本研究旨在建立一種更適合軟骨細胞生長的三維培養體系。首先通過酰胺鍵反應將甲基丙烯酸引入海藻酸鹽長鏈形成甲基丙烯酸海藻酸鹽(MA), 然后將MA和混合陽離子Ba2+∶Ca2+=5∶5進行光交聯反應, 形成內部結構為貫通式凝膠網絡(IPN)的凝膠小球(MA凝膠小球)。將P1代軟骨細胞包裹在MA凝膠小球中連續培養三周, 在培養的不同時間點取適量凝膠小球進行倒置顯微鏡觀察, 冰凍切片后HE染色和免疫組化染色, 掃描電鏡觀察第21 d細胞在支架中的情況; 通過Alamar blue法檢測軟骨細胞的增殖情況; 二甲基亞甲蘭法定量檢測糖胺多糖(GAG)的含量。結果顯示MA和混合陽離子Ba2+∶Ca2+=5∶5發生光交聯反應形成的MA凝膠小球, 與對照組藻酸鈣相比, P1代軟骨細胞在MA凝膠小球內增殖更明顯, 細胞外基質GAG的分泌也更多, 掃描電鏡下觀察到軟骨細胞可以良好地黏附在支架中生長, 免疫組化染色呈陽性。以上結果證實軟骨細胞在MA凝膠小球中的增殖和細胞外基質的分泌量優于藻酸鈣組, 并且能維持軟骨細胞的表型, 是一種更好的軟骨細胞三維培養載體。
引用本文： 汪洋, 馮玉霞, 樊星, 任利玲. 混合陽離子交聯劑甲基丙烯酸海藻酸鹽三維培養軟骨細胞. 生物醫學工程學雜志, 2015, 32(3): 599-604. doi: 10.7507/1001-5515.20150109 復制
引言
軟骨缺乏血供，損傷后自我修復能力十分有限。采用自體軟骨替代修復會對患者造成第二次損傷。利用凝膠作為移植物載體包裹細胞修復軟骨缺損已進行了廣泛地研究，目前發現凝膠的機械性能和結構顯著影響著細胞的生物學性狀[1]，從而決定著軟骨修復的成功與否。
海藻酸鹽已經有20多年的研究歷史，它是由α-L-古羅塘醛酸和β-D-甘露糖醛通過1, 4糖苷鍵連接的天然多糖，生物相容性良好且無毒、無致敏反應，可以和Ca2+等二價陽離子發生交聯反應，形成網狀結構的水凝膠, 是一種良好地微囊化細胞的支架材料[1]。它作為支架材料包裹軟骨細胞可以良好地維持軟骨細胞的表型，使軟骨細胞表達特異性的蛋白。然而該凝膠材料的強度不能完全匹配軟骨修復應力，限制了其應用。Cha等[2]將甲基丙烯酸引入海藻酸鹽生成甲基丙烯酸海藻酸鹽(methacrylic alginate, MA)，和鈣離子交聯后通過光交聯反應形成貫通式的凝膠網絡(interpenetrating network, IPN)，提高了海藻酸鹽水凝膠的強度，進一步將酵母細胞包裹在該凝膠中，發現酵母細胞保留了更多的新陳代謝活動，然而不足之處就是凝膠小球的滲透性下降了約10％。我們課題組前期研究發現Ca2+ :Ba2+=5 :5混合陽離子作為交聯劑和MA通過熱反應生成的凝膠小球強度和滲透性均顯示最佳特性[3]，但熱反應限制了其作為細胞培養載體的使用。Cha等研究發現通過光反應同樣可以達到雙鍵的斷裂聚合，使這種材料有望成為理想的組織工程材料。基于此，我們將混合陽離子Ca2+ :Ba2+=5 :5與MA通過光交聯反應形成MA凝膠小球，并微囊化軟骨細胞，觀察軟骨細胞在該三維培養體系中的增殖和生長情況，以期為軟骨細胞提供更合適的培養載體。
1 材料與方法
1.1 材料
低粘度海藻酸鈉(Sigma)；氯化鈣(分析純)；氯化鋇(分析純)；Mes緩沖液(上海生工)；光引發劑VA-086(武漢福德化工有限公司)；Ⅱ型膠原酶(Sigma)；Ⅱ型膠原單克隆抗體、抗山羊二抗(武漢博士德)；DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋公司)；鯊魚硫酸軟骨素(Sigma)；木瓜蛋白酶(Sigma)；Alamar blue(Sigma)；1, 9-二甲基亞甲藍(1, 9-Dimethylmethylene blue，DMB)(Sigma)；16G成膠針；掃描電子顯微鏡(日立S-3400N)；萬能材料測試儀AGS-5Xkn(Japan)。
1.2 材料制備
1.2.1 兔關節軟骨細胞的分離和培養
取4周齡日本大耳白兔(中國農業科學院蘭州獸類研究所提供)，耳緣靜脈栓塞法處死后，無菌條件下解剖分離兔下肢膝關節軟骨，暴露呈半透明狀的關節軟骨，用12號手術刀片切取膝關節軟骨。將其剪碎至約1 mm3大小。視軟骨的量加入胰蛋白酶消化30 min，吸去胰蛋白酶后，加入Ⅱ型膠原酶，37℃搖床消化6 h，用200目濾網濾過剩余組織，1 000 r/min離心5 min，棄上清。PBS洗兩遍，血細胞計數板計數，按1.0×105／mL的密度接種于25 cm2培養皿，加入含10％FBS的DMEM，在37℃、5％CO2孵箱中培養。
1.2.2 MA溶液制備
①配置0.1 mol/L Mes緩沖液。②按樊星等[3]的方法制備MA。③將MA與蒸餾水按質量體積比為1 :100配制MA溶液。
1.2.3 MA凝膠小球復合軟骨細胞的制備
當P1代軟骨細胞長滿至培養皿底80％～90％時，用EDTA-胰蛋白酶將細胞消化下來，然后和含有光引發劑VA-086的1％MA混合均勻，使細胞密度為1×106個／mL，用16 G的針頭逐滴滴入Ca2+ :Ba2+=5 :5的混合陽離子中，在去離子水中用波長為365 nm的紫外燈照射5 min[2]，形成直徑為2 mm的凝膠小球，PBS反復漂洗，每個小球中約含由細胞1×104個左右。將形成的MA凝膠小球懸浮在DMEM培養液中，在37℃、5% CO2孵箱中連續培養三周，隔天換液。對照組為藻酸鈣凝膠復合軟骨細胞，將1％藻酸鹽溶液與軟骨細胞混合同樣保持軟骨細胞密度為1×106個／mL，然后用16 G針頭逐滴滴入102 mmol/L氯化鈣溶液中，靜置10 min，形成直徑約2 mm的凝膠小球。在第1、7、14、21 d對實驗組和對照組進行檢測，每組分別取10個小球進行實驗。
1.3 觀察及檢測
1.3.1 倒置顯微鏡下觀察
培養至第1、7、14、21 d，倒置相差顯微鏡下觀察復合于MA凝膠小球和藻酸鈣凝膠小球中的軟骨細胞形態及增殖情況。
1.3.2 組織學及免疫學檢測
在培養的1、7、21 d分別取小球包裹的細胞結構，用O.C.T固定，切取冰凍切片，進行HE染色。對21 d的MA組凝膠小球進行Ⅱ型膠原免疫組化染色，鑒定其是否分泌Ⅱ型膠原。
1.3.3 掃描電鏡觀察
培養至第21 d對兩組凝膠小球進行掃描電鏡觀察，觀察細胞黏附和生長情況。
1.3.4 細胞活性及增殖檢測
在培養的第1、7、14、21 d將兩組小球用PBS漂洗三遍后，以200μL／球加入溶解液(將55 mmol／L EDTA，10 mmol／L Hepes溶于三蒸水中，逐滴加入氫氧化鈉調節pH值到7.4，高溫蒸汽滅菌備用，4℃冰箱儲存)溶解，離心，去上清，200μL完全培養液重懸后接種于96孔板，18 h后換液，采用Alamar blue法評價細胞增殖活性。通過預先測定的吸光度與細胞濃度線性標準曲線，計算活細胞數量。
1.3.5 軟骨細胞分泌細胞外基質檢測
使用二甲基亞甲蘭法[4]測定各時間點樣品硫酸化糖胺多糖(glycosaminoglycan, GAG)的含量。具體方法為：兩組在不同時間點各取三份完整的凝膠小球(10個/份)，PBS沖洗兩遍，在真空干燥箱內低壓凍干，加入木瓜蛋白酶緩沖溶液，60℃水浴箱消化過夜。每40μL消化混合液加入200μL DMB(pH 1.5)，于595 nm測吸光度值。以鯊魚硫酸軟骨素作為標準，定量GAG含量。
1.4 統計學分析
采用SPSS 18.0統計軟件包進行分析，所得數據以
2 結果
2.1 軟骨細胞的原代培養
課題組前期通過同樣的方法分離獲得兔膝關節軟骨，并對其進行Ⅱ型膠原免疫組化和甲苯胺藍染色鑒定，證實該細胞是具備正常功能的軟骨細胞[5]。本次分離貼壁的軟骨細胞呈多角形或短梭形，原代細胞接種后一周可以長滿瓶底的70％~80％，整體看上去呈不規則的“鋪路石”樣，如圖 1所示。
圖1
倒置顯微鏡下原代軟骨細胞形態(bar=200μm)
Figure1.
Morphology of primary chondrocytes cells(bar=200μm)
2.2 MA凝膠小球包裹軟骨細胞的形成
形成的MA凝膠小球為半透明狀的球形，直徑在2 mm左右，凝膠小球孵育在含有DMEM培養液的24孔板中，如圖 2所示。
圖2
MA凝膠小球微囊化軟骨細胞
(a)MA凝膠小球的直徑為2 mm左右；(b)MA凝膠小球在24孔板中培養的情況
Figure2. Chondrocytes encapsulated in alginate beads(a) the diameter of the MA alginate bead is around 2 mm; (b) chondrocytes encapsulated in the beads were cultured
2.3 倒置顯微鏡下觀察軟骨細胞在凝膠小球中的情況
從圖 3中可以看出軟骨細胞初植入MA凝膠小球和藻酸鈣凝膠小球內，細胞分布均勻，隨著培養天數的增加，兩組細胞增殖明顯，到第14 d均可見細胞簇形成，第21 d細胞簇的數量明顯增多。兩組凝膠內細胞主要集中在小球的邊緣部分，可能是因為小球中心部位營養和氧氣供應不足，導致了小球中心細胞的增殖緩慢甚至壞死。而單純凝膠小球組(空白對照組)在培養液中培養第21 d后鏡下可見小球內部呈均質狀。
圖3
軟骨細胞在凝膠小球中的培養情況(bar=200μm)
1：第21 d空白對照組；2：第1 d軟骨細胞初植入小球，細胞分布均勻；3：第7 d軟骨細胞增殖明顯；4：第14 d可見細胞簇形成；5：第21 d細胞簇逐漸增多
Figure3. Chondrocytes cultured in gel beads (bar=200μm)1: blank group on Day 21; 2: chondrocytes first culture in beads, cells were uniformly distributed on Day 1; 3: cell proliferation clearly on Day 7; 4: cell clusters could be observed on Day 14; 5: cell clusters gradually increased
2.4 掃描電鏡下觀察軟骨細胞在支架中的情況
第21 d通過掃描電鏡發現，MA凝膠小球和藻酸鈣凝膠小球內部結構均呈多孔結構，軟骨細胞黏附在MA凝膠小球和藻酸鈣凝膠小球支架中生長，呈圓形，如圖 4所示。
圖4
掃描電鏡下細胞在支架中的情況(bar=30μm)
(a)軟骨細胞在MA凝膠小球中黏附和生長情況；(b)軟骨細胞在藻酸鈣凝膠小球中黏附和生長情況(白色箭頭指示的是軟骨細胞)
Figure4. SEM showing the growth of chondrocytes (bar=30μm)(a) the adhesion and growth of chondrocytes in MA gel bead; (b) the adhesion and growth of chondrocytes in alginate gel bead
2.5 微囊化軟骨細胞的組織學染色和免疫組化染色結果
HE染色顯示最初軟骨細胞黏附在支架材料內生長，第7 d細胞增殖明顯，出現細胞簇，到第21 d細胞簇數量顯著增多, MA凝膠組細胞簇數量較藻酸鈣組更多，如圖 5所示。免疫組化染色顯示第21 d MA組Ⅱ型膠原免疫組化染色呈陽性，主要分布在小球周邊，如圖 6所示。
1：第1 d細胞在凝膠中分布的情況；2：第7 d細胞增殖明顯，細胞聚集成簇生長；3：第21 d細胞簇數量顯著增多，MA凝膠組細胞簇數量較藻酸鈣組更多。白色箭頭指示的是細胞簇，星形指示的是支架結構
Figure5. Histological staining of chondrocytes cultured in gel beads (bar=100μm)
圖6
第21 d MA組免疫組化染色示膠原分泌情況
40倍鏡下觀察到Ⅱ型膠原主要分布在小球周邊(bar=500μm)
Figure6. Immunohistochemieal staining of collagen typeⅡon cultured in MA beads on Day 21collagen typeⅡwas mainly distributed on the edge of gel beads under the microscope of 40 times (bar=500μm)
2.6 軟骨細胞的活性及增殖檢測
Alamar blue法測定細胞增殖結果如圖 7所示，顯示在培養的21 d內，兩組小球內軟骨細胞不斷增殖，MA組細胞增殖比藻酸鈣組更加明顯，活細胞數量更多。第21 d MA組細胞數達到(4.082±0.166)×104/10個小球，藻酸鈣組細胞數達到(3.373±0.088)×104/10個小球，組間單因素方差分析第21 d兩組細胞數目之間的差異具有統計學意義(P＜0.05)。
圖7
Alamar blue法測定兩組間的細胞數目
Figure7.
Cells numbers in two groups with time using Alamar blue
2.7 細胞外基質GAG含量的測定結果
細胞在小球中培養的GAG定量檢測結果如圖 8所示，在培養的21 d內，GAG的分泌隨時間增長逐漸增多，到第21 d MA組GAG含量達到(10.811±0.337)μg/10個小球，藻酸鈣組GAG含量達到(8.242±0.223)μg/10個小球，組間單因素方差分析第21 d兩組GAG含量之間的差異具有統計學意義(P＜0.05)。
圖8
兩組小球中軟骨細胞蛋白聚糖的含量
Figure8.
Glycosaminoglycan content of chondrocyte in beads between two groups
3 討論
海藻酸鹽作為一種細胞外基質的替代材料，機械強度、膨脹率、降解率、滲透性等結構特征顯著影響著細胞的生長、增殖、黏附等生物學性狀[1]。已有研究表明凝膠的強度影響著細胞的黏附、增殖和表型[6]。Genes等[7]發現凝膠機械強度越大細胞的黏附越好，細胞的表型也最接近生理狀態。Kong等[8]將細胞接種在不同強度的藻酸鹽表面生長時，發現細胞分泌細胞外基質的量也會受到影響。一些學者發現藻酸鈣凝膠的機械強度較差，限制了細胞的長期增殖生長[9-10]，研究發現通過增加海藻酸鹽的濃度或陽離子濃度可以增加凝膠的強度，但凝膠的滲透性下降，導致細胞的存活率下降[11]。
藻酸鹽微球的制備通常是將海藻酸鈉滴入到二價陽離子如Ca2+、Sr2+或Ba2+等溶液中而制備。Cui等[12]發現藻酸鹽與Ba2+形成的凝膠小球比Ca2+結構更加穩定。事實上，M?rch等[13]分別用Ba2+與Ca2+作為藻酸鹽的陽離子交聯劑發現，Ba2+作為交聯劑反應形成的凝膠小球強度高，但孔徑小，而Ca2+作為交聯劑，形成的凝膠小球強度低，但孔徑大。其原因在于Ca2+與Ba2+能分別與海藻酸鹽M、G、MG片段中的不同片段連接，從而影響著凝膠小球的強度和滲透性。后來有學者將不同比例的Ba2+和Ca2+混合作為陽離子與藻酸鹽反應，發現生成的小球在滲透性和強度方面確實有所不同[14]。
本課題組前期研究發現將不同比例的Ba2+、Ca2+混合陽離子通過熱反應與MA交聯生成的凝膠小球中，Ba2+ :Ca2+=5 :5作為混合陽離子交聯劑與甲基丙烯酸交聯形成的凝膠小球強度和滲透性顯示出最佳特性[3]，但熱反應限制其微囊化細胞的應用。本實驗將Ba2+ :Ca2+=5 :5作為陽離子交聯劑，與MA通過光反應生成MA凝膠小球，提高了凝膠的強度，又維持了凝膠小球的滲透性(數據未顯示)。光交聯反應中光引發劑VA-086在W/V最大為1.5％時對軟骨細胞是無毒性的[16]。利用此改性方法獲得的凝膠小球內部支架結構良好，軟骨細胞可以在支架中黏附、生長，掃描電鏡顯示軟骨細胞保持了球形的形態。培養21 d后，軟骨細胞維持了良好表型。較藻酸鈣組而言，MA組軟骨細胞的增殖更好，細胞外基質GAG的分泌量也更多，證實了它是一種比藻酸鈣更適合的體外培養軟骨細胞的載體。然而21 d后MA組細胞增殖也僅為93％左右，離臨床應用還有很大差距，下一步我們將在提高細胞增殖方面尋求改性。在本實驗中，我們發現小球中心存活細胞較少，這可能由于我們所制備的凝膠小球直徑較大，導致營養液滲透性下降，營養和氧氣難以供給到小球中心，所以造成小球中心細胞增殖緩慢甚至壞死。有研究發現可以通過氣體吹噴制囊法和靜電微囊發生法來制備直徑較小的凝膠小球[17-18]。
引言
軟骨缺乏血供，損傷后自我修復能力十分有限。采用自體軟骨替代修復會對患者造成第二次損傷。利用凝膠作為移植物載體包裹細胞修復軟骨缺損已進行了廣泛地研究，目前發現凝膠的機械性能和結構顯著影響著細胞的生物學性狀[1]，從而決定著軟骨修復的成功與否。
海藻酸鹽已經有20多年的研究歷史，它是由α-L-古羅塘醛酸和β-D-甘露糖醛通過1, 4糖苷鍵連接的天然多糖，生物相容性良好且無毒、無致敏反應，可以和Ca2+等二價陽離子發生交聯反應，形成網狀結構的水凝膠, 是一種良好地微囊化細胞的支架材料[1]。它作為支架材料包裹軟骨細胞可以良好地維持軟骨細胞的表型，使軟骨細胞表達特異性的蛋白。然而該凝膠材料的強度不能完全匹配軟骨修復應力，限制了其應用。Cha等[2]將甲基丙烯酸引入海藻酸鹽生成甲基丙烯酸海藻酸鹽(methacrylic alginate, MA)，和鈣離子交聯后通過光交聯反應形成貫通式的凝膠網絡(interpenetrating network, IPN)，提高了海藻酸鹽水凝膠的強度，進一步將酵母細胞包裹在該凝膠中，發現酵母細胞保留了更多的新陳代謝活動，然而不足之處就是凝膠小球的滲透性下降了約10％。我們課題組前期研究發現Ca2+ :Ba2+=5 :5混合陽離子作為交聯劑和MA通過熱反應生成的凝膠小球強度和滲透性均顯示最佳特性[3]，但熱反應限制了其作為細胞培養載體的使用。Cha等研究發現通過光反應同樣可以達到雙鍵的斷裂聚合，使這種材料有望成為理想的組織工程材料。基于此，我們將混合陽離子Ca2+ :Ba2+=5 :5與MA通過光交聯反應形成MA凝膠小球，并微囊化軟骨細胞，觀察軟骨細胞在該三維培養體系中的增殖和生長情況，以期為軟骨細胞提供更合適的培養載體。
1 材料與方法
1.1 材料
低粘度海藻酸鈉(Sigma)；氯化鈣(分析純)；氯化鋇(分析純)；Mes緩沖液(上海生工)；光引發劑VA-086(武漢福德化工有限公司)；Ⅱ型膠原酶(Sigma)；Ⅱ型膠原單克隆抗體、抗山羊二抗(武漢博士德)；DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋公司)；鯊魚硫酸軟骨素(Sigma)；木瓜蛋白酶(Sigma)；Alamar blue(Sigma)；1, 9-二甲基亞甲藍(1, 9-Dimethylmethylene blue，DMB)(Sigma)；16G成膠針；掃描電子顯微鏡(日立S-3400N)；萬能材料測試儀AGS-5Xkn(Japan)。
1.2 材料制備
1.2.1 兔關節軟骨細胞的分離和培養
取4周齡日本大耳白兔(中國農業科學院蘭州獸類研究所提供)，耳緣靜脈栓塞法處死后，無菌條件下解剖分離兔下肢膝關節軟骨，暴露呈半透明狀的關節軟骨，用12號手術刀片切取膝關節軟骨。將其剪碎至約1 mm3大小。視軟骨的量加入胰蛋白酶消化30 min，吸去胰蛋白酶后，加入Ⅱ型膠原酶，37℃搖床消化6 h，用200目濾網濾過剩余組織，1 000 r/min離心5 min，棄上清。PBS洗兩遍，血細胞計數板計數，按1.0×105／mL的密度接種于25 cm2培養皿，加入含10％FBS的DMEM，在37℃、5％CO2孵箱中培養。
1.2.2 MA溶液制備
①配置0.1 mol/L Mes緩沖液。②按樊星等[3]的方法制備MA。③將MA與蒸餾水按質量體積比為1 :100配制MA溶液。
1.2.3 MA凝膠小球復合軟骨細胞的制備
當P1代軟骨細胞長滿至培養皿底80％～90％時，用EDTA-胰蛋白酶將細胞消化下來，然后和含有光引發劑VA-086的1％MA混合均勻，使細胞密度為1×106個／mL，用16 G的針頭逐滴滴入Ca2+ :Ba2+=5 :5的混合陽離子中，在去離子水中用波長為365 nm的紫外燈照射5 min[2]，形成直徑為2 mm的凝膠小球，PBS反復漂洗，每個小球中約含由細胞1×104個左右。將形成的MA凝膠小球懸浮在DMEM培養液中，在37℃、5% CO2孵箱中連續培養三周，隔天換液。對照組為藻酸鈣凝膠復合軟骨細胞，將1％藻酸鹽溶液與軟骨細胞混合同樣保持軟骨細胞密度為1×106個／mL，然后用16 G針頭逐滴滴入102 mmol/L氯化鈣溶液中，靜置10 min，形成直徑約2 mm的凝膠小球。在第1、7、14、21 d對實驗組和對照組進行檢測，每組分別取10個小球進行實驗。
1.3 觀察及檢測
1.3.1 倒置顯微鏡下觀察
培養至第1、7、14、21 d，倒置相差顯微鏡下觀察復合于MA凝膠小球和藻酸鈣凝膠小球中的軟骨細胞形態及增殖情況。
1.3.2 組織學及免疫學檢測
在培養的1、7、21 d分別取小球包裹的細胞結構，用O.C.T固定，切取冰凍切片，進行HE染色。對21 d的MA組凝膠小球進行Ⅱ型膠原免疫組化染色，鑒定其是否分泌Ⅱ型膠原。
1.3.3 掃描電鏡觀察
培養至第21 d對兩組凝膠小球進行掃描電鏡觀察，觀察細胞黏附和生長情況。
1.3.4 細胞活性及增殖檢測
在培養的第1、7、14、21 d將兩組小球用PBS漂洗三遍后，以200μL／球加入溶解液(將55 mmol／L EDTA，10 mmol／L Hepes溶于三蒸水中，逐滴加入氫氧化鈉調節pH值到7.4，高溫蒸汽滅菌備用，4℃冰箱儲存)溶解，離心，去上清，200μL完全培養液重懸后接種于96孔板，18 h后換液，采用Alamar blue法評價細胞增殖活性。通過預先測定的吸光度與細胞濃度線性標準曲線，計算活細胞數量。
1.3.5 軟骨細胞分泌細胞外基質檢測
使用二甲基亞甲蘭法[4]測定各時間點樣品硫酸化糖胺多糖(glycosaminoglycan, GAG)的含量。具體方法為：兩組在不同時間點各取三份完整的凝膠小球(10個/份)，PBS沖洗兩遍，在真空干燥箱內低壓凍干，加入木瓜蛋白酶緩沖溶液，60℃水浴箱消化過夜。每40μL消化混合液加入200μL DMB(pH 1.5)，于595 nm測吸光度值。以鯊魚硫酸軟骨素作為標準，定量GAG含量。
1.4 統計學分析
采用SPSS 18.0統計軟件包進行分析，所得數據以
2 結果
2.1 軟骨細胞的原代培養
課題組前期通過同樣的方法分離獲得兔膝關節軟骨，并對其進行Ⅱ型膠原免疫組化和甲苯胺藍染色鑒定，證實該細胞是具備正常功能的軟骨細胞[5]。本次分離貼壁的軟骨細胞呈多角形或短梭形，原代細胞接種后一周可以長滿瓶底的70％~80％，整體看上去呈不規則的“鋪路石”樣，如圖 1所示。
圖1
倒置顯微鏡下原代軟骨細胞形態(bar=200μm)
Figure1.
Morphology of primary chondrocytes cells(bar=200μm)
2.2 MA凝膠小球包裹軟骨細胞的形成
形成的MA凝膠小球為半透明狀的球形，直徑在2 mm左右，凝膠小球孵育在含有DMEM培養液的24孔板中，如圖 2所示。
圖2
MA凝膠小球微囊化軟骨細胞
(a)MA凝膠小球的直徑為2 mm左右；(b)MA凝膠小球在24孔板中培養的情況
Figure2. Chondrocytes encapsulated in alginate beads(a) the diameter of the MA alginate bead is around 2 mm; (b) chondrocytes encapsulated in the beads were cultured
2.3 倒置顯微鏡下觀察軟骨細胞在凝膠小球中的情況
從圖 3中可以看出軟骨細胞初植入MA凝膠小球和藻酸鈣凝膠小球內，細胞分布均勻，隨著培養天數的增加，兩組細胞增殖明顯，到第14 d均可見細胞簇形成，第21 d細胞簇的數量明顯增多。兩組凝膠內細胞主要集中在小球的邊緣部分，可能是因為小球中心部位營養和氧氣供應不足，導致了小球中心細胞的增殖緩慢甚至壞死。而單純凝膠小球組(空白對照組)在培養液中培養第21 d后鏡下可見小球內部呈均質狀。
圖3
軟骨細胞在凝膠小球中的培養情況(bar=200μm)
1：第21 d空白對照組；2：第1 d軟骨細胞初植入小球，細胞分布均勻；3：第7 d軟骨細胞增殖明顯；4：第14 d可見細胞簇形成；5：第21 d細胞簇逐漸增多
Figure3. Chondrocytes cultured in gel beads (bar=200μm)1: blank group on Day 21; 2: chondrocytes first culture in beads, cells were uniformly distributed on Day 1; 3: cell proliferation clearly on Day 7; 4: cell clusters could be observed on Day 14; 5: cell clusters gradually increased
2.4 掃描電鏡下觀察軟骨細胞在支架中的情況
第21 d通過掃描電鏡發現，MA凝膠小球和藻酸鈣凝膠小球內部結構均呈多孔結構，軟骨細胞黏附在MA凝膠小球和藻酸鈣凝膠小球支架中生長，呈圓形，如圖 4所示。
圖4
掃描電鏡下細胞在支架中的情況(bar=30μm)
(a)軟骨細胞在MA凝膠小球中黏附和生長情況；(b)軟骨細胞在藻酸鈣凝膠小球中黏附和生長情況(白色箭頭指示的是軟骨細胞)
Figure4. SEM showing the growth of chondrocytes (bar=30μm)(a) the adhesion and growth of chondrocytes in MA gel bead; (b) the adhesion and growth of chondrocytes in alginate gel bead
2.5 微囊化軟骨細胞的組織學染色和免疫組化染色結果
HE染色顯示最初軟骨細胞黏附在支架材料內生長，第7 d細胞增殖明顯，出現細胞簇，到第21 d細胞簇數量顯著增多, MA凝膠組細胞簇數量較藻酸鈣組更多，如圖 5所示。免疫組化染色顯示第21 d MA組Ⅱ型膠原免疫組化染色呈陽性，主要分布在小球周邊，如圖 6所示。
1：第1 d細胞在凝膠中分布的情況；2：第7 d細胞增殖明顯，細胞聚集成簇生長；3：第21 d細胞簇數量顯著增多，MA凝膠組細胞簇數量較藻酸鈣組更多。白色箭頭指示的是細胞簇，星形指示的是支架結構
Figure5. Histological staining of chondrocytes cultured in gel beads (bar=100μm)
圖6
第21 d MA組免疫組化染色示膠原分泌情況
40倍鏡下觀察到Ⅱ型膠原主要分布在小球周邊(bar=500μm)
Figure6. Immunohistochemieal staining of collagen typeⅡon cultured in MA beads on Day 21collagen typeⅡwas mainly distributed on the edge of gel beads under the microscope of 40 times (bar=500μm)
2.6 軟骨細胞的活性及增殖檢測
Alamar blue法測定細胞增殖結果如圖 7所示，顯示在培養的21 d內，兩組小球內軟骨細胞不斷增殖，MA組細胞增殖比藻酸鈣組更加明顯，活細胞數量更多。第21 d MA組細胞數達到(4.082±0.166)×104/10個小球，藻酸鈣組細胞數達到(3.373±0.088)×104/10個小球，組間單因素方差分析第21 d兩組細胞數目之間的差異具有統計學意義(P＜0.05)。
圖7
Alamar blue法測定兩組間的細胞數目
Figure7.
Cells numbers in two groups with time using Alamar blue
2.7 細胞外基質GAG含量的測定結果
細胞在小球中培養的GAG定量檢測結果如圖 8所示，在培養的21 d內，GAG的分泌隨時間增長逐漸增多，到第21 d MA組GAG含量達到(10.811±0.337)μg/10個小球，藻酸鈣組GAG含量達到(8.242±0.223)μg/10個小球，組間單因素方差分析第21 d兩組GAG含量之間的差異具有統計學意義(P＜0.05)。
圖8
兩組小球中軟骨細胞蛋白聚糖的含量
Figure8.
Glycosaminoglycan content of chondrocyte in beads between two groups
3 討論
海藻酸鹽作為一種細胞外基質的替代材料，機械強度、膨脹率、降解率、滲透性等結構特征顯著影響著細胞的生長、增殖、黏附等生物學性狀[1]。已有研究表明凝膠的強度影響著細胞的黏附、增殖和表型[6]。Genes等[7]發現凝膠機械強度越大細胞的黏附越好，細胞的表型也最接近生理狀態。Kong等[8]將細胞接種在不同強度的藻酸鹽表面生長時，發現細胞分泌細胞外基質的量也會受到影響。一些學者發現藻酸鈣凝膠的機械強度較差，限制了細胞的長期增殖生長[9-10]，研究發現通過增加海藻酸鹽的濃度或陽離子濃度可以增加凝膠的強度，但凝膠的滲透性下降，導致細胞的存活率下降[11]。
藻酸鹽微球的制備通常是將海藻酸鈉滴入到二價陽離子如Ca2+、Sr2+或Ba2+等溶液中而制備。Cui等[12]發現藻酸鹽與Ba2+形成的凝膠小球比Ca2+結構更加穩定。事實上，M?rch等[13]分別用Ba2+與Ca2+作為藻酸鹽的陽離子交聯劑發現，Ba2+作為交聯劑反應形成的凝膠小球強度高，但孔徑小，而Ca2+作為交聯劑，形成的凝膠小球強度低，但孔徑大。其原因在于Ca2+與Ba2+能分別與海藻酸鹽M、G、MG片段中的不同片段連接，從而影響著凝膠小球的強度和滲透性。后來有學者將不同比例的Ba2+和Ca2+混合作為陽離子與藻酸鹽反應，發現生成的小球在滲透性和強度方面確實有所不同[14]。
本課題組前期研究發現將不同比例的Ba2+、Ca2+混合陽離子通過熱反應與MA交聯生成的凝膠小球中，Ba2+ :Ca2+=5 :5作為混合陽離子交聯劑與甲基丙烯酸交聯形成的凝膠小球強度和滲透性顯示出最佳特性[3]，但熱反應限制其微囊化細胞的應用。本實驗將Ba2+ :Ca2+=5 :5作為陽離子交聯劑，與MA通過光反應生成MA凝膠小球，提高了凝膠的強度，又維持了凝膠小球的滲透性(數據未顯示)。光交聯反應中光引發劑VA-086在W/V最大為1.5％時對軟骨細胞是無毒性的[16]。利用此改性方法獲得的凝膠小球內部支架結構良好，軟骨細胞可以在支架中黏附、生長，掃描電鏡顯示軟骨細胞保持了球形的形態。培養21 d后，軟骨細胞維持了良好表型。較藻酸鈣組而言，MA組軟骨細胞的增殖更好，細胞外基質GAG的分泌量也更多，證實了它是一種比藻酸鈣更適合的體外培養軟骨細胞的載體。然而21 d后MA組細胞增殖也僅為93％左右，離臨床應用還有很大差距，下一步我們將在提高細胞增殖方面尋求改性。在本實驗中，我們發現小球中心存活細胞較少，這可能由于我們所制備的凝膠小球直徑較大，導致營養液滲透性下降，營養和氧氣難以供給到小球中心，所以造成小球中心細胞增殖緩慢甚至壞死。有研究發現可以通過氣體吹噴制囊法和靜電微囊發生法來制備直徑較小的凝膠小球[17-18]。
