骨骼肌擁有良好的再生和損傷后修復能力,這種自我更新的能力依賴于骨骼肌衛星細胞。當肌肉損傷后,骨骼肌衛星細胞從靜息狀態被激活并開始增殖,進而形成肌前體細胞或成肌母細胞,最終分化成肌細胞,并與原有肌纖維融合修復損傷的肌肉。本文就骨骼肌衛星細胞自我更新的分子調節機制作一綜述。
引用本文： 熊慧, 浦亞斌, 馬月輝, 扈清云, 關偉軍, 李向臣. 骨骼肌衛星細胞自我更新的分子調節. 生物醫學工程學雜志, 2014, 31(5): 1168-1171. doi: 10.7507/1001-5515.20140221 復制
引言
骨骼肌衛星細胞(skeletal satellite cell,SSC)是目前公認的一類成體干細胞，位于骨骼肌纖維膜和基底膜之間，具有較強的增殖分化能力，其體外培養及生物學特性已有大量研究，可作為肌組織工程技術的種子細胞。在骨骼肌纖維受到損傷后，SSC被激活并通過增殖分化從而修復受損肌纖維，這種自我更新的調節過程，需要一系列分子機制調節，闡明SSC自我更新的機制能夠為體外培養SSC提供更多理論依據，最終應用于肌組織工程，為臨床治療肌肉退行性疾病奠定基礎。本文就SSC自我更新的分子機制作一綜述。
1 配對盒基因和成肌蛋白的表達與SSC的功能維持
配對盒基因 (paired box gene 7,Pax7) 屬于Pax基因家族的第Ⅲ組，與中樞神經系統和骨骼肌的發育有關，是強有力的生肌性誘導物，能使多能干細胞轉變為生肌性細胞，在骨骼肌的發育和再生過程中起著至關重要的作用[1]。成肌蛋白(myoblast determination protein,MyoD)屬于肌原性的堿性螺旋-環-螺旋(basic helix-loop-helix,Bhlh)的轉錄因子，在肌肉發育和再生中，與細胞分化還是維持肌原細胞狀態相關[2]。在肌細胞的生發過程中，SSC特異性表達Pax7和MyoD，二者皆為重要的肌原性轉錄因子。當Pax7表達陽性、MyoD表達陰性時，SSC呈靜息狀態；當Pax7、MyoD同時表達陽性時，SSC呈增殖狀態；而Pax7表達陰性、MyoD表達陽性時，SSC呈分化狀態[3]。除增殖分化功能外，被激活的SSC還能維持自我更新，以保持肌肉的持續再生能力。Sacco等[4]發現SSC被移植入小鼠體內后既能促進其肌肉的再生，又能補充靜息狀態的衛星細胞龕的數量。肌原細胞的分化潛能和SSC數量隨著年齡的增長而下降，肌肉的再生能力也隨之減弱[5-6]。Kuang等[7-8]報道用基因敲除方法制備Pax7表達陰性的裸鼠，并檢測該實驗鼠體內SSC的數量，結果顯示SSC數量非常少，該實驗鼠伴有肌肉再生障礙，從其分離培養的SSC增殖和分化能力也相應減弱。盡管不斷有新的證據闡明肌原性生發的分子機制，但是SSC如何調節自身數量和功能還有待進一步研究。
2 Pax7和MyoD與SSC自我更新模式
Tedesco等[9-11]提出，在成年哺乳動物肌肉組織中，存在一種維持衛星細胞龕功能狀態的機制，即當一些SSC在細胞分裂后仍然具備自我更新能力并形成干細胞龕，從而出現不同功能的細胞群體。Kuang等[7]也認為SSC由兩種群體組成：一種是肌肉衛星細胞，具備分化潛能；另一種是未分化亞群細胞，保持SSC干性潛能[7-8]。 Ono等[12]通過熒光親脂性染料26(fluorescent lipophilic dye,Pkh26)標記SSC，將其區分為快分裂細胞和慢分裂細胞，其研究結果表明快分裂SSC提供大量分化的成肌細胞，而慢分裂SSC則提供靜息態的自我更新細胞。體內移植實驗表明慢分裂SSC具備干細胞潛能，在體內負責持續性的肌肉再生，并能夠產生肌原性細胞子代。在此研究中，慢分裂SSC基因表達分析可為肌細胞群體中干細胞群體的區分提供一些重要的線索，有望成為在肌細胞群體中篩選干細胞的新方法，即運用流式細胞術(fluorescence activated cell sorting,FACS)，依據細胞內源性表面標記篩選SSC。該實驗證明SSC不僅具備自我更新能力，維持細胞數量，還能產生肌母細胞，促使肌肉再生[13]，同時SSC的自我更新對于維持SSC靜息龕位具有重要的作用。眾多研究表明，Pax7和MyoD在SSC中的表達對于其自我更新和肌原性分化至關重要。在肌原性分化過程中，大多數Pax7和MyoD表達雙陽性的肌母細胞分化到成肌細胞和肌小管時，都伴隨著Pax7表達量的衰減，而MyoD則維持表達量，只有小部分的肌母細胞在MyoD表達減少時還依然保持Pax7的表達，并且從SSC的自我更新狀態變為干細胞靜息態龕位。這說明大部分SSC在細胞增殖過程中能夠調節自身增殖狀態和增殖方向，而且MyoD的表達下調在SSC自我更新程序中是一個重要因素。
Asakura等[14-15]證實，MyoD在非肌原細胞中表達可以將細胞編程為肌原性細胞。在其實驗中，肌母細胞被注射到MyoD基因敲除鼠再生肌肉中，結果發現分離提取得到的肌母細胞數量比分離提取得到的野生型肌母細胞多。除此之外，MyoD基因敲除的肌母細胞在小鼠體內移植能夠增加肌肉中的SSC數量。MyoD基因敲除的肌母細胞較野生型肌母細胞更不容易凋亡[16]，且SSC的數量仍在增長。因此，MyoD基因敲除的肌母細胞保留了干細胞特性，包括對抗凋亡以及移植后SSC的增加。總之，對于肌母細胞來說，MyoD的低表達是SSC自我更新的關鍵因素[17]。
3 Six1、p38α/βmapkp、mir-489-dek信號通路調控SSC自我更新
同源異形框基因(sine oculis-related homeobox 1,Six1)屬于Six同源蛋白家族，在SSC的激活態和靜息態均有表達，能夠調節SSC自我更新進而調控骨骼肌的再生。Six1的表達能激活MyoD的表達進而促使肌母細胞分化，相反，Six1的缺失則抑制肌肉再生并使SSC數量增加。Six1表達的下調和雙重特異性磷酸酶6(dual specificity phosphatase 6,Dusp6)的下調通過抑制ERK1/2信號通路誘使SSC自我更新[18-20]。Troy 等[21]認為，p38α/βmapkp通路參與調控SSC的非對稱分裂。在肌母細胞增殖過程中，蛋白酶激活受體(protease activated receptor,Par)屬于G蛋白耦聯受體超家族成員之一，Par蛋白復合物能夠激動p38α/βmapkp信號通路，使MyoD上調以及促進肌原性分化。而肌母細胞MyoD下調，p38α/βMAPKP通路受阻，則導致SSC的自我更新。Cheung等[22]研究表明肌母細胞自我更新的調節可以通過microRNA中的mir489作用實現，當mir489在靜息態SSC中高表達，能夠抑制原癌基因dek表達，進而使SSC保持靜息狀態。當靜息態SSC中dek表達減少時，mir-489能夠激動肌母細胞MyoD的表達。mir489下調則dek表達上調，誘使SSC轉為激活態，說明mir489-dek通路對于維持SSC靜息狀態至關重要。綜上所述，MyoD表達的下調和Pax7表達的上調能使SSC由激活態轉為靜息態，然而肌母細胞為何選擇性地非對稱分裂或對稱分裂仍有待闡明。
4 Notch信號通路參與SSC自我更新
Notch信號通路由Notch受體、Notch配體DSL(包括Delta蛋白、Serrate蛋白和Lag2蛋白)、CSL[C端啟動子結合蛋白(c-promoter binding protein-1,Cbf-1)、無毛基因抑制基因(suppressor of hairless，Su(H))和Lag1復合物]、DNA結合蛋白、其他的效應物和Notch的調節分子等組成。哺乳動物有4種Notch受體(Notch 1~4)和5種Notch配體(Delta-like 1、3、4,Jagged 1和Jagged 2)。Notch信號的產生是通過相鄰細胞的Notch配體與受體相互作用，Notch蛋白經過三次剪切，由胞內段(notch intracellular domain,NICD)釋放入胞質，并進入細胞核與轉錄因子CSL結合，形成Nicd/CSL轉錄激活復合體，從而激活Notch靶基因轉錄編碼Hes基因和Hey基因等在內的Bhlh家族轉錄因子。Lai等[23]認為，Notch信號通路在SSC的相互作用和維持肌肉組織內穩態以及肌細胞再生中起著重要的作用。 Mourikis等[24-25]實驗表明在成年鼠體內阻斷Notch信號通路可使SSC從靜息態轉為快速分化狀態，最終至SSC干細胞龕損耗，無法進行肌肉再生。Fukada等[26]實驗證明抑制Notch信號通路的靶基因Hesr1和Hear3也會導致SSC自我更新的減少、干細胞龕的損耗以及肌肉再生機制的間接損害，所以激活SSC之間、SSC與肌纖維之間的Notch信號通路可以影響SSC的增殖和定植能力。Notch信號通路可使rbpj(recombination binding protein-J)基因突變，致使MyoD基因敲除的SSC不能位于正常位置，而位于肌纖維間隙，并不參與肌纖維的生長。Brhl等[27]闡述了Notch信號通路與SSC定植能力的相互關系，認為Notch信號通路與基質膜蛋白形成有關，還能產生細胞黏附分子，如整合素α7、膠原ⅩⅧ和多上皮因子樣結構域10，說明Notch信號通路通過刺激基底層產物來影響SSC的定植。
5 低氧生理條件參與調控SSC自我更新
近期研究表明，生理條件也能調節SSC的自我更新。Liu等[28]提出低氧環境不會影響肌母細胞增殖，但可通過上調Pax7表達來促進SSC的自我更新，具體是通過低氧下調miRNA-1/miRNA-206的表達來激活Notch信號通路，進而上調Pax7的表達，參與SSC增殖調控。Majmundar等[29]研究認為低氧或Notch信號通路抑制MyoD表達，從而參與調控SSC的自我更新。
6 展望
SSC功能的維持與一系列生理作用有著錯綜復雜的聯系。眾所周知，SSC在肌肉再生方面至關重要，但是SSC選擇分化為成肌細胞還是保守為干細胞的機制還存在爭議。此外，還需深入研究決定成體肌肉組織中SSC數量和使干細胞龕調節呈多相性的更多SSC相關機制。進一步的研究指出，SSC被非對稱的DNA模板區分形成子代來維持干細胞特性和維持肌原性細胞；甲基化的Pax7使組蛋白甲基化，在Pax7下游基因Myf5的后生調節過程中能夠決定干細胞命運[30-31]，這些SSC的表觀現象與DNA甲基化狀態或后生記憶相關，因此需進一步研究揭示SSC調節分化、自我更新和維持干細胞狀態的機制。
引言
骨骼肌衛星細胞(skeletal satellite cell,SSC)是目前公認的一類成體干細胞，位于骨骼肌纖維膜和基底膜之間，具有較強的增殖分化能力，其體外培養及生物學特性已有大量研究，可作為肌組織工程技術的種子細胞。在骨骼肌纖維受到損傷后，SSC被激活并通過增殖分化從而修復受損肌纖維，這種自我更新的調節過程，需要一系列分子機制調節，闡明SSC自我更新的機制能夠為體外培養SSC提供更多理論依據，最終應用于肌組織工程，為臨床治療肌肉退行性疾病奠定基礎。本文就SSC自我更新的分子機制作一綜述。
1 配對盒基因和成肌蛋白的表達與SSC的功能維持
配對盒基因 (paired box gene 7,Pax7) 屬于Pax基因家族的第Ⅲ組，與中樞神經系統和骨骼肌的發育有關，是強有力的生肌性誘導物，能使多能干細胞轉變為生肌性細胞，在骨骼肌的發育和再生過程中起著至關重要的作用[1]。成肌蛋白(myoblast determination protein,MyoD)屬于肌原性的堿性螺旋-環-螺旋(basic helix-loop-helix,Bhlh)的轉錄因子，在肌肉發育和再生中，與細胞分化還是維持肌原細胞狀態相關[2]。在肌細胞的生發過程中，SSC特異性表達Pax7和MyoD，二者皆為重要的肌原性轉錄因子。當Pax7表達陽性、MyoD表達陰性時，SSC呈靜息狀態；當Pax7、MyoD同時表達陽性時，SSC呈增殖狀態；而Pax7表達陰性、MyoD表達陽性時，SSC呈分化狀態[3]。除增殖分化功能外，被激活的SSC還能維持自我更新，以保持肌肉的持續再生能力。Sacco等[4]發現SSC被移植入小鼠體內后既能促進其肌肉的再生，又能補充靜息狀態的衛星細胞龕的數量。肌原細胞的分化潛能和SSC數量隨著年齡的增長而下降，肌肉的再生能力也隨之減弱[5-6]。Kuang等[7-8]報道用基因敲除方法制備Pax7表達陰性的裸鼠，并檢測該實驗鼠體內SSC的數量，結果顯示SSC數量非常少，該實驗鼠伴有肌肉再生障礙，從其分離培養的SSC增殖和分化能力也相應減弱。盡管不斷有新的證據闡明肌原性生發的分子機制，但是SSC如何調節自身數量和功能還有待進一步研究。
2 Pax7和MyoD與SSC自我更新模式
Tedesco等[9-11]提出，在成年哺乳動物肌肉組織中，存在一種維持衛星細胞龕功能狀態的機制，即當一些SSC在細胞分裂后仍然具備自我更新能力并形成干細胞龕，從而出現不同功能的細胞群體。Kuang等[7]也認為SSC由兩種群體組成：一種是肌肉衛星細胞，具備分化潛能；另一種是未分化亞群細胞，保持SSC干性潛能[7-8]。 Ono等[12]通過熒光親脂性染料26(fluorescent lipophilic dye,Pkh26)標記SSC，將其區分為快分裂細胞和慢分裂細胞，其研究結果表明快分裂SSC提供大量分化的成肌細胞，而慢分裂SSC則提供靜息態的自我更新細胞。體內移植實驗表明慢分裂SSC具備干細胞潛能，在體內負責持續性的肌肉再生，并能夠產生肌原性細胞子代。在此研究中，慢分裂SSC基因表達分析可為肌細胞群體中干細胞群體的區分提供一些重要的線索，有望成為在肌細胞群體中篩選干細胞的新方法，即運用流式細胞術(fluorescence activated cell sorting,FACS)，依據細胞內源性表面標記篩選SSC。該實驗證明SSC不僅具備自我更新能力，維持細胞數量，還能產生肌母細胞，促使肌肉再生[13]，同時SSC的自我更新對于維持SSC靜息龕位具有重要的作用。眾多研究表明，Pax7和MyoD在SSC中的表達對于其自我更新和肌原性分化至關重要。在肌原性分化過程中，大多數Pax7和MyoD表達雙陽性的肌母細胞分化到成肌細胞和肌小管時，都伴隨著Pax7表達量的衰減，而MyoD則維持表達量，只有小部分的肌母細胞在MyoD表達減少時還依然保持Pax7的表達，并且從SSC的自我更新狀態變為干細胞靜息態龕位。這說明大部分SSC在細胞增殖過程中能夠調節自身增殖狀態和增殖方向，而且MyoD的表達下調在SSC自我更新程序中是一個重要因素。
Asakura等[14-15]證實，MyoD在非肌原細胞中表達可以將細胞編程為肌原性細胞。在其實驗中，肌母細胞被注射到MyoD基因敲除鼠再生肌肉中，結果發現分離提取得到的肌母細胞數量比分離提取得到的野生型肌母細胞多。除此之外，MyoD基因敲除的肌母細胞在小鼠體內移植能夠增加肌肉中的SSC數量。MyoD基因敲除的肌母細胞較野生型肌母細胞更不容易凋亡[16]，且SSC的數量仍在增長。因此，MyoD基因敲除的肌母細胞保留了干細胞特性，包括對抗凋亡以及移植后SSC的增加。總之，對于肌母細胞來說，MyoD的低表達是SSC自我更新的關鍵因素[17]。
3 Six1、p38α/βmapkp、mir-489-dek信號通路調控SSC自我更新
同源異形框基因(sine oculis-related homeobox 1,Six1)屬于Six同源蛋白家族，在SSC的激活態和靜息態均有表達，能夠調節SSC自我更新進而調控骨骼肌的再生。Six1的表達能激活MyoD的表達進而促使肌母細胞分化，相反，Six1的缺失則抑制肌肉再生并使SSC數量增加。Six1表達的下調和雙重特異性磷酸酶6(dual specificity phosphatase 6,Dusp6)的下調通過抑制ERK1/2信號通路誘使SSC自我更新[18-20]。Troy 等[21]認為，p38α/βmapkp通路參與調控SSC的非對稱分裂。在肌母細胞增殖過程中，蛋白酶激活受體(protease activated receptor,Par)屬于G蛋白耦聯受體超家族成員之一，Par蛋白復合物能夠激動p38α/βmapkp信號通路，使MyoD上調以及促進肌原性分化。而肌母細胞MyoD下調，p38α/βMAPKP通路受阻，則導致SSC的自我更新。Cheung等[22]研究表明肌母細胞自我更新的調節可以通過microRNA中的mir489作用實現，當mir489在靜息態SSC中高表達，能夠抑制原癌基因dek表達，進而使SSC保持靜息狀態。當靜息態SSC中dek表達減少時，mir-489能夠激動肌母細胞MyoD的表達。mir489下調則dek表達上調，誘使SSC轉為激活態，說明mir489-dek通路對于維持SSC靜息狀態至關重要。綜上所述，MyoD表達的下調和Pax7表達的上調能使SSC由激活態轉為靜息態，然而肌母細胞為何選擇性地非對稱分裂或對稱分裂仍有待闡明。
4 Notch信號通路參與SSC自我更新
Notch信號通路由Notch受體、Notch配體DSL(包括Delta蛋白、Serrate蛋白和Lag2蛋白)、CSL[C端啟動子結合蛋白(c-promoter binding protein-1,Cbf-1)、無毛基因抑制基因(suppressor of hairless，Su(H))和Lag1復合物]、DNA結合蛋白、其他的效應物和Notch的調節分子等組成。哺乳動物有4種Notch受體(Notch 1~4)和5種Notch配體(Delta-like 1、3、4,Jagged 1和Jagged 2)。Notch信號的產生是通過相鄰細胞的Notch配體與受體相互作用，Notch蛋白經過三次剪切，由胞內段(notch intracellular domain,NICD)釋放入胞質，并進入細胞核與轉錄因子CSL結合，形成Nicd/CSL轉錄激活復合體，從而激活Notch靶基因轉錄編碼Hes基因和Hey基因等在內的Bhlh家族轉錄因子。Lai等[23]認為，Notch信號通路在SSC的相互作用和維持肌肉組織內穩態以及肌細胞再生中起著重要的作用。 Mourikis等[24-25]實驗表明在成年鼠體內阻斷Notch信號通路可使SSC從靜息態轉為快速分化狀態，最終至SSC干細胞龕損耗，無法進行肌肉再生。Fukada等[26]實驗證明抑制Notch信號通路的靶基因Hesr1和Hear3也會導致SSC自我更新的減少、干細胞龕的損耗以及肌肉再生機制的間接損害，所以激活SSC之間、SSC與肌纖維之間的Notch信號通路可以影響SSC的增殖和定植能力。Notch信號通路可使rbpj(recombination binding protein-J)基因突變，致使MyoD基因敲除的SSC不能位于正常位置，而位于肌纖維間隙，并不參與肌纖維的生長。Brhl等[27]闡述了Notch信號通路與SSC定植能力的相互關系，認為Notch信號通路與基質膜蛋白形成有關，還能產生細胞黏附分子，如整合素α7、膠原ⅩⅧ和多上皮因子樣結構域10，說明Notch信號通路通過刺激基底層產物來影響SSC的定植。
5 低氧生理條件參與調控SSC自我更新
近期研究表明，生理條件也能調節SSC的自我更新。Liu等[28]提出低氧環境不會影響肌母細胞增殖，但可通過上調Pax7表達來促進SSC的自我更新，具體是通過低氧下調miRNA-1/miRNA-206的表達來激活Notch信號通路，進而上調Pax7的表達，參與SSC增殖調控。Majmundar等[29]研究認為低氧或Notch信號通路抑制MyoD表達，從而參與調控SSC的自我更新。
6 展望
SSC功能的維持與一系列生理作用有著錯綜復雜的聯系。眾所周知，SSC在肌肉再生方面至關重要，但是SSC選擇分化為成肌細胞還是保守為干細胞的機制還存在爭議。此外，還需深入研究決定成體肌肉組織中SSC數量和使干細胞龕調節呈多相性的更多SSC相關機制。進一步的研究指出，SSC被非對稱的DNA模板區分形成子代來維持干細胞特性和維持肌原性細胞；甲基化的Pax7使組蛋白甲基化，在Pax7下游基因Myf5的后生調節過程中能夠決定干細胞命運[30-31]，這些SSC的表觀現象與DNA甲基化狀態或后生記憶相關，因此需進一步研究揭示SSC調節分化、自我更新和維持干細胞狀態的機制。