細胞膜片技術是通過物理的方法將擴增融合的細胞從培養皿底壁分離,獲得膜片狀細胞結構的一種技術。與傳統胰酶消化收集細胞的方法相比,運用該技術收集到的細胞保留了體外培養過程中分泌的胞外基質、建立的細胞-基質連接以及細胞間連接等結構。本文綜述了細胞膜片技術在構建包括軟組織(角膜、黏膜、心肌、血管、胰島、肝組織、膀胱、皮膚)和硬組織(骨、軟骨、牙根)等組織再生領域的相關應用,以期為組織工程和再生醫學的發展提供新思路,并提出今后可在提高該技術的操作性及構建大塊組織可行性方面進行深入研究。
引用本文： 馬東洋, 任利玲, 毛天球. 細胞膜片技術在組織工程和再生醫學領域的應用. 生物醫學工程學雜志, 2014, 31(5): 1164-1167. doi: 10.7507/1001-5515.20140220 復制
引言
近年來隨著再生醫學的迅速發展，基于組織工程學原理構建的工程化組織為組織器官的修復與再生開辟了新的途徑。組織工程包含了種子細胞、生長因子、生物支架材料以及組織構建等要素，模擬了組織再生的過程。傳統組織工程的構建方法主要是將種子細胞與外源性支架材料復合形成具有生物活性的組織替代物，盡管現已取得許多進展并有應用于臨床的報道，但仍有許多缺點。首先，經體外培養擴增的種子細胞通過胰蛋白酶消化后以單細胞的形式收集，此過程中已有的細胞外基質以及細胞間連接蛋白被破壞，容易改變細胞的表型及生化成分，進而影響細胞活性和功能。其次，至今為止沒有一種理想的支架材料問世，這些不夠理想的支架材料的應用影響了種子細胞的附著、生長、增殖及功能行使[1]。再者，細胞與支架直接復合的方法存在細胞利用率較低、細胞接種密度和分布不均一等不足。
1993年日本學者Okano等[2]首先報道將溫度敏感性聚合物應用到細胞培養上，創新地發明了細胞膜片技術，為解決上述問題帶來希望。具體方法是將N-異丙基丙烯酰胺凝膠涂于普通培養皿底壁制備成溫敏培養皿，37 ℃條件下培養細胞在其表面黏附生長、伸展、擴增，最后在培養皿底壁形成完整的單層細胞膜片。當溫度降低至32 ℃以下時，該材料自發膨脹形成一層水化層，使本來利于黏附在疏水性表面的細胞難以繼續黏附在培養皿底壁，因此以完整的膜狀結構從培養皿底分離，從而收集到相應的細胞膜片。該技術避免了對細胞進行傳統胰蛋白酶消化等處理，保留細胞自分泌的細胞外基質以及一些重要的細胞表面蛋白如離子通道、生長因子受體、細胞-細胞連接蛋白等[1, 3]。但該方法技術操作程序復雜并相對費時，且應用溫敏聚合物，可能會影響細胞的增殖分化。Ma等[4]在普通培養皿上連續培養后通過物理刮擦的方法同樣獲得了骨髓基質細胞膜片，制備方法簡單、省時，無需特殊材料或者設備。
1 單層軟組織的構建
作為一種新型細胞釋放載體，細胞膜片已成功應用于構建組織工程角膜、黏膜、心肌等多種細胞密集型軟組織[1, 3, 5]。Nishida等[3]利用細胞膜片技術構建組織工程角膜并成功地為患者實施了角膜修復。他們從4例患有角膜干細胞缺乏癥的患者口腔內切取小塊黏膜，分離獲得黏膜上皮細胞，接種到溫敏凝膠培養皿中，連續培養2周后獲得黏膜上皮細胞膜片，直接移植到角膜表面，術后1周患者即獲得了角膜上皮細胞再生，角膜透明度恢復，視力顯著提高，隨訪14個月未發現并發癥。另外，在動物模型上取得成功后，Ohki等[6]將細胞膜片技術應用到臨床，對9例食管淺表腫瘤患者實施黏膜下切除，同期經內窺鏡用自體口腔黏膜上皮細胞膜片移植修復遺留的創面，有效地預防了食管狹窄，患者的生活質量顯著提高。
在治療心肌缺血等心臟病方面，細胞治療策略已取得初步成果，但傳統單細胞懸液注入病變區域后，細胞易發生吸收、擴散，難于停留在治療部位，修復效能較低[7]。細胞膜片技術正好彌補了以上缺點。Zakharova等[8]將心肌前體細胞膜片植入大鼠模型心肌缺血區，術后發現移植膜片逐漸發育成由新生血管、未分化細胞和少量心肌細胞構成的一厚層組織，逆轉了疤痕區變薄的心肌壁，心臟功能得到顯著提高，同時還證實植入干細胞膜片可通過旁分泌的途徑激發血管發生。Kawamura等[9]則在豬模型上證實了人皮膚成纖維細胞來源的誘導多能干細胞膜片用于治療缺血性心肌病的可行性、安全性以及有效性。
隨著再生醫學的迅速發展，細胞膜片技術也為細胞移植治療Ⅰ型糖尿病帶來了希望。由于移植細胞無法長期存活并保持生物學功能，目前胰島細胞移植的方法僅能獲得短期療效。Saito等[10]發現胰島細胞膜片無論在體外還是在體內環境下，都能保留分泌胰島素和胰高血糖素的功能，預示著細胞膜片技術有可能在Ⅰ型糖尿病的治療方面發揮重要作用。此外，在膀胱、皮膚等軟組織構建領域，細胞膜片技術也展現出誘人前景[6, 11]。
2 復層膜片構建三維結構的軟組織
細胞膜片技術獲取的單層細胞膜片也可用來構建具有三維結構的組織。Haraguchi等[12]將多層膜片重疊復合，實現了三維組織的構建。另有學者采用多次手術重疊植入單層心肌細胞膜片的方法構建出厚約1 mm、可搏動的心肌組織，膜片中保留的細胞-細胞連接對于心肌的搏動和功能恢復十分重要[7, 13]。為了比較單層和多層細胞膜片的治療效果，Sekiya等[14]將1、3、5層心肌細胞膜片植入大鼠心肌梗死區，術后8周通過超聲心動圖、導管插入術、組織學等檢查綜合評價，結果多層膜片組的心臟射血分數及收縮末期壓力容積顯著改善，5層膜片移植組中心肌纖維化最少，新生血管密度最高，表明植入多層膜片可以更好地恢復心功能。
細胞膜片技術在血管構建方面也展現出良好的應用前景。Hibino等[15]將誘導的多能干細胞膜片與直徑0.8 mm細管狀可降解的高分子聚合物復合構建小口徑組織工程化血管。Zhao等[16]應用未分化骨髓基質干細胞膜片成功構建小口徑組織工程化血管，在兔頸動脈缺損模型上成功重建頸動脈，移植1月后血管仍保持通暢，并發現部分血管內壁上皮化。L’Heureux等[17]將血管平滑肌細胞膜片結構環繞在一個管狀支撐體，再用人成纖維細胞膜片環繞在中膜層外作為血管外膜，孵育成熟后將支撐體取出并把內皮細胞接種到管腔內。該方法體外構建的組織工程血管具有三層結構，血管內徑約3 mm，爆破強度可達到2 000 mm Hg，與人體天然血管相當，進一步用于修復犬雙側股動脈缺損，短期內觀察血管通暢。
氧氣和營養的充足供應以及代謝產物的順利排出，是體外構建的大體積組織植入體內后能夠成活的必要前提，因此解決血管化的問題勢在必行。Sasagawa等[18]將臍靜脈內皮細胞膜片以“三明治”的形式夾雜在多層成肌細胞膜片中間，體外培養發現內皮細胞層可發芽形成網狀血管，植入裸鼠體內后這些預成血管與宿主體內血管自行吻合連接，形成的新生血管網有利于三維構建組織的成活，該研究結果提示借助細胞膜片技術有望實現構建組織的血管化。
3 硬組織的構建和再生
細胞膜片技術在骨、軟骨、牙齒等硬組織構建領域也有諸多應用。2007年Zhou等[19]首先報道將細胞膜片技術應用于組織工程骨的構建,其方法是將具有成骨分化潛能的骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)膜片包裹塊狀磷酸三鈣/聚已酸內酯復合材料，體外培養后植入裸鼠背部皮下，發現皮質骨和松質骨形成，同時新生組織具有較高抗壓強度。Ma等[20]將BMSC膜片作為骨膜樣組織與磷酸三鈣復合，發現細胞膜片可以作為細胞釋放載體賦予無機材料生物活性。Solorio等[21]將人來源BMSC膜片與加載有轉移生長因子的可降解明膠微球結合，成功構建軟骨樣組織。此外，Yang等[22]采用經處理的牙本質作為生物支架，與人牙濾泡細胞膜片復合，構建牙根樣組織，并發現細胞膜片在牙本質引導下形成牙髓和牙周樣結構。
上述研究是在體外及實驗動物皮下異位完成的，尚不能代表構建組織在骨或者軟骨缺損環境下具有修復功能。因此，Tsumanuma等[23]借助乙醇酸編織片做載體，將三層犬牙周膜細胞膜片三明治式重疊后移植到牙周缺損的牙根表面，周圍充填多孔β-磷酸三鈣，結果缺損區既有新生骨也有牙骨質，二者間還可見良好走行的膠原纖維連接。Ma等[24]在兔模型的顱骨臨界缺損區植入細胞膜片和同種異體脫鈣骨基質顆粒復合物，術后12周缺損區完全由新生骨修復。
這些硬組織的構建方法仍然涉及到外源性支架材料的應用。盡管已有眾多材料(生物陶瓷、高分子聚合物及陶瓷聚合物復合材料等)被應用于構建組織工程骨，但目前為止仍未發現一種完全理想的材料。為避免對支架材料過分依賴，Ma等[4]將成骨分化的骨髓基質膜片折疊成長方形狀的多層膜片復合物，并由一端卷起形成具有一定體積的圓構建物，靜置孵育后移植到裸鼠背部皮下，結果發現8周后體內形成密度與裸鼠椎體相似的礦化物，組織學檢查證實為骨組織。研究結果充分說明單純應用成體干細胞膜片，無需支架材料也可以構建骨組織，為組織工程骨構建提供了新的策略。
綜上所述，細胞膜片技術已經廣泛應用于組織工程和再生醫學領域。該技術也存在一些局限性亟待解決，例如：細胞膜片具有易碎性，可操作性能較低，初期的生物力學性能較差；其次，采用該技術構建大體積的組織時，所需種子細胞數量大、培養時間長且形態難以精確控制。但作為一種優良的細胞釋放系統，細胞膜片技術是傳統組織工程技術的有益補充，將為組織工程和再生醫學的發展提供嶄新思路和廣闊前景。
引言
近年來隨著再生醫學的迅速發展，基于組織工程學原理構建的工程化組織為組織器官的修復與再生開辟了新的途徑。組織工程包含了種子細胞、生長因子、生物支架材料以及組織構建等要素，模擬了組織再生的過程。傳統組織工程的構建方法主要是將種子細胞與外源性支架材料復合形成具有生物活性的組織替代物，盡管現已取得許多進展并有應用于臨床的報道，但仍有許多缺點。首先，經體外培養擴增的種子細胞通過胰蛋白酶消化后以單細胞的形式收集，此過程中已有的細胞外基質以及細胞間連接蛋白被破壞，容易改變細胞的表型及生化成分，進而影響細胞活性和功能。其次，至今為止沒有一種理想的支架材料問世，這些不夠理想的支架材料的應用影響了種子細胞的附著、生長、增殖及功能行使[1]。再者，細胞與支架直接復合的方法存在細胞利用率較低、細胞接種密度和分布不均一等不足。
1993年日本學者Okano等[2]首先報道將溫度敏感性聚合物應用到細胞培養上，創新地發明了細胞膜片技術，為解決上述問題帶來希望。具體方法是將N-異丙基丙烯酰胺凝膠涂于普通培養皿底壁制備成溫敏培養皿，37 ℃條件下培養細胞在其表面黏附生長、伸展、擴增，最后在培養皿底壁形成完整的單層細胞膜片。當溫度降低至32 ℃以下時，該材料自發膨脹形成一層水化層，使本來利于黏附在疏水性表面的細胞難以繼續黏附在培養皿底壁，因此以完整的膜狀結構從培養皿底分離，從而收集到相應的細胞膜片。該技術避免了對細胞進行傳統胰蛋白酶消化等處理，保留細胞自分泌的細胞外基質以及一些重要的細胞表面蛋白如離子通道、生長因子受體、細胞-細胞連接蛋白等[1, 3]。但該方法技術操作程序復雜并相對費時，且應用溫敏聚合物，可能會影響細胞的增殖分化。Ma等[4]在普通培養皿上連續培養后通過物理刮擦的方法同樣獲得了骨髓基質細胞膜片，制備方法簡單、省時，無需特殊材料或者設備。
1 單層軟組織的構建
作為一種新型細胞釋放載體，細胞膜片已成功應用于構建組織工程角膜、黏膜、心肌等多種細胞密集型軟組織[1, 3, 5]。Nishida等[3]利用細胞膜片技術構建組織工程角膜并成功地為患者實施了角膜修復。他們從4例患有角膜干細胞缺乏癥的患者口腔內切取小塊黏膜，分離獲得黏膜上皮細胞，接種到溫敏凝膠培養皿中，連續培養2周后獲得黏膜上皮細胞膜片，直接移植到角膜表面，術后1周患者即獲得了角膜上皮細胞再生，角膜透明度恢復，視力顯著提高，隨訪14個月未發現并發癥。另外，在動物模型上取得成功后，Ohki等[6]將細胞膜片技術應用到臨床，對9例食管淺表腫瘤患者實施黏膜下切除，同期經內窺鏡用自體口腔黏膜上皮細胞膜片移植修復遺留的創面，有效地預防了食管狹窄，患者的生活質量顯著提高。
在治療心肌缺血等心臟病方面，細胞治療策略已取得初步成果，但傳統單細胞懸液注入病變區域后，細胞易發生吸收、擴散，難于停留在治療部位，修復效能較低[7]。細胞膜片技術正好彌補了以上缺點。Zakharova等[8]將心肌前體細胞膜片植入大鼠模型心肌缺血區，術后發現移植膜片逐漸發育成由新生血管、未分化細胞和少量心肌細胞構成的一厚層組織，逆轉了疤痕區變薄的心肌壁，心臟功能得到顯著提高，同時還證實植入干細胞膜片可通過旁分泌的途徑激發血管發生。Kawamura等[9]則在豬模型上證實了人皮膚成纖維細胞來源的誘導多能干細胞膜片用于治療缺血性心肌病的可行性、安全性以及有效性。
隨著再生醫學的迅速發展，細胞膜片技術也為細胞移植治療Ⅰ型糖尿病帶來了希望。由于移植細胞無法長期存活并保持生物學功能，目前胰島細胞移植的方法僅能獲得短期療效。Saito等[10]發現胰島細胞膜片無論在體外還是在體內環境下，都能保留分泌胰島素和胰高血糖素的功能，預示著細胞膜片技術有可能在Ⅰ型糖尿病的治療方面發揮重要作用。此外，在膀胱、皮膚等軟組織構建領域，細胞膜片技術也展現出誘人前景[6, 11]。
2 復層膜片構建三維結構的軟組織
細胞膜片技術獲取的單層細胞膜片也可用來構建具有三維結構的組織。Haraguchi等[12]將多層膜片重疊復合，實現了三維組織的構建。另有學者采用多次手術重疊植入單層心肌細胞膜片的方法構建出厚約1 mm、可搏動的心肌組織，膜片中保留的細胞-細胞連接對于心肌的搏動和功能恢復十分重要[7, 13]。為了比較單層和多層細胞膜片的治療效果，Sekiya等[14]將1、3、5層心肌細胞膜片植入大鼠心肌梗死區，術后8周通過超聲心動圖、導管插入術、組織學等檢查綜合評價，結果多層膜片組的心臟射血分數及收縮末期壓力容積顯著改善，5層膜片移植組中心肌纖維化最少，新生血管密度最高，表明植入多層膜片可以更好地恢復心功能。
細胞膜片技術在血管構建方面也展現出良好的應用前景。Hibino等[15]將誘導的多能干細胞膜片與直徑0.8 mm細管狀可降解的高分子聚合物復合構建小口徑組織工程化血管。Zhao等[16]應用未分化骨髓基質干細胞膜片成功構建小口徑組織工程化血管，在兔頸動脈缺損模型上成功重建頸動脈，移植1月后血管仍保持通暢，并發現部分血管內壁上皮化。L’Heureux等[17]將血管平滑肌細胞膜片結構環繞在一個管狀支撐體，再用人成纖維細胞膜片環繞在中膜層外作為血管外膜，孵育成熟后將支撐體取出并把內皮細胞接種到管腔內。該方法體外構建的組織工程血管具有三層結構，血管內徑約3 mm，爆破強度可達到2 000 mm Hg，與人體天然血管相當，進一步用于修復犬雙側股動脈缺損，短期內觀察血管通暢。
氧氣和營養的充足供應以及代謝產物的順利排出，是體外構建的大體積組織植入體內后能夠成活的必要前提，因此解決血管化的問題勢在必行。Sasagawa等[18]將臍靜脈內皮細胞膜片以“三明治”的形式夾雜在多層成肌細胞膜片中間，體外培養發現內皮細胞層可發芽形成網狀血管，植入裸鼠體內后這些預成血管與宿主體內血管自行吻合連接，形成的新生血管網有利于三維構建組織的成活，該研究結果提示借助細胞膜片技術有望實現構建組織的血管化。
3 硬組織的構建和再生
細胞膜片技術在骨、軟骨、牙齒等硬組織構建領域也有諸多應用。2007年Zhou等[19]首先報道將細胞膜片技術應用于組織工程骨的構建,其方法是將具有成骨分化潛能的骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)膜片包裹塊狀磷酸三鈣/聚已酸內酯復合材料，體外培養后植入裸鼠背部皮下，發現皮質骨和松質骨形成，同時新生組織具有較高抗壓強度。Ma等[20]將BMSC膜片作為骨膜樣組織與磷酸三鈣復合，發現細胞膜片可以作為細胞釋放載體賦予無機材料生物活性。Solorio等[21]將人來源BMSC膜片與加載有轉移生長因子的可降解明膠微球結合，成功構建軟骨樣組織。此外，Yang等[22]采用經處理的牙本質作為生物支架，與人牙濾泡細胞膜片復合，構建牙根樣組織，并發現細胞膜片在牙本質引導下形成牙髓和牙周樣結構。
上述研究是在體外及實驗動物皮下異位完成的，尚不能代表構建組織在骨或者軟骨缺損環境下具有修復功能。因此，Tsumanuma等[23]借助乙醇酸編織片做載體，將三層犬牙周膜細胞膜片三明治式重疊后移植到牙周缺損的牙根表面，周圍充填多孔β-磷酸三鈣，結果缺損區既有新生骨也有牙骨質，二者間還可見良好走行的膠原纖維連接。Ma等[24]在兔模型的顱骨臨界缺損區植入細胞膜片和同種異體脫鈣骨基質顆粒復合物，術后12周缺損區完全由新生骨修復。
這些硬組織的構建方法仍然涉及到外源性支架材料的應用。盡管已有眾多材料(生物陶瓷、高分子聚合物及陶瓷聚合物復合材料等)被應用于構建組織工程骨，但目前為止仍未發現一種完全理想的材料。為避免對支架材料過分依賴，Ma等[4]將成骨分化的骨髓基質膜片折疊成長方形狀的多層膜片復合物，并由一端卷起形成具有一定體積的圓構建物，靜置孵育后移植到裸鼠背部皮下，結果發現8周后體內形成密度與裸鼠椎體相似的礦化物，組織學檢查證實為骨組織。研究結果充分說明單純應用成體干細胞膜片，無需支架材料也可以構建骨組織，為組織工程骨構建提供了新的策略。
綜上所述，細胞膜片技術已經廣泛應用于組織工程和再生醫學領域。該技術也存在一些局限性亟待解決，例如：細胞膜片具有易碎性，可操作性能較低，初期的生物力學性能較差；其次，采用該技術構建大體積的組織時，所需種子細胞數量大、培養時間長且形態難以精確控制。但作為一種優良的細胞釋放系統，細胞膜片技術是傳統組織工程技術的有益補充，將為組織工程和再生醫學的發展提供嶄新思路和廣闊前景。