引用本文： 陳春媛, 牛鑫, 汪泱. 尿液源性干細胞的研究進展. 中國修復重建外科雜志, 2015, 29(3): 372-376. doi: 10.7507/1002-1892.20150078 復制
成體干細胞是指存在于已分化組織中的未分化細胞，能進行自我更新和向特定細胞類型分化，在一定條件下甚至可跨胚層分化。MSCs是成體干細胞家族的重要成員，是一類具有自我更新和多向分化潛能的細胞群體。目前MSCs的應用非常廣泛，尤其是BMSCs，已有研究者成功將BMSCs定向誘導分化為骨細胞、軟骨細胞和神經細胞等[1-3]。但BMSCs來源有限，且取材時會對機體造成一定創傷。尿液源性干細胞（urine-derived stem cells，USCs）是從尿液中分離培養出的具有良好增殖活性和多向分化能力的成體干細胞，研究表明其具有MSCs的各種生物學特性[4]。因USCs具有來源不受限、制備過程簡便、安全無創和成本低等特點，故其成為了細胞替代治療和組織工程研究中更為理想的種子細胞來源。現階段，國內外對其研究尚處于初期階段。本文主要就目前USCs的分離培養、生物學特性及功能方面的研究進展進行綜述。
1 USCs的分離培養
尿液中存活的細胞可分為：① 終末分化細胞，占99%以上；② 具有一定增殖能力的未完全成熟細胞，占0.1%左右；③ 未分化的前體細胞，即USCs，約占0.2%[5]。終末分化細胞屬于不貼壁細胞，在更新培養基時可被除去。未完全成熟細胞和USCs均為貼壁細胞，但前者在體外培養一定時間后數量逐漸減少，經傳代培養后不再增殖；而USCs經多次傳代培養仍保持旺盛的增殖能力[4-5]。基于USCs的貼壁特性和較強增殖活性，Zhang等[5]首次采用富含EGF的角質細胞無血清培養基（keratinocyte serum free medium，KSFM）和胚胎纖維母細胞培養基（embryonic fibroblast medium，EFM）的等比例混合液從人尿液中分離培養出USCs。汪泱等[6]也采用自配USCs培養基（LMM101培養基）成功建立了人USCs的提取及擴增培養方法，并獲得了發明專利。貼壁法篩選USCs的過程大致如下：取清潔中段尿；將尿液離心，洗滌細胞沉淀；細胞計數和活性檢測；然后將細胞以適宜密度接種于培養皿，采用相應的USCs培養基培養；通過更新培養基去除絕大多數不貼壁細胞，保留余下呈單個生長的貼壁細胞繼續培養；待細胞達到70%～80%融合時，再進行傳代培養；經傳代培養后仍保持很強增殖活性的細胞即為USCs。
研究表明[5]，每100毫升尿液可約分離得到2.5個USCs克隆，每個USCs克隆在培養6～7周后即可擴增至1.0×108個細胞。因而只要對600 mL左右尿液標本進行分離培養，即可收獲足量細胞用于膀胱（至少需1.4×109個細胞[7]）等器官的再生研究。在分離培養過程中，有很多因素會影響USCs的得率，如尿液標本供者的年齡和身體狀態、尿液存儲時間、尿液獲取方式和取材位置等[5, 8-10]。一般來說，供者年齡在13～40歲、標本新鮮程度高、來自導管引流或上尿路等情況下，USCs的得率明顯增高[5, 8-10]。
2 USCs的生物學特點
2.1 USCs的生長特性
2008年，Zhang等[5]從尿液中分離培養出具有較強增殖活性、高表達干細胞標志物和具有多向分化潛能的一類細胞，將其命名為尿液前體細胞（urine progenitor cells，UPCs）。由于UPCs來自尿液，并具有干細胞各種特性，研究者們又將其稱之為USCs。USCs具有貼壁性質，呈克隆狀生長；其增殖能力很強，經傳代培養10代甚至20代以上仍能保持較為均一的形態。
值得一提的是，早在1972年Sutherland等[11]將新生兒尿液中的脫落細胞用于體外培養，并成功培養出具有體外生存能力的細胞。后來研究者們發現，除了新生兒，從正常人和各種患有泌尿系統疾病的患者尿液中均可培養出有增殖活性的細胞[9-10, 12-15]。這些細胞呈克隆性生長，并呈現出不同形態。其主要包括兩種類型：Ⅰ型細胞克隆輪廓不規則，細胞呈“紡錘形”，分布相對分散；Ⅱ型細胞克隆邊緣平滑，細胞呈“鵝卵石”樣或“紡錘形”，細胞體積偏小，排列緊密。Ⅰ型細胞可傳代6次以上，而Ⅱ型細胞經傳代培養后不能繼續生長。從其生長特點和增殖活性來看，Ⅰ型細胞很可能就是Zhang等[5]所報道的USCs。只是當時研究者們并未鑒定Ⅰ型細胞的干細胞標志物和檢測其多向分化能力，因而也未提出USCs這一概念。
再者，目前研究報道的USCs在克隆形態、細胞體積、形狀和排列上有一定差異。如Zhang等[5]所培養的USCs具有克隆邊緣較規則、細胞排列緊密、細胞體積較小和形如米粒等特點；而Guan等[16]所培養的USCs與Ⅰ型細胞的形態特點更為接近，即其克隆邊緣不規則，細胞排列分散，細胞體形相對細長，呈“紡錘形”。引起該差異的原因尚不清楚，可能與所用培養基不同有關。
2.2 USCs的表面分子標志物
研究表明[4-5]，早期USCs均高表達干細胞標志物，如c-kit、SSEA4、TRA1-60、TRA1-81、Sox-2和Oct3/4等。但隨著傳代次數增加，高表達這些干細胞標志物的USCs數目逐漸下降[4-5]。再者，USCs還穩定表達MSCs特異表面分子（如CD29、CD44、 CD54、CD73和CD90等），而不表達多數造血干細胞標志物（如CD133、CD34和CD45等）和內皮細胞標志物（如血小板內皮細胞黏附分子、血管性血友病因子等），提示USCs并非造血干細胞或內皮前體細胞，而為MSCs的可能性更大[4-5]。尿道上皮基底細胞是MSCs的一種。起初Zhang等[5]發現多數USCs表達尿道上皮特異性分子uroplakinⅠa和細胞角蛋白7（cytokeratin 7，CK7）等，故推測這些USCs可能是尿道上皮基底細胞。但該課題組進一步在接受了腎移植（移植的男性腎臟）的女性患者尿液中分離培養得到USCs，發現其存在Y染色體，并高表達腎系標志物（包括CD224、CD13、NR3C2、Pax2和Pax8）以及腎臟層上皮細胞和壁層上皮細胞特異性標志物（包括CD146、synaptopodin和podocin），但不表達腎小管上皮細胞、輸尿管上皮細胞和尿道上皮細胞標志物[4]。提示USCs可能是來源于腎臟腎小球的臟層-壁層上皮細胞交界處，而非尿道上皮基底細胞。然而，考慮到該課題組檢測的USCs克隆數量有限以及可能存在個體差異，USCs是否僅來源于腎小球仍有待探究。
2.3 USCs的多向分化潛能
在含有特定生長因子的培養基誘導下或通過特定基因轉染，USCs可向三胚層各類細胞分化，如成骨細胞、脂肪細胞、平滑肌細胞、骨骼肌細胞、尿道上皮、內皮細胞和神經細胞等；這些誘導得來的分化細胞無論是在形態和表面分子標志物方面，還是在生物學功能方面，均與機體固有分化細胞表現出高度類似性[4-5, 7-10, 16-17]。例如，采用含有TGF-β1、PDGF-BB和FBS的H-DMEM和EFM的混合培養基培養USCs，可誘導其向平滑肌細胞（smooth muscle cells，SMCs）分化[4]。這些USCs來源的SMCs具有與機體SMCs類似的“長梭形”形態，并高表達肌細胞特異性表面分子，包括desmin、myosin、smoothelin和α平滑肌肌動蛋白[4]。體外血清鈣離子的刺激可引起這些USCs源性SMCs的收縮反應，表明其具有與機體SMCs相似的收縮功能。此外，采用含有VEGF的內皮細胞基礎培養基2培養USCs[4]，或經病毒轉染使USCs過表達VEGF[18]，均可誘導USCs向血管內皮細胞分化。這些分化細胞高表達血管性血友病因子和CD31等內皮細胞特異性標志物。研究者將這些USCs來源的內皮細胞接種在Matrigel上，一段時間后，這些細胞可以同機體內皮細胞一樣在體外自行形成管道狀結構。再者，采用含有一定量血清和EGF的KSFM/EFM混合培養基培養USCs，可將USCs定向誘導為尿道上皮細胞（urothelial cells，UCs）[4]。這些細胞與機體UCs十分相似，具有“鵝卵石”樣形態，并表達各種尿道上皮特異性分子，如uroplakinⅠa、CK7和AE1/AE3等。研究者經掃描電鏡觀察發現，這些USCs源性UCs彼此間還具有與體內UCs超微結構類似的緊密連接。通過屏障功能實驗進一步探究這些上皮細胞的功能，結果顯示，相對于未誘導組（即USCs），誘導組（即USCs來源的UCs）對右旋糖酐的滲漏減少了60%，表明USCs源性UCs具備良好的屏障功能。Guan等[16]采用含胰島素-轉鐵蛋白-亞硒酸鹽、EGF、bFGF等成分的DMEM/F12培養基成功將USCs誘導分化為神經細胞。這些USCs源性神經細胞呈典型的雙極神經樣細胞狀形態，穩定表達神經細胞相關標志物。以上研究表明，采用適當方法可將USCs誘導分化為各種類型的功能性細胞，這為組織工程研究提供了豐富的種子細胞來源。
3 USCs與組織工程研究
組織損傷或缺損可導致相應器官功能障礙，甚至功能衰竭。組織工程技術是近年來興起的一種修復重建缺損組織的新手段[19]。在組織工程研究中，細胞是其核心部分。USCs具有很強的增殖活性和多向分化能力，且具有來源廣泛、制備簡便和安全無創等優點，是組織工程研究理想的種子細胞[20-23]。目前已有研究報道USCs對尿路、骨、腦和皮膚等多種器官或組織的損傷具有修復重建作用。
3.1 USCs與膀胱重建
膀胱缺損的治療是臨床泌尿外科面臨的難題之一。外傷、腫瘤、結核、神經源性膀胱以及一些先天性膀胱疾病均可導致膀胱缺損，需修復重建。小腸黏膜下層（small intestinal submucosa，SIS）是一種源于小腸的脫細胞基質材料，保留有天然的膠原纖維網狀結構，并含有多種生長因子[19, 24]，有利于指引周圍細胞增殖分化[25]。有研究將UCs和SMCs種植至SIS支架上，在體外成功構建出類似復層膀胱壁的結構[26]。2011年，Wu等[20]將USCs誘導分化為UCs和SMCs，并將其種植至SIS支架上，經體外靜態和動態培養各1周后植入裸鼠體內。組織學檢測結果示，這些USCs源性分化細胞不僅表達UCs和SMCs特異性標志物，而且分布規律，接近固有UCs和SMCs形成的膀胱壁結構。細菌纖維素（bacterial cellulose，BC）是另外一種具有優異綜合性能的天然高分子材料，具有優良的生物相容性和可靠的機械性能。采用相同方法，Bodin等[27]將USCs源性UCs和SMCs種植至BC上，培養一段時間后植入裸鼠體內。結果顯示，這些USCs來源的UCs和SMCs在BC所提供的三維空間內亦可形成與機體正常膀胱壁相似的結構。以上研究表明，結合使用適宜載體，USCs可作為良好種子細胞來源用于膀胱重建。
3.2 USCs與尿道重建
壓力性尿失禁（stress urinary incontinence，SUI）是指打噴嚏、咳嗽、大笑等腹壓增高時出現不自主的尿液自尿道外口滲漏[28]。其病因主要為盆腔結締組織、筋膜和韌帶損傷，尿道括約肌缺失或功能減退以及尿道外括約肌周圍的神經退化[29]。促進肌肉和血管再生、加強神經功能恢復是改善SUI的關鍵。VEGF是血管生成過程中一個重要的促進因子，并在肌細胞分化[30]、神經再生[31-32]等過程中扮演重要角色。研究者[18, 21]將VEGF基因通過腺病毒轉染方式轉入USCs，使其能夠持續分泌VEGF；然后采用Ⅰ型膠原或水凝膠包裹轉基因USCs，經皮下注射至裸鼠體內。結果顯示，植入能高表達VEGF的USCs后，可明顯促進移植區的肌性分化、血管新生和神經再生。2013年，Liu等[22]將USCs、包裹有特定生長因子（包括成肌、成血管和成神經3種類型的生長因子）的海藻酸鹽微球以及Ⅰ型膠原的混合物皮下注射至裸鼠體內。移植后4周發現，相對于只注射含有生長因子的微球組，同時注射USCs和生長因子可明顯促進移植部位的肌細胞分化和細胞增殖，新生血管密度、內皮細胞和神經纖維數目顯著增加。示蹤結果表明，在這些增加的細胞中，大部分肌細胞和內皮細胞均由USCs分化而來，而神經細胞源于小鼠自身細胞分化。這些研究結果表明，USCs可通過自身分化和刺激移植部位原有細胞的增殖來調控機體的生肌、生血管反應和神經支配，從而促進組織再生。
3.3 USCs與骨修復重建
2013年，Bharadwaj等[4]將BMP-2和BMP-9基因轉入USCs，將USCs定向誘導為成骨細胞。這些USCs源性成骨細胞能分泌ALP，其細胞外出現鈣鹽沉積。研究者將這些分化細胞移植至裸鼠皮下，發現移植部位有包塊形成。組織學染色結果顯示移植部位有活躍的成骨過程，可見大量成熟的骨基質和骨細胞。該研究結果初步證明USCs具備潛在的骨缺損修復能力。另外，除了向骨細胞分化，USCs還能在特定的軟骨誘導培養基中形成軟骨細胞[4, 16]。同時，其細胞外基質還可通過激活Wnt11介導的信號通路顯著促進老化的BMSCs向軟骨細胞分化[23]，因而USCs還具有修復軟骨的潛質。
3.4 USCs與腦損傷修復重建
USCs還具有修復腦損傷的潛能[16]。Guan等[16]參考Hou等[33]的方法構建了大鼠腦損傷模型，將采用水凝膠包裹的USCs移植入損傷區，全程采用綠色熒光蛋白對其進行示蹤。1周后植入的細胞不僅能在移植部位存活，還具有良好的遷移能力。這些細胞穩定表達神經相關標志物，包括巢蛋白、膠質纖維酸性蛋白、β微管蛋白Ⅲ等，表明在腦損傷微環境下，USCs能夠向神經細胞分化。提示USCs可能用于治療中樞神經系統疾病。
3.5 USCs與皮膚修復重建
通過構建組織工程皮膚來修復重建各種皮膚創面是解決臨床皮源缺乏的根本途徑。已有研究發現USCs可作為良好的種子細胞應用于皮膚損傷修復重建[34]。2014年，Fu等[34]將USCs復合聚已酸內酯/明膠納米纖維支架用于修復兔受損全層皮膚，發現USCs復合支架可顯著促進皮膚創面收縮，并加速缺損區角質細胞再上皮化、膠原合成和血管再生；ELISA檢測結果顯示，USCs的培養上清液中含有大量促血管生成因子（包括VEGF和TGF-β1）；研究者將該上清液作用于內皮細胞，發現內皮細胞的增殖、遷移和成管能力顯著增強。提示USCs可通過旁分泌各種生長因子促進皮膚創面的修復重建。
4 小結
USCs是組織工程研究領域的新熱點，具有十分廣闊的應用前景。但目前相關研究尚處于初期階段，還存在一些問題需要進一步探究和解決。如尿液標本供者的身體狀態、尿液獲取方式以及USCs分離培養的方法等因素存在一定差異的情況下，所得USCs在增殖特性、標志物表達以及分化能力方面是否也有明顯不同；USCs的來源尚待進一步明確；對于USCs誘導分化而來的細胞，目前研究多停留在形態觀察和特異性標志物表達的檢測上，而關于這些分化細胞能否替代機體損傷的細胞發揮相應功能的研究報道相對較少。這些問題都亟需體內外實驗以及臨床研究予以解釋和證實。
成體干細胞是指存在于已分化組織中的未分化細胞，能進行自我更新和向特定細胞類型分化，在一定條件下甚至可跨胚層分化。MSCs是成體干細胞家族的重要成員，是一類具有自我更新和多向分化潛能的細胞群體。目前MSCs的應用非常廣泛，尤其是BMSCs，已有研究者成功將BMSCs定向誘導分化為骨細胞、軟骨細胞和神經細胞等[1-3]。但BMSCs來源有限，且取材時會對機體造成一定創傷。尿液源性干細胞（urine-derived stem cells，USCs）是從尿液中分離培養出的具有良好增殖活性和多向分化能力的成體干細胞，研究表明其具有MSCs的各種生物學特性[4]。因USCs具有來源不受限、制備過程簡便、安全無創和成本低等特點，故其成為了細胞替代治療和組織工程研究中更為理想的種子細胞來源。現階段，國內外對其研究尚處于初期階段。本文主要就目前USCs的分離培養、生物學特性及功能方面的研究進展進行綜述。
1 USCs的分離培養
尿液中存活的細胞可分為：① 終末分化細胞，占99%以上；② 具有一定增殖能力的未完全成熟細胞，占0.1%左右；③ 未分化的前體細胞，即USCs，約占0.2%[5]。終末分化細胞屬于不貼壁細胞，在更新培養基時可被除去。未完全成熟細胞和USCs均為貼壁細胞，但前者在體外培養一定時間后數量逐漸減少，經傳代培養后不再增殖；而USCs經多次傳代培養仍保持旺盛的增殖能力[4-5]。基于USCs的貼壁特性和較強增殖活性，Zhang等[5]首次采用富含EGF的角質細胞無血清培養基（keratinocyte serum free medium，KSFM）和胚胎纖維母細胞培養基（embryonic fibroblast medium，EFM）的等比例混合液從人尿液中分離培養出USCs。汪泱等[6]也采用自配USCs培養基（LMM101培養基）成功建立了人USCs的提取及擴增培養方法，并獲得了發明專利。貼壁法篩選USCs的過程大致如下：取清潔中段尿；將尿液離心，洗滌細胞沉淀；細胞計數和活性檢測；然后將細胞以適宜密度接種于培養皿，采用相應的USCs培養基培養；通過更新培養基去除絕大多數不貼壁細胞，保留余下呈單個生長的貼壁細胞繼續培養；待細胞達到70%～80%融合時，再進行傳代培養；經傳代培養后仍保持很強增殖活性的細胞即為USCs。
研究表明[5]，每100毫升尿液可約分離得到2.5個USCs克隆，每個USCs克隆在培養6～7周后即可擴增至1.0×108個細胞。因而只要對600 mL左右尿液標本進行分離培養，即可收獲足量細胞用于膀胱（至少需1.4×109個細胞[7]）等器官的再生研究。在分離培養過程中，有很多因素會影響USCs的得率，如尿液標本供者的年齡和身體狀態、尿液存儲時間、尿液獲取方式和取材位置等[5, 8-10]。一般來說，供者年齡在13～40歲、標本新鮮程度高、來自導管引流或上尿路等情況下，USCs的得率明顯增高[5, 8-10]。
2 USCs的生物學特點
2.1 USCs的生長特性
2008年，Zhang等[5]從尿液中分離培養出具有較強增殖活性、高表達干細胞標志物和具有多向分化潛能的一類細胞，將其命名為尿液前體細胞（urine progenitor cells，UPCs）。由于UPCs來自尿液，并具有干細胞各種特性，研究者們又將其稱之為USCs。USCs具有貼壁性質，呈克隆狀生長；其增殖能力很強，經傳代培養10代甚至20代以上仍能保持較為均一的形態。
值得一提的是，早在1972年Sutherland等[11]將新生兒尿液中的脫落細胞用于體外培養，并成功培養出具有體外生存能力的細胞。后來研究者們發現，除了新生兒，從正常人和各種患有泌尿系統疾病的患者尿液中均可培養出有增殖活性的細胞[9-10, 12-15]。這些細胞呈克隆性生長，并呈現出不同形態。其主要包括兩種類型：Ⅰ型細胞克隆輪廓不規則，細胞呈“紡錘形”，分布相對分散；Ⅱ型細胞克隆邊緣平滑，細胞呈“鵝卵石”樣或“紡錘形”，細胞體積偏小，排列緊密。Ⅰ型細胞可傳代6次以上，而Ⅱ型細胞經傳代培養后不能繼續生長。從其生長特點和增殖活性來看，Ⅰ型細胞很可能就是Zhang等[5]所報道的USCs。只是當時研究者們并未鑒定Ⅰ型細胞的干細胞標志物和檢測其多向分化能力，因而也未提出USCs這一概念。
再者，目前研究報道的USCs在克隆形態、細胞體積、形狀和排列上有一定差異。如Zhang等[5]所培養的USCs具有克隆邊緣較規則、細胞排列緊密、細胞體積較小和形如米粒等特點；而Guan等[16]所培養的USCs與Ⅰ型細胞的形態特點更為接近，即其克隆邊緣不規則，細胞排列分散，細胞體形相對細長，呈“紡錘形”。引起該差異的原因尚不清楚，可能與所用培養基不同有關。
2.2 USCs的表面分子標志物
研究表明[4-5]，早期USCs均高表達干細胞標志物，如c-kit、SSEA4、TRA1-60、TRA1-81、Sox-2和Oct3/4等。但隨著傳代次數增加，高表達這些干細胞標志物的USCs數目逐漸下降[4-5]。再者，USCs還穩定表達MSCs特異表面分子（如CD29、CD44、 CD54、CD73和CD90等），而不表達多數造血干細胞標志物（如CD133、CD34和CD45等）和內皮細胞標志物（如血小板內皮細胞黏附分子、血管性血友病因子等），提示USCs并非造血干細胞或內皮前體細胞，而為MSCs的可能性更大[4-5]。尿道上皮基底細胞是MSCs的一種。起初Zhang等[5]發現多數USCs表達尿道上皮特異性分子uroplakinⅠa和細胞角蛋白7（cytokeratin 7，CK7）等，故推測這些USCs可能是尿道上皮基底細胞。但該課題組進一步在接受了腎移植（移植的男性腎臟）的女性患者尿液中分離培養得到USCs，發現其存在Y染色體，并高表達腎系標志物（包括CD224、CD13、NR3C2、Pax2和Pax8）以及腎臟層上皮細胞和壁層上皮細胞特異性標志物（包括CD146、synaptopodin和podocin），但不表達腎小管上皮細胞、輸尿管上皮細胞和尿道上皮細胞標志物[4]。提示USCs可能是來源于腎臟腎小球的臟層-壁層上皮細胞交界處，而非尿道上皮基底細胞。然而，考慮到該課題組檢測的USCs克隆數量有限以及可能存在個體差異，USCs是否僅來源于腎小球仍有待探究。
2.3 USCs的多向分化潛能
在含有特定生長因子的培養基誘導下或通過特定基因轉染，USCs可向三胚層各類細胞分化，如成骨細胞、脂肪細胞、平滑肌細胞、骨骼肌細胞、尿道上皮、內皮細胞和神經細胞等；這些誘導得來的分化細胞無論是在形態和表面分子標志物方面，還是在生物學功能方面，均與機體固有分化細胞表現出高度類似性[4-5, 7-10, 16-17]。例如，采用含有TGF-β1、PDGF-BB和FBS的H-DMEM和EFM的混合培養基培養USCs，可誘導其向平滑肌細胞（smooth muscle cells，SMCs）分化[4]。這些USCs來源的SMCs具有與機體SMCs類似的“長梭形”形態，并高表達肌細胞特異性表面分子，包括desmin、myosin、smoothelin和α平滑肌肌動蛋白[4]。體外血清鈣離子的刺激可引起這些USCs源性SMCs的收縮反應，表明其具有與機體SMCs相似的收縮功能。此外，采用含有VEGF的內皮細胞基礎培養基2培養USCs[4]，或經病毒轉染使USCs過表達VEGF[18]，均可誘導USCs向血管內皮細胞分化。這些分化細胞高表達血管性血友病因子和CD31等內皮細胞特異性標志物。研究者將這些USCs來源的內皮細胞接種在Matrigel上，一段時間后，這些細胞可以同機體內皮細胞一樣在體外自行形成管道狀結構。再者，采用含有一定量血清和EGF的KSFM/EFM混合培養基培養USCs，可將USCs定向誘導為尿道上皮細胞（urothelial cells，UCs）[4]。這些細胞與機體UCs十分相似，具有“鵝卵石”樣形態，并表達各種尿道上皮特異性分子，如uroplakinⅠa、CK7和AE1/AE3等。研究者經掃描電鏡觀察發現，這些USCs源性UCs彼此間還具有與體內UCs超微結構類似的緊密連接。通過屏障功能實驗進一步探究這些上皮細胞的功能，結果顯示，相對于未誘導組（即USCs），誘導組（即USCs來源的UCs）對右旋糖酐的滲漏減少了60%，表明USCs源性UCs具備良好的屏障功能。Guan等[16]采用含胰島素-轉鐵蛋白-亞硒酸鹽、EGF、bFGF等成分的DMEM/F12培養基成功將USCs誘導分化為神經細胞。這些USCs源性神經細胞呈典型的雙極神經樣細胞狀形態，穩定表達神經細胞相關標志物。以上研究表明，采用適當方法可將USCs誘導分化為各種類型的功能性細胞，這為組織工程研究提供了豐富的種子細胞來源。
3 USCs與組織工程研究
組織損傷或缺損可導致相應器官功能障礙，甚至功能衰竭。組織工程技術是近年來興起的一種修復重建缺損組織的新手段[19]。在組織工程研究中，細胞是其核心部分。USCs具有很強的增殖活性和多向分化能力，且具有來源廣泛、制備簡便和安全無創等優點，是組織工程研究理想的種子細胞[20-23]。目前已有研究報道USCs對尿路、骨、腦和皮膚等多種器官或組織的損傷具有修復重建作用。
3.1 USCs與膀胱重建
膀胱缺損的治療是臨床泌尿外科面臨的難題之一。外傷、腫瘤、結核、神經源性膀胱以及一些先天性膀胱疾病均可導致膀胱缺損，需修復重建。小腸黏膜下層（small intestinal submucosa，SIS）是一種源于小腸的脫細胞基質材料，保留有天然的膠原纖維網狀結構，并含有多種生長因子[19, 24]，有利于指引周圍細胞增殖分化[25]。有研究將UCs和SMCs種植至SIS支架上，在體外成功構建出類似復層膀胱壁的結構[26]。2011年，Wu等[20]將USCs誘導分化為UCs和SMCs，并將其種植至SIS支架上，經體外靜態和動態培養各1周后植入裸鼠體內。組織學檢測結果示，這些USCs源性分化細胞不僅表達UCs和SMCs特異性標志物，而且分布規律，接近固有UCs和SMCs形成的膀胱壁結構。細菌纖維素（bacterial cellulose，BC）是另外一種具有優異綜合性能的天然高分子材料，具有優良的生物相容性和可靠的機械性能。采用相同方法，Bodin等[27]將USCs源性UCs和SMCs種植至BC上，培養一段時間后植入裸鼠體內。結果顯示，這些USCs來源的UCs和SMCs在BC所提供的三維空間內亦可形成與機體正常膀胱壁相似的結構。以上研究表明，結合使用適宜載體，USCs可作為良好種子細胞來源用于膀胱重建。
3.2 USCs與尿道重建
壓力性尿失禁（stress urinary incontinence，SUI）是指打噴嚏、咳嗽、大笑等腹壓增高時出現不自主的尿液自尿道外口滲漏[28]。其病因主要為盆腔結締組織、筋膜和韌帶損傷，尿道括約肌缺失或功能減退以及尿道外括約肌周圍的神經退化[29]。促進肌肉和血管再生、加強神經功能恢復是改善SUI的關鍵。VEGF是血管生成過程中一個重要的促進因子，并在肌細胞分化[30]、神經再生[31-32]等過程中扮演重要角色。研究者[18, 21]將VEGF基因通過腺病毒轉染方式轉入USCs，使其能夠持續分泌VEGF；然后采用Ⅰ型膠原或水凝膠包裹轉基因USCs，經皮下注射至裸鼠體內。結果顯示，植入能高表達VEGF的USCs后，可明顯促進移植區的肌性分化、血管新生和神經再生。2013年，Liu等[22]將USCs、包裹有特定生長因子（包括成肌、成血管和成神經3種類型的生長因子）的海藻酸鹽微球以及Ⅰ型膠原的混合物皮下注射至裸鼠體內。移植后4周發現，相對于只注射含有生長因子的微球組，同時注射USCs和生長因子可明顯促進移植部位的肌細胞分化和細胞增殖，新生血管密度、內皮細胞和神經纖維數目顯著增加。示蹤結果表明，在這些增加的細胞中，大部分肌細胞和內皮細胞均由USCs分化而來，而神經細胞源于小鼠自身細胞分化。這些研究結果表明，USCs可通過自身分化和刺激移植部位原有細胞的增殖來調控機體的生肌、生血管反應和神經支配，從而促進組織再生。
3.3 USCs與骨修復重建
2013年，Bharadwaj等[4]將BMP-2和BMP-9基因轉入USCs，將USCs定向誘導為成骨細胞。這些USCs源性成骨細胞能分泌ALP，其細胞外出現鈣鹽沉積。研究者將這些分化細胞移植至裸鼠皮下，發現移植部位有包塊形成。組織學染色結果顯示移植部位有活躍的成骨過程，可見大量成熟的骨基質和骨細胞。該研究結果初步證明USCs具備潛在的骨缺損修復能力。另外，除了向骨細胞分化，USCs還能在特定的軟骨誘導培養基中形成軟骨細胞[4, 16]。同時，其細胞外基質還可通過激活Wnt11介導的信號通路顯著促進老化的BMSCs向軟骨細胞分化[23]，因而USCs還具有修復軟骨的潛質。
3.4 USCs與腦損傷修復重建
USCs還具有修復腦損傷的潛能[16]。Guan等[16]參考Hou等[33]的方法構建了大鼠腦損傷模型，將采用水凝膠包裹的USCs移植入損傷區，全程采用綠色熒光蛋白對其進行示蹤。1周后植入的細胞不僅能在移植部位存活，還具有良好的遷移能力。這些細胞穩定表達神經相關標志物，包括巢蛋白、膠質纖維酸性蛋白、β微管蛋白Ⅲ等，表明在腦損傷微環境下，USCs能夠向神經細胞分化。提示USCs可能用于治療中樞神經系統疾病。
3.5 USCs與皮膚修復重建
通過構建組織工程皮膚來修復重建各種皮膚創面是解決臨床皮源缺乏的根本途徑。已有研究發現USCs可作為良好的種子細胞應用于皮膚損傷修復重建[34]。2014年，Fu等[34]將USCs復合聚已酸內酯/明膠納米纖維支架用于修復兔受損全層皮膚，發現USCs復合支架可顯著促進皮膚創面收縮，并加速缺損區角質細胞再上皮化、膠原合成和血管再生；ELISA檢測結果顯示，USCs的培養上清液中含有大量促血管生成因子（包括VEGF和TGF-β1）；研究者將該上清液作用于內皮細胞，發現內皮細胞的增殖、遷移和成管能力顯著增強。提示USCs可通過旁分泌各種生長因子促進皮膚創面的修復重建。
4 小結
USCs是組織工程研究領域的新熱點，具有十分廣闊的應用前景。但目前相關研究尚處于初期階段，還存在一些問題需要進一步探究和解決。如尿液標本供者的身體狀態、尿液獲取方式以及USCs分離培養的方法等因素存在一定差異的情況下，所得USCs在增殖特性、標志物表達以及分化能力方面是否也有明顯不同；USCs的來源尚待進一步明確；對于USCs誘導分化而來的細胞，目前研究多停留在形態觀察和特異性標志物表達的檢測上，而關于這些分化細胞能否替代機體損傷的細胞發揮相應功能的研究報道相對較少。這些問題都亟需體內外實驗以及臨床研究予以解釋和證實。