8基因被敲除，以致miRNA-203合成缺失，可導致皮膚屏障功能缺陷、毛囊發育不良、表皮基底層細胞過度增殖[15-16]，表明miRNA-203對皮膚發育和功能維持具有重要作用。本研究根據人源miRNA-203序列，設計并合成其雙鏈模擬物，利用脂質體轉染將miRNA-203模擬物分子導入人離體表皮干細胞中，通過倒置熒光顯微鏡下觀察、流式細胞儀檢測及轉染前后miRNA-203的實時熒光定量RT-PCR測定均表明轉染成功。對轉染前后的細胞于倒置相差顯微鏡下觀察形態變化，通過免疫細胞化學染色、實時熒光定量RT-PCR及Western blot技術檢測轉染前后細胞ITGB1、CK19、CK1、CK10、CK18、CEA的變化，發現轉染后的細胞CK1、CK10、CK18、CEA高表達，而ITGB1、CK19低表達。已有研究證實ITGB1、CK19表達水平的高低與細胞克隆形成能力即細胞增殖力成正相關，是表皮干細胞的特征蛋白；CK1、CK10是成熟表皮即高分化的角質形成細胞的特征蛋白[17-18]；而CEA、CK18常被作為汗腺上皮標記物[19]。本實驗結果表明，miRNA-203能在體外誘導人表皮干細胞向汗腺上皮細胞及角質形成細胞分化。
同時，本研究發現轉染后表皮干細胞P63mRNA及蛋白的表達較轉染前顯著降低，且與miRNA-203 mRNA的相對表達量成負相關，即miRNA-203與P63兩者呈現相互排斥的表達模式，提示在表皮中P63可能是miRNA-203的靶基因。P63基因作為一種轉錄因子，與細胞周期、 細胞增殖和發育及細胞凋亡的關系密切[20]，在上皮組織尤其是表皮的形態發生中起著獨特作用[21]。已有研究證實在胚胎發育階段，P63能決定外胚層的某些細胞向上皮干細胞方向分化，且是最早啟動外胚層層化的分化標志物和外胚層感應復層化指令的分子開關。在表皮成熟階段，P63通過促進細胞周期中的G1/S期轉化，起著維持表皮及其他復層上皮組織中干細胞增殖潛能的作用[22]。而P63表達下調是表皮干細胞進行分化的必要條件[23]。miRBase數據庫顯示成熟的miRNA-203基因序列為5’-GUGAAAUGUUUAGGACCACUA-G-3’，而P63的mRNA3’非翻譯區基因序列為5’-GAGAAUGAGUCCUUGAUUUCAAA-3’，生物學信息表明，miRNA-203基因序列與P63的mRNA3’非翻譯區匹配，P63基因可能是miRNA-203的靶基因，miRNA-203通過P63的3’非翻譯區靶位點介導直接參與調控P63。因此，結合本實驗結果，提示miRNA-203誘導表皮干細胞向汗腺細胞分化的一個重要機制可能是其通過轉錄后水平抑制靶基因P63的表達，限制表皮干細胞增殖潛能，從而促進表皮干細胞分化為汗腺細胞。
綜上述，本研究利用miRNA-203誘導表皮干細胞表型轉化尤其是向汗腺上皮細胞分化，為構建具有生理功能的人工皮膚提供了新的思路和重要的實驗基礎。若能在體內通過上調miRNA-203的表達優化創面表皮及附屬器的形成，對實現創面從解剖修復到功能修復具有重要意義。但如何成功構建出功能性組織工程皮膚，其中涉及的機制及信號通路等還有待進一步研究。
嚴重燒傷、創傷常造成皮膚組織廣泛缺損，創面修復后，因汗腺缺失或其分泌管道被瘢痕組織堵隔而喪失了分泌汗液的功能，導致患者體溫調節功能障礙。如何修復汗腺等附屬器以實現皮膚的功能重建，是目前醫學研究熱點[1]。近期研究表明miRNA與皮膚再生修復相關[2-3]，作為表皮及毛囊特有的miRNA-203伴隨著表皮分化的開始而表達，即在富含表皮干細胞的表皮基底層低表達，而在富含角質形成細胞的基底上層高表達，提示其可能在皮膚發育中起著增殖和分化的開關作用[4-5]。Nissan等[6]發現miRNA-203能調控胚胎干細胞向角朊細胞的早期定向分化。miRNA-203能否誘導人表皮干細胞向汗腺細胞分化，目前尚不清楚。本研究設計合成了miRNA-203模擬物，通過脂質體轉染將其導入人表皮干細胞，探索體外誘導表皮干細胞向汗腺細胞分化的可能性，為實現創面的功能愈合提供新思路與理論依據。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
0.25 %胰蛋白酶-EDTA、EGF、角質細胞無血清培養基（keratinocyte serum free medium，K-SFM）、FBS、Ⅳ型膠原、Opti-MEM培養基（GIBCO公司，美國）；兔抗人β1整合素（integrin β1，ITGB1）、角蛋白1（cytokeratin 1，CK1）、CK10、CK19、CK18、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、P63（Abgent公司，美國）；辣根過氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）標記的山羊抗兔二步法免疫組織化學檢測試劑盒（PV-9000）、山羊抗兔IgG-HRP二抗、兔抗人β肌動蛋白一抗（北京中杉金橋生物技術有限公司）；FAM標記的人miRNA-203模擬物及FAM標記的對照miRNA（上海吉瑪制藥技術有限公司）；Trizol、脂質體Lipofectamine 2000轉染試劑（Invitrogen公司，美國）；mirVanaTM miRNA純化試劑盒（Ambion公司，美國）；互補DNA反轉錄試劑盒、SYBR Green熒光定量試劑盒（TaKaRa公司，日本）；Super-Bradford 蛋白定量試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司）。
CK40型倒置相差顯微鏡、CKX41型倒置熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）；CO2培養箱（Thermo公司，德國）；FACSCalibur 流式細胞儀（BD 公司，美國）；分光光度計（NanoDrop公司，美國）；7900 HT型熒光定量RT-PCR儀（ABI公司，美國）；Image Pro-plus 6.0圖像分析軟件（Media Cyberneties公司，美國）；電泳儀、電轉儀（北京六一儀器廠）。
1.2 人表皮干細胞的分離培養及鑒定
取2013年9月－11月在南昌大學第一附屬醫院泌尿外科行包皮環切術的5例患者正常包皮組織標本，年齡18～40歲；患者均知情同意，研究方案經醫院醫學倫理委員會審核批準。采用0.25%胰蛋白酶-EDTA聯合消化法分離表皮與真皮，應用Ⅳ型膠原快速黏附法[7]篩選獲得人表皮干細胞，在由EGF、K-SFM組成的培養基中進行體外培養，之后定期換液，倒置相差顯微鏡觀察細胞分離即刻及培養3 d的生物學特性。細胞生長至90%融合時進行消化傳代，取第2代細胞進行后續實驗。采用HRP標記的山羊抗兔二步法免疫組織化學檢測試劑盒行CK19、ITGB1、CK1、CK10、CK18、CEA免疫細胞化學染色鑒定。
1.3 細胞轉染及相關檢測
1.3.1 實驗分組
取第2代人表皮干細胞，按說明書運用脂質體 Lipofectamine 2000轉染試劑進行轉染。根據人源miRNA-203序列，設計并合成其雙鏈模擬物，實驗組和對照組分別轉染FAM標記的人miRNA-203模擬物（n=5）及FAM標記的對照miRNA（n=5）。轉染6 h后倒置熒光顯微鏡下觀察轉染情況，FACSCalibur 流式細胞儀檢測轉染效率，重復3次。轉染72 h后倒置相差顯微鏡觀察兩組細胞形態變化。
1.3.2 轉染后免疫細胞化學染色觀察
兩組細胞轉染后，于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱孵育72 h，以PV-9000二步法行ITGB1、CK19、CK1、CK10、CK18、CEA免疫細胞化學染色觀察，按試劑盒說明書進行操作。
1.3.3 實時熒光定量RT-PCR檢測
取轉染前及實驗組、對照組轉染72 h后的細胞，采用Trizol法分別提取總RNA，用分光光度計定量，甲醛變性膠電泳質檢總RNA的質量。使用 mirVanaTM miRNA純化試劑盒對總RNA進行純化，純化后重新定量。① miRNA-203的mRNA表達檢測：每個樣本各取2 μg總RNA，采用互補DNA反轉錄試劑盒合成總互補DNA，反轉錄產物采用SYBR Green熒光定量試劑盒和熒光定量RT-PCR儀行PCR。人miRNA-203及內參照U6的反轉錄引物和PCR引物均購自上海吉瑪制藥技術有限公司，引物序列見表 1。PCR反應條件：95℃預變性10 min；95℃變性15 s，60℃退火l min，40個循環。每個樣本重復PCR反應3 次。采用Δ 循環閾值（Ct）法處理結果，計算相對表達量2-ΔΔCt。② P63、ITGB1、CK19、CK1、CK10、CK18、CEA的mRNA表達檢測：每個樣本各取2 μg總RNA，以OligdT為反轉錄引物，應用互補DNA反轉錄試劑盒合成總互補DNA。采用引物設計軟件Primer Premier 5.0設計P63、ITGB1、CK19、CK1、CK10、CK18、CEA及內參照β-actin的PCR引物，引物序列由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列見表 1。反轉錄產物采用SYBR Green熒光定量試劑盒和熒光定量RT-PCR儀行PCR。每個樣本重復PCR反應3次。PCR反應條件及表達量計算方法同① 。
表1
實時熒光定量RT-PCR引物序列及產物大小
Table1.
Real-time fluorescence quantitative RT-PCR primer sequences and product sizes
1.3.4 Western
blot檢測提取轉染前及實驗組和對照組轉染72 h后細胞的總蛋白，用二辛丁酸法進行蛋白定量，100℃變性10 min，各取50 μg行PAGE凝膠電泳，轉移至硝酸纖維濾膜上，封閉。分別加入兔抗人P63一抗、兔抗人ITGB1一抗、兔抗人CK19一抗、兔抗人CK1一抗、兔抗人CK10一抗、兔抗人CK18一抗、兔抗人CEA一抗、兔抗人β-actin一抗（稀釋比均為1∶200），4℃孵育過夜；TTBS液沖洗后加入羊抗兔IgG-HRP二抗（稀釋比為1∶5 000），室溫孵育2 h；TTBS液沖洗后曝片，膠片用掃描儀掃描成像，Image Pro-plus6.0圖像分析軟件進行灰度分析，結果以目的蛋白與β-actin的灰度值比值表示。實驗重復3次。
1.4 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；對miRNA-203的mRNA表達與P63的mRNA和蛋白表達分別行Pearson相關分析；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 人表皮干細胞形態學觀察及鑒定
倒置相差顯微鏡觀察示，快速黏附于Ⅳ型膠原的細胞群細胞呈圓形，分散較均勻，細胞體積較小，細胞核大，核質比大，折光性較強（圖 1 a）；孵育3 d后，細胞貼壁牢固并形成明顯克隆，符合表皮干細胞特征（圖 1 b）。免疫細胞化學染色示，CK19、ITGB1呈棕黃色陽性表達，CK1、CK10、 CK18、CEA呈陰性表達，符合表皮干細胞特征。見圖 2。
圖1
人表皮干細胞形態學觀察（倒置相差顯微鏡×100） ? 細胞分離即刻細胞培養3 d? ?圖 2 人表皮干細胞免疫細胞化學染色觀察（倒置相差顯微鏡×100） ? CK19 ITGB1 CK1 CK10 CK18 CEA? ?圖 3 兩組細胞轉染6 h后倒置熒光顯微鏡觀察（×100） ? 實驗組 ? 對照組? ?圖 4 兩組細胞轉染6 h后流式細胞儀檢測 ? 實驗組 ? 對照組? ?圖 5 兩組細胞轉染72 h后倒置相差顯微鏡觀察形態變化（×100） ? 實驗組 ? 對照組
Figure1.
Morphological observation of human epidermal stem cell (Inverted phase contrast microscope×100) ? Cells at immediate after separated Cells cultured for 3 days? ? Fig. 2 Immunohistochemistry staining of human epidermal stem cells (Inverted phase contrast microscope×100) ? CK19 ITGB1 CK1 CK10 CK18 CEA? ? Fig. 3 Inverted fluorescence microscope observation of cells transfected for 6 hours in 2 groups (×100) ? Experimental group ? Control group? ? Fig. 4 Flow cytometry detection of cells transfected for 6 hours in 2 groups ? Experimental group ? Control group? ? Fig. 5 The morphological changes of cells transfected for 72 hours observed by inverted phase contrast microscope (×100) ? Experimental group ? Control group
2.2 細胞轉染及轉染效率
倒置熒光顯微鏡觀察示，實驗組和對照組均可見多數細胞胞質內有熒光顯示（圖 3）；流式細胞儀檢測示，實驗組和對照組轉染后熒光細胞比例分別為41.58%±0.54%和40.84%±0.67%，兩組比較差異無統計學意義（t=1.937，P=0.089），見圖 4。
倒置相差顯微鏡觀察示，實驗組細胞轉染72 h后，細胞大小不一致，分散不均勻，細胞核小，核質比小，且無明顯克隆形成，符合角質形成細胞特征（圖 5 a）；而對照組細胞轉染72 h后仍有克隆形成，符合表皮干細胞特征，轉染前后無顯著差異（圖 5 b）。
2.3 轉染后免疫細胞化學染色觀察
實驗組細胞轉染72 h后免疫細胞化學染色示CK1、CK10、CK18、CEA呈棕黃色陽性表達，CK19、ITGB1呈陰性表達，符合角質形成細胞及汗腺細胞特征（圖 6）；而對照組與轉染前比較無變化。
圖6
實驗組細胞轉染72 h后免疫細胞化學染色觀察（倒置相差顯微鏡×100） ? CK1 ? CK10 ? CK18 ? CEA ? CK19 ? ITB1? ?圖 7 Western blot法檢測各組細胞各蛋白表達 Mr：相對分子質量 1：實驗組 2：轉染前 3：對照組 ? P63 ? CK19 ? ITGB1 ? CK1 ? CK10 ? CK18 ? CEA
Figure6.
Immunocytochemical staining of cells in experimental group transfected for 72 hours (Inverted phase contrast microscope×100) ? CK1 ? CK10 ? CK18 ? CEA ? CK19 ? ITB1? ? Fig. 7 The protein expression of cells by Western blot analysis Mr: Relative molecular mass 1: Experimental group 2: Before transfection 3: Control group ? P63 ? CK19 ? ITGB1 ? CK1 ? CK10 ? CK18 ? CEA
2.4 實時熒光定量RT-PCR檢測
實驗組細胞轉染72 h后，miRNA-203及CK1、CK10、CK18、CEA mRNA的相對表達量均高于轉染前及對照組，而P63、CK19、ITGB1 mRNA的相對表達量均低于轉染前和對照組，比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。對照組與轉染前比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表 2。
表2
實時熒光定量RT-PCR檢測各組各基因表達（n=5，2.5 Western blot檢測
實驗組細胞轉染72 h后，CK1、CK10、CK18、CEA蛋白相對表達量均高于轉染前及對照組，而P63、CK19、ITGB1蛋白相對表達量均低于轉染前和對照組，比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。對照組與轉染前比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表 3、圖 7。
表3
Western blot檢測各組各蛋白表達（n=5，2.6 miRNA-203和P63表達的相關性分析
轉染前后miRNA-203 mRNA表達量與P63的mRNA和蛋白相對表達量均成負相關，轉染前相關系數分別為-0.91（t=3.862，P=0.042）及-0.96（t=5.971，P=0.009）；轉染后相關系數分別為-0.92（t=4.283，P=0.031）及-0.95（t=5.842，P=0.011）。
3 討論
目前對大面積燒傷患者皮膚缺損的修復主要為創面修復，對皮膚功能重建問題仍未解決[8]。患者存活后常由于汗腺缺失，體溫調節功能嚴重受損，生活質量顯著降低[9]。因此，如何實現皮膚附件的功能修復與重建是燒傷創面修復與組織再生研究的熱點及難點[10]。干細胞技術的建立和發展為解決這一難題提供了新的思路，通過干細胞移植誘導再生汗腺是其中的重要方法之一[11-12]。胚胎學上，表皮干細胞與汗腺在發育學上有共同的起源，均起源于外胚層上皮，外胚層上皮細胞通過分裂增殖并內陷在表皮嵴形成上皮細胞索，細胞索的近端發育成導管，末端發育為分泌部，構成汗腺[13]。因此有可能 利用 表皮 干細胞向汗腺細胞定向分化再生汗腺。
miRNA-203是長19～22 nt非編碼單鏈RNA，能與靶mRNA3’UTR區結合在轉錄后水平抑制蛋白質的合成，達到負性調控基因表達的目的[14]。miRNA-203是首個發現在表皮及毛囊表達最豐富的miRNA。若miRNA-203 生物合成所需的Dicer酶或DGCR8基因被敲除，以致miRNA-203合成缺失，可導致皮膚屏障功能缺陷、毛囊發育不良、表皮基底層細胞過度增殖[15-16]，表明miRNA-203對皮膚發育和功能維持具有重要作用。本研究根據人源miRNA-203序列，設計并合成其雙鏈模擬物，利用脂質體轉染將miRNA-203模擬物分子導入人離體表皮干細胞中，通過倒置熒光顯微鏡下觀察、流式細胞儀檢測及轉染前后miRNA-203的實時熒光定量RT-PCR測定均表明轉染成功。對轉染前后的細胞于倒置相差顯微鏡下觀察形態變化，通過免疫細胞化學染色、實時熒光定量RT-PCR及Western blot技術檢測轉染前后細胞ITGB1、CK19、CK1、CK10、CK18、CEA的變化，發現轉染后的細胞CK1、CK10、CK18、CEA高表達，而ITGB1、CK19低表達。已有研究證實ITGB1、CK19表達水平的高低與細胞克隆形成能力即細胞增殖力成正相關，是表皮干細胞的特征蛋白；CK1、CK10是成熟表皮即高分化的角質形成細胞的特征蛋白[17-18]；而CEA、CK18常被作為汗腺上皮標記物[19]。本實驗結果表明，miRNA-203能在體外誘導人表皮干細胞向汗腺上皮細胞及角質形成細胞分化。
同時，本研究發現轉染后表皮干細胞P63mRNA及蛋白的表達較轉染前顯著降低，且與miRNA-203 mRNA的相對表達量成負相關，即miRNA-203與P63兩者呈現相互排斥的表達模式，提示在表皮中P63可能是miRNA-203的靶基因。P63基因作為一種轉錄因子，與細胞周期、 細胞增殖和發育及細胞凋亡的關系密切[20]，在上皮組織尤其是表皮的形態發生中起著獨特作用[21]。已有研究證實在胚胎發育階段，P63能決定外胚層的某些細胞向上皮干細胞方向分化，且是最早啟動外胚層層化的分化標志物和外胚層感應復層化指令的分子開關。在表皮成熟階段，P63通過促進細胞周期中的G1/S期轉化，起著維持表皮及其他復層上皮組織中干細胞增殖潛能的作用[22]。而P63表達下調是表皮干細胞進行分化的必要條件[23]。miRBase數據庫顯示成熟的miRNA-203基因序列為5’-GUGAAAUGUUUAGGACCACUA-G-3’，而P63的mRNA3’非翻譯區基因序列為5’-GAGAAUGAGUCCUUGAUUUCAAA-3’，生物學信息表明，miRNA-203基因序列與P63的mRNA3’非翻譯區匹配，P63基因可能是miRNA-203的靶基因，miRNA-203通過P63的3’非翻譯區靶位點介導直接參與調控P63。因此，結合本實驗結果，提示miRNA-203誘導表皮干細胞向汗腺細胞分化的一個重要機制可能是其通過轉錄后水平抑制靶基因P63的表達，限制表皮干細胞增殖潛能，從而促進表皮干細胞分化為汗腺細胞。
綜上述，本研究利用miRNA-203誘導表皮干細胞表型轉化尤其是向汗腺上皮細胞分化，為構建具有生理功能的人工皮膚提供了新的思路和重要的實驗基礎。若能在體內通過上調miRNA-203的表達優化創面表皮及附屬器的形成，對實現創面從解剖修復到功能修復具有重要意義。但如何成功構建出功能性組織工程皮膚，其中涉及的機制及信號通路等還有待進一步研究。
