人腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(hTRAIL)因對腫瘤細胞有選擇性殺傷作用而成為新型抗腫瘤候選藥物。預測的恒河猴TRAIL(mmTRAIL)與hTRAIL高度同源, 提示其有殺傷人腫瘤細胞的可能性。但目前尚無mmTRAIL蛋白功能的報道。本文首先從恒河猴外周血單個核淋巴細胞中擴增了可溶性mmTRAIL編碼基因, 然后構建了pQE30-mmTRAIL表達質粒并進行誘導表達。通過Ni-NTA agarose親和層析從破菌上清液中獲得mmTRAIL蛋白。聚丙烯酰胺凝膠電泳和凝膠過濾層析表明, mmTRAIL在溶液中主要以三聚體形式存在。體外條件下, mmTRAIL對結腸癌細胞COLO205顯示強烈的殺傷作用, 而對正常細胞BEA2b無害, 表明其對腫瘤細胞的殺傷有選擇性。裸鼠荷瘤模型進一步證實mmTRAIL能夠抑制腫瘤生長, 具有抗腫瘤作用。這些結果表明, mmTRAIL能夠殺傷人腫瘤細胞, 可作為新型腫瘤靶向治療藥物進一步深入研究。
引用本文： 樊淼淼, 賈殿隆, 楊浩, 萬琳, 盧曉風. 恒河猴可溶性腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體的基因克隆、重組表達和功能研究. 生物醫學工程學雜志, 2015, 32(3): 605-611. doi: 10.7507/1001-5515.20150110 復制
引言
近年來，惡性腫瘤已成為威脅人類生命和健康的主要疾病之一。目前，外科手術及放、化療仍是臨床腫瘤治療的主要方法。雖然傳統放、化療在腫瘤治療中發揮了重要作用，但其存在毒副作用大等缺點。理想的化療藥物應具有細胞殺傷選擇性，即在清除腫瘤細胞的同時不傷害正常細胞。因此，高效、低毒抗腫瘤藥物的篩選和設計已成為新型抗腫瘤藥物的發展方向[1-2]。
人腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(human-related apoptosis inducing ligand，hTRAIL)，是腫瘤壞死因子超家族成員之一, 主要表達于活化T細胞，在腫瘤免疫監視中起重要作用[3]。hTRAIL有四種膜受體，包括死亡受體DR4和DR5，誘騙受體DcR1和DcR2。hTRAIL與死亡受體結合后，可通過受體死亡結構域傳遞信號，誘導細胞凋亡。而誘騙受體與死亡受體結構相似，但缺乏死亡結構域，hTRAIL與誘騙受體結合后不傳遞凋亡信號。死亡受體DR4和DR5高表達于腫瘤細胞，誘騙受體DcR1和DcR2高表達于正常細胞。因此，hTRAIL在較低濃度下對腫瘤細胞產生毒性，而對正常細胞無害，是新型抗腫瘤候選藥物[4-6]。
hTRAIL全長分子由281個氨基酸組成，包括胞內段，跨膜區和胞外段。其中，胞外段又稱可溶性hTRAIL。已有大量研究通過基因工程重組表達可溶性hTRAIL，并發現其對多種腫瘤細胞有殺傷作用[7]。目前hTRAIL作為抗腫瘤藥物單獨使用已進入臨床試驗，部分病例獲得預期治療效果[8-9]。研究還發現，hTRAIL與放化療藥物聯用，在實驗腫瘤治療中顯示增效作用[10-11]。因此，hTRAIL在腫瘤治療中有廣泛的應用前景。
基于hTRAIL在腫瘤免疫監視中的重要性和作為新型抗腫瘤藥物的可能性，多種動物的TRAIL基因和蛋白得以研究[12-13]。隨著基因組計劃的進行，恒河猴(Macaca mulatta)TRAIL(mmTRAIL)序列也被預測(XM_001084768)，但目前尚無其蛋白功能的報道。若證實mmTRAIL也具有抗腫瘤活性，將為抗腫瘤藥物的研發提供新選擇。本文首先擴增了可溶性mmTRAIL編碼基因，然后通過基因工程手段獲得了重組蛋白，并對其體內外抗腫瘤作用進行了初步研究。
1 材料和方法
1.1 細菌和質粒載體
大腸桿菌E.coli TOP 10和M15菌株由本實驗室保存。質粒載體pQE30購自QIAGEN公司。
1.2 目的基因克隆
1.2.1 恒河猴外周血單個核細胞的分離
抽取健康恒河猴肝素抗凝的靜脈血10 mL，用等體積磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline，PBS：137 mmol/LNaCl, 2.68 mmol/L KCl, 8.1 mmol/L Na2HPO4, 1.47 mmol/L KH2PO4, pH 7.2)稀釋，再將血液置于淋巴細胞分離液(Ficoll)上。室溫400 g離心30 min，收集外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)于新離心管中，再加入0.83% NH4Cl，室溫靜置5 min，去除殘留的紅細胞。收集細胞，PBS洗滌兩次，再用含100 U/mL青霉素, 100 mg/mL鏈霉素和10%胎牛血清的1640培養基重懸，將其密度調整為106個/mL。
1.2.2 RNA的提取
分離的恒河猴PBMCs接種于6孔板，再用伴刀豆球蛋白A(concanavalin A，Con A，終濃度5μg/mL)刺激培養2 d。離心收集細胞，向每107個細胞中加入l～2 mL的RNAiso Plus(購自Takara公司)，然后按照試劑盒說明書提取RNA。獲得的RNA用RNase-free水溶解，-80℃保存備用。
1.2.3 目的基因的擴增
按照Promega公司提供的逆轉錄試劑盒說明書建立RNA逆轉錄體系，合成的cDNA用于多聚酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增。用Vector NTI Suite 6軟件根據Genbank預測的mmTRAIL cDNA序列(XM_001084768)設計引物。引物1為：5′-TTGAGTCG ACATGGCTATGATGGAGGCCCAGGGGGGA-3′(含SalⅠ酶切位點)。引物2為：5′-ATCAGGA TCCGTGAGAGAAAGAGGTCCTCAGAGAGTA GCA-3′(含BamHⅠ酶切位點)。引物3為：5′-CATCGGTACCTTAGCCAACCAAAAAGGCCCC GAAAAAGCTG-3′(含KpnⅠ酶切位點)。所有引物均由Invitrogen公司合成。引物1與引物3組合，擴增獲得mmTRAIL全長基因。然后以全長基因為模板，再用引物2與引物3組合，擴增獲得由114~281位氨基酸組成的可溶性mmTRAIL基因。PCR條件為：94℃預變性10 min，94℃變性30 s、55℃退火30 s及72℃延伸30 s，30個循環后，72℃延伸10 min。PCR擴增完成后用2%瓊脂糖凝膠電泳分析。
1.3 基因重組表達
1.3.1 表達質粒的構建
用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒(上海生工)純化PCR產物。質粒載體pQE30用質粒提取試劑盒(上海生工)進行。膠回收PCR產物用BamHⅠ和KpnⅠ雙酶切，然后與同樣雙酶切的質粒載體通過T4連接酶連接。連接產物轉化大腸桿菌Top 10感受態細胞，再用含氨芐西林(100μg/mL)的LB平板進行篩選。挑單克隆，接種于3~5 mL液體中培養過夜后提取質粒。質粒用BamHⅠ和KpnⅠ雙酶切鑒定，陽性克隆送出測序驗證，序列正確的質粒命名為pQE30-mmTRAIL。
1.3.2 重組蛋白誘導表達和分離純化
用表達質粒轉化大腸桿菌M15感受態細胞，然后用含有氨芐西林(100μg/mL)和卡那霉素(30μg/mL)的LB固體平板進行篩選。陽性克隆進一步用于蛋白表達。挑取單克隆接種于5 mL抗性LB液體培養基中，37℃、220 r/min震蕩培養過夜。第二天將菌液按1∶1 000的接種于1 L LB液體培養基中，37℃、280 r/min震蕩培養至A600 nm約為0.5~1.0，加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)。誘導結束，7 000 g離心10 min收集菌體，用Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L，pH 8.0)懸浮，冰浴條件下超聲破菌，功率300~400 W，工作10 s間隔50 s。超聲破菌完成后，樣品于4℃、20 000 g離心15 min，收集破菌上清和沉淀。向破菌上清中加入Ni-NTA agarose凝膠，4℃緩慢振蕩結合3 h。然后按照凝膠使用說明洗掉雜蛋白，最后用300 mmol/L咪唑洗脫目的蛋白。
1.4 蛋白濃度的測定
參照Zor等[14]描述，用Bradford法測定mmTRAIL蛋白濃度。用牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)為標準蛋白，主要步驟如下：配制不同濃度(0、0.022、0.066、0.11、0.154、0.198和0.22 mg/mL)的BSA。在96孔板中加入10μL BSA，然后再加入考馬斯亮藍溶液100μL，室溫反應5 min后用酶標儀測定A595nm。以BSA濃度為橫坐標，對應A595nm值為縱坐標制作標準曲線并得到線性回歸方程。將樣品實測A595nm值帶入方程，即可計算出蛋白濃度。
1.5 重組蛋白對腫瘤細胞的體外殺傷活性測定
利用CCK-8法測定。CCK-8溶液中含水溶性四唑鹽-WST-8，在電子耦合劑存在的情況下，可被活細胞線粒體脫氫酶還原生成橙黃色的甲瓚。藥物細胞毒性越大，作用一定時間后存留的活細胞越少，加入CCK-8反應后溶液顏色越淺。對于同樣的細胞，溶液顏色的深淺和細胞數目呈良好線性關系。人結腸癌細胞COLO205和正常細胞BEA2b在含10%小牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、100μg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素的RPMI 1640中，于37℃、5% CO2條件下培養。將104個細胞接種于96孔板中，然后加入不同濃度的蛋白作用過夜，再加入10μL CCK-8溶液，37℃反應3~4 h后用酶標儀測定A495 nm。以未經蛋白處理的細胞存活率為100%計算蛋白處理組細胞存活率。
1.6 重組蛋白體內抗腫瘤效果分析
將生長狀態良好的COLO205細胞(1.5×106個/只)接種于裸鼠(BALB/c nu/nu mice，雌性)右側后肢皮下，共24只。定期測量瘤體長和寬(單位mm)，按公式計算腫瘤體積：長×寬2×0.5。待腫瘤生長至平均體積約150 mm3后，將裸鼠隨機分成三組。實驗組通過瘤內注射分別給予15 mg/kg和30 mg/kg mmTRAIL蛋白，連續給藥5 d。對照組給予相同體積的PBS。給藥后定期監測腫瘤大小和荷瘤率。
1.7 SDS-PAGE電泳和Western blot
十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl(lauryl)sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)參照Cai等[15]的方法，利用Bio-Rad mini Gel電泳系統完成。分離膠濃度為12.7%，濃縮膠濃度為4%。電泳時先用80 V恒壓30 min左右，待樣品進入分離膠后，將電壓調為120 V繼續電泳直至溴酚藍到達凝膠邊緣。凝膠直接用考馬斯亮藍染色顯示蛋白條帶。若要繼續進行Western blot檢測，電泳后凝膠用轉膜緩沖液(25 mmol/L Tris，192 mmol/L glycine，15%甲醇)平衡15 min。同時將聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜用甲醇浸潤，再用轉膜緩沖液平衡10 min。恒壓100 V轉膜1 h后，取出PVDF膜，用5%脫脂奶粉(溶于50 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.2)4℃封閉過夜。再將PVDF膜與小鼠抗His-tag抗體于37℃條件下共孵育2 h，洗膜6次(5 min/次)后再用辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠抗體孵育1 h。PVDF膜洗滌后加化學發光試劑顯影，用凝膠成像系統采集圖像。
2 結果
2.1 mmTRAIL基因的擴增
以恒河猴PBMCs來源的RNA為模板，根據GenBank預測的mmTRAIL全長分子編碼基因設計引物，首先通過RT-PCR擴增mmTRAIL全長基因。結果如圖 1(a)所示，擴增片段分子量介于750~1 000 bp之間，與預期片段大小符合。DNA測序結果表明，擴增片段與GenBank預測的mmTRAIL全長序列相同。根據mmTRAIL全長分子序列設計引物，進一步擴增由114~281位氨基酸組成可溶性mmTRAIL基因片段。結果如圖 1(b)所示，擴增獲得分子量大約為500 bp的片段。DNA測序證明序列正確。若未特別指明，后續文中所述mmTRAIL即為可溶性mmTRAIL。
圖1
RT-PCR擴增mmTRAIL全長(a)和可溶性胞外段(b)基因
M：DNA分子量標準；1：mmTRAIL全長基因; 2：mmTRAIL胞外段基因
Figure1. Amplification of the full length of mmTRAIL by RT-PCR (a) and soluble extracellular domain (b)M: DNA markers, 1: full length of mmTRAIL; 2 :extracellular domain of mmTRAIL
2.2 mmTRAIL表達質粒的構建
為方便克隆，在上游和下游PCR引物中分別添加BamHⅠ和KpnⅠ兩個酶切位點。PCR產物雙酶切后，與經相同酶切的pQE30質粒載體連接，獲得重組表達質粒pQE30-mmTRAIL。為驗證質粒的正確性，提取質粒再行雙酶切。結果發現，未經酶切的質粒顯示單一條帶[見圖 2(a), 2]，雙酶切的質粒在與mmTRAIL編碼基因大小相符的位置出現條帶[見圖 2(a)，1]，表明PCR產物成功插入pQE30。DNA序列分析進一步驗證了表達質粒的正確性。圖 2(b)顯示了mmTRAIL基因插入pQE30后的框架結構。由于載體本身引入了6His標簽，因此，表達后的mmTRAIL在N-末端也含有該標簽，可用Ni-NTA agarose親和層析分離純化重組蛋白。
圖2
pQE30-mmTRAIL質粒的構建
(a)pQE30-mmTRAIL質粒鑒定；M：DNA分子量標準；1：pQE30-mmTRAIL質粒雙酶切產物；2：pQE30-mmTRAIL質粒；(b)pQE30-mmTRAIL表達質粒結構示意圖
Figure2. Construction of pQE30-mmTRAIL palsmid(a) identification of pQE30-mmTRAIL plasmid; M: DNA marker; 1: plasmid digested with double restriction enzymes; 2: plasmid digested without enzyme; (b) schematic diagram of pQE30-mmTRAIL plasmid
2.3 mmTRAIL蛋白的誘導表達和分離純化
將含有pQE30-mmTRAIL的大腸桿菌M15接種到抗性培養基中，待細菌進入對數生長期后加入IPTG誘導蛋白表達。取誘導前后的菌體，提取細菌總蛋白電泳分析發現，誘導后細菌總蛋白中出現了含量明顯增加的蛋白條帶，分子量與目的蛋白預期分子量相符，提示目的蛋白獲得表達。進一步將誘導后的細菌超聲破碎，電泳分析破菌上清和沉淀蛋白，發現目的蛋白以包涵體和可溶蛋白兩種形式存在。破菌上清經Ni-NTA agarose親和層析，純化的蛋白在SDS-PAGE凝膠上顯示為單一條帶[見圖 3(a)，1]。Western blot分析進一步確證獲得的蛋白為mmTRAIL[見圖 3(a)，2]。還原狀態下，SDS-PAGE電泳顯示mmTRAIL分子量大約為20 kD，與預期單體分子量相符[見圖 3(a), 1]。但凝膠過濾層析發現，mmTRAIL的保留體積為10.59 mL[見圖 3(b)], BSA的保留體積為10.12 mL[見圖 3(c)]，提示mmTRAIL在溶液中的表觀分子量與BSA相近。BSA分子量為66 kD，而mmTRAIL單體分子量為20 kD，由此推測mmTRAIL在溶液里主要以三聚體形式存在。
圖3
mmTRAIL的分離純化
(a)純化后mmTRAIL的SDS-PAGE和Western blot。M:蛋白質分子量標準；1：SDS-PAGE電泳后考馬斯亮藍染色；2：Western blot (WB)；(b)mmTRAIL凝膠過濾層析；(c) BSA凝膠過濾層析
Figure3. Purification of recombinant protein(a) SDS-PAGE and Western blot of purified mmTRAIL. M: protein markers; 1: Coomassie brilliant blue staining after SDS-PAGE; 2: Western blot (WB); (b) size exclusion chromatography of mmTRAIL; (c) size exclusion chromatography of BSA
2.4 mmTRAIL對腫瘤細胞的選擇性殺傷作用
將細胞接種于96孔板中，加入不同濃度mmTRAIL處理過夜后，用CCK-8法測定細胞存活率。結果如圖 4(a)所示，隨著蛋白濃度提高，mmTRAIL對人結腸癌細胞COLO205的殺傷作用逐漸增強。而相同濃度mmTRAIL對正常細胞BEA2b無明顯殺傷作用。這表明mmTRAIL對腫瘤細胞有選擇性殺傷作用。
圖4
mmTRAIL對腫瘤細胞的選擇性殺傷作用
(a)mmTRAIL處理后腫瘤細胞COLO205的形態觀察；(b)mmTRAIL對腫瘤細胞COLO205和正常細胞BEA2b的殺傷作用
Figure4. Selective cytotoxicity of mmTRAIL in tumor cells(a) morphology of tumor cells COLO205 treated with mmTRAIL; (b) cytotoxicity of mmTRAIL in tumor cells COLO205 and normal cells BEA2b
2.5 mmTRAIL體內抗腫瘤作用
腫瘤細胞COLO205接種到裸鼠右后肢皮下。待腫瘤生長到平均體積大約為150 mm3時，將mmTRAIL蛋白直接注入瘤內，通過觀察腫瘤生長速度來判定蛋白抗腫瘤效果。結果發現，PBS對照組腫瘤生長快速，細胞接種后20 d，腫瘤平均體積達800 mm3(由于部分腫瘤過大開始破裂，不適合再繼續觀察，對照組裸鼠此時全部被處死)[見圖 5(a)(c)]。而在蛋白處理組，注射蛋白后，腫瘤迅速縮小[見圖 5(a)]。給藥一周后部分裸鼠瘤體消失(肉眼不見皮下突起)，荷瘤率開始下降[見圖 5(b)]。20 d后，蛋白處理組所有瘤體均消失且一直維持無瘤狀態[見圖 5(c)]。直至第30天，15 mg/kg處理組有1只裸鼠腫瘤重現，但瘤體生長緩慢。第49天時，15 mg/kg處理組共有2只裸鼠腫瘤重現。而30 mg/kg處理組直到實驗觀察結束時依舊沒有腫瘤重現。這些結果表明mmTRAIL具有抗腫瘤作用。
圖5
瘤內注射mmTRAIL的抗腫瘤作用
(a)瘤內注射mmTRAIL對COLO205腫瘤的生長抑制；(b)瘤內注射mmTRAIL對裸鼠荷瘤率的影響; (c)接種20 d，mmTRAIL(15 mg/kg)和PBS處理組實驗鼠瘤體觀察
Figure5. Antitumor activity of intratumorally injected mmTRAIL(a) growth inhibition of intratumorally injected mmTRAIL on COLO205 xenograft in mice; (b) tumor incidence in mice with intratumoral injection of mmTRAIL; (c) tumor xenografts on mmTRAIL-(15 mg/kg) and PBS-treated mice on Day 20 post-implantation
3 討論
本文克隆了mmTRAIL基因，并將其插入原核表達載體誘導表達獲得了重組蛋白。mmTRAIL與hTRAIL相似，在溶液中主要以三聚體形式存在。細胞毒性測試發現，mmTRAIL能殺傷人腫瘤細胞而對正常細胞無害，具有殺傷選擇性。在裸鼠荷瘤模型中，瘤內注射mmTRAIL對腫瘤有顯著生長抑制作用。這些初步研究提示，mmTRAIL作為抗腫瘤藥物，具有潛在研究和應用價值。
獲得足量蛋白是研究其功能的必要條件。眾所周知，大多數基因在大腸桿菌中的表達均以無活性的包涵體為主，通過包涵體復性獲得可溶蛋白工作量大，難度高[16]。本文研究的mmTRAIL在大腸桿菌中也主要以包涵體形式表達，獲得可溶蛋白較少，一定程度上限制了后續蛋白功能研究的進度。我們在后續工作中將嘗試利用畢赤酵母等真核表達系統來提高可溶蛋白產量。
前期臨床試驗發現，hTRAIL對多種腫瘤都有一定治療效果[8-9]。但動物試驗顯示，與傳統化療藥物聯用，效果可能更佳[10-11]。因此，尋求與hTRAIL具有協同效應的藥物組合，已成為新的研究熱點。當然，hTRAIL也面臨因體內半衰期短而降低抗腫瘤效果的問題。體外條件下，蛋白在很低的濃度(nmol級別)就對腫瘤細胞產生殺傷作用。但體內實驗仍需10 mg/kg左右才能顯示明確抗腫瘤效果。最近，有研究把hTRAIL與人IgG1抗體Fc段融合，通過延長半衰期而產生增效作用[17]。mmTRAIL與hTRAIL抗腫瘤特性高度相似，同樣具有開發應用價值。但mmTRAIL與hTRAIL也可能面臨相同的問題。因此，還需對其作用機制、作用范圍和體內抗腫瘤效果、藥物穩定性和藥代動力學、生物安全性等內容進行深入研究后，才能評價其作為新型腫瘤藥物的可能性。
引言
近年來，惡性腫瘤已成為威脅人類生命和健康的主要疾病之一。目前，外科手術及放、化療仍是臨床腫瘤治療的主要方法。雖然傳統放、化療在腫瘤治療中發揮了重要作用，但其存在毒副作用大等缺點。理想的化療藥物應具有細胞殺傷選擇性，即在清除腫瘤細胞的同時不傷害正常細胞。因此，高效、低毒抗腫瘤藥物的篩選和設計已成為新型抗腫瘤藥物的發展方向[1-2]。
人腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(human-related apoptosis inducing ligand，hTRAIL)，是腫瘤壞死因子超家族成員之一, 主要表達于活化T細胞，在腫瘤免疫監視中起重要作用[3]。hTRAIL有四種膜受體，包括死亡受體DR4和DR5，誘騙受體DcR1和DcR2。hTRAIL與死亡受體結合后，可通過受體死亡結構域傳遞信號，誘導細胞凋亡。而誘騙受體與死亡受體結構相似，但缺乏死亡結構域，hTRAIL與誘騙受體結合后不傳遞凋亡信號。死亡受體DR4和DR5高表達于腫瘤細胞，誘騙受體DcR1和DcR2高表達于正常細胞。因此，hTRAIL在較低濃度下對腫瘤細胞產生毒性，而對正常細胞無害，是新型抗腫瘤候選藥物[4-6]。
hTRAIL全長分子由281個氨基酸組成，包括胞內段，跨膜區和胞外段。其中，胞外段又稱可溶性hTRAIL。已有大量研究通過基因工程重組表達可溶性hTRAIL，并發現其對多種腫瘤細胞有殺傷作用[7]。目前hTRAIL作為抗腫瘤藥物單獨使用已進入臨床試驗，部分病例獲得預期治療效果[8-9]。研究還發現，hTRAIL與放化療藥物聯用，在實驗腫瘤治療中顯示增效作用[10-11]。因此，hTRAIL在腫瘤治療中有廣泛的應用前景。
基于hTRAIL在腫瘤免疫監視中的重要性和作為新型抗腫瘤藥物的可能性，多種動物的TRAIL基因和蛋白得以研究[12-13]。隨著基因組計劃的進行，恒河猴(Macaca mulatta)TRAIL(mmTRAIL)序列也被預測(XM_001084768)，但目前尚無其蛋白功能的報道。若證實mmTRAIL也具有抗腫瘤活性，將為抗腫瘤藥物的研發提供新選擇。本文首先擴增了可溶性mmTRAIL編碼基因，然后通過基因工程手段獲得了重組蛋白，并對其體內外抗腫瘤作用進行了初步研究。
1 材料和方法
1.1 細菌和質粒載體
大腸桿菌E.coli TOP 10和M15菌株由本實驗室保存。質粒載體pQE30購自QIAGEN公司。
1.2 目的基因克隆
1.2.1 恒河猴外周血單個核細胞的分離
抽取健康恒河猴肝素抗凝的靜脈血10 mL，用等體積磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline，PBS：137 mmol/LNaCl, 2.68 mmol/L KCl, 8.1 mmol/L Na2HPO4, 1.47 mmol/L KH2PO4, pH 7.2)稀釋，再將血液置于淋巴細胞分離液(Ficoll)上。室溫400 g離心30 min，收集外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)于新離心管中，再加入0.83% NH4Cl，室溫靜置5 min，去除殘留的紅細胞。收集細胞，PBS洗滌兩次，再用含100 U/mL青霉素, 100 mg/mL鏈霉素和10%胎牛血清的1640培養基重懸，將其密度調整為106個/mL。
1.2.2 RNA的提取
分離的恒河猴PBMCs接種于6孔板，再用伴刀豆球蛋白A(concanavalin A，Con A，終濃度5μg/mL)刺激培養2 d。離心收集細胞，向每107個細胞中加入l～2 mL的RNAiso Plus(購自Takara公司)，然后按照試劑盒說明書提取RNA。獲得的RNA用RNase-free水溶解，-80℃保存備用。
1.2.3 目的基因的擴增
按照Promega公司提供的逆轉錄試劑盒說明書建立RNA逆轉錄體系，合成的cDNA用于多聚酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增。用Vector NTI Suite 6軟件根據Genbank預測的mmTRAIL cDNA序列(XM_001084768)設計引物。引物1為：5′-TTGAGTCG ACATGGCTATGATGGAGGCCCAGGGGGGA-3′(含SalⅠ酶切位點)。引物2為：5′-ATCAGGA TCCGTGAGAGAAAGAGGTCCTCAGAGAGTA GCA-3′(含BamHⅠ酶切位點)。引物3為：5′-CATCGGTACCTTAGCCAACCAAAAAGGCCCC GAAAAAGCTG-3′(含KpnⅠ酶切位點)。所有引物均由Invitrogen公司合成。引物1與引物3組合，擴增獲得mmTRAIL全長基因。然后以全長基因為模板，再用引物2與引物3組合，擴增獲得由114~281位氨基酸組成的可溶性mmTRAIL基因。PCR條件為：94℃預變性10 min，94℃變性30 s、55℃退火30 s及72℃延伸30 s，30個循環后，72℃延伸10 min。PCR擴增完成后用2%瓊脂糖凝膠電泳分析。
1.3 基因重組表達
1.3.1 表達質粒的構建
用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒(上海生工)純化PCR產物。質粒載體pQE30用質粒提取試劑盒(上海生工)進行。膠回收PCR產物用BamHⅠ和KpnⅠ雙酶切，然后與同樣雙酶切的質粒載體通過T4連接酶連接。連接產物轉化大腸桿菌Top 10感受態細胞，再用含氨芐西林(100μg/mL)的LB平板進行篩選。挑單克隆，接種于3~5 mL液體中培養過夜后提取質粒。質粒用BamHⅠ和KpnⅠ雙酶切鑒定，陽性克隆送出測序驗證，序列正確的質粒命名為pQE30-mmTRAIL。
1.3.2 重組蛋白誘導表達和分離純化
用表達質粒轉化大腸桿菌M15感受態細胞，然后用含有氨芐西林(100μg/mL)和卡那霉素(30μg/mL)的LB固體平板進行篩選。陽性克隆進一步用于蛋白表達。挑取單克隆接種于5 mL抗性LB液體培養基中，37℃、220 r/min震蕩培養過夜。第二天將菌液按1∶1 000的接種于1 L LB液體培養基中，37℃、280 r/min震蕩培養至A600 nm約為0.5~1.0，加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)。誘導結束，7 000 g離心10 min收集菌體，用Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L，pH 8.0)懸浮，冰浴條件下超聲破菌，功率300~400 W，工作10 s間隔50 s。超聲破菌完成后，樣品于4℃、20 000 g離心15 min，收集破菌上清和沉淀。向破菌上清中加入Ni-NTA agarose凝膠，4℃緩慢振蕩結合3 h。然后按照凝膠使用說明洗掉雜蛋白，最后用300 mmol/L咪唑洗脫目的蛋白。
1.4 蛋白濃度的測定
參照Zor等[14]描述，用Bradford法測定mmTRAIL蛋白濃度。用牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)為標準蛋白，主要步驟如下：配制不同濃度(0、0.022、0.066、0.11、0.154、0.198和0.22 mg/mL)的BSA。在96孔板中加入10μL BSA，然后再加入考馬斯亮藍溶液100μL，室溫反應5 min后用酶標儀測定A595nm。以BSA濃度為橫坐標，對應A595nm值為縱坐標制作標準曲線并得到線性回歸方程。將樣品實測A595nm值帶入方程，即可計算出蛋白濃度。
1.5 重組蛋白對腫瘤細胞的體外殺傷活性測定
利用CCK-8法測定。CCK-8溶液中含水溶性四唑鹽-WST-8，在電子耦合劑存在的情況下，可被活細胞線粒體脫氫酶還原生成橙黃色的甲瓚。藥物細胞毒性越大，作用一定時間后存留的活細胞越少，加入CCK-8反應后溶液顏色越淺。對于同樣的細胞，溶液顏色的深淺和細胞數目呈良好線性關系。人結腸癌細胞COLO205和正常細胞BEA2b在含10%小牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、100μg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素的RPMI 1640中，于37℃、5% CO2條件下培養。將104個細胞接種于96孔板中，然后加入不同濃度的蛋白作用過夜，再加入10μL CCK-8溶液，37℃反應3~4 h后用酶標儀測定A495 nm。以未經蛋白處理的細胞存活率為100%計算蛋白處理組細胞存活率。
1.6 重組蛋白體內抗腫瘤效果分析
將生長狀態良好的COLO205細胞(1.5×106個/只)接種于裸鼠(BALB/c nu/nu mice，雌性)右側后肢皮下，共24只。定期測量瘤體長和寬(單位mm)，按公式計算腫瘤體積：長×寬2×0.5。待腫瘤生長至平均體積約150 mm3后，將裸鼠隨機分成三組。實驗組通過瘤內注射分別給予15 mg/kg和30 mg/kg mmTRAIL蛋白，連續給藥5 d。對照組給予相同體積的PBS。給藥后定期監測腫瘤大小和荷瘤率。
1.7 SDS-PAGE電泳和Western blot
十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl(lauryl)sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)參照Cai等[15]的方法，利用Bio-Rad mini Gel電泳系統完成。分離膠濃度為12.7%，濃縮膠濃度為4%。電泳時先用80 V恒壓30 min左右，待樣品進入分離膠后，將電壓調為120 V繼續電泳直至溴酚藍到達凝膠邊緣。凝膠直接用考馬斯亮藍染色顯示蛋白條帶。若要繼續進行Western blot檢測，電泳后凝膠用轉膜緩沖液(25 mmol/L Tris，192 mmol/L glycine，15%甲醇)平衡15 min。同時將聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜用甲醇浸潤，再用轉膜緩沖液平衡10 min。恒壓100 V轉膜1 h后，取出PVDF膜，用5%脫脂奶粉(溶于50 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.2)4℃封閉過夜。再將PVDF膜與小鼠抗His-tag抗體于37℃條件下共孵育2 h，洗膜6次(5 min/次)后再用辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠抗體孵育1 h。PVDF膜洗滌后加化學發光試劑顯影，用凝膠成像系統采集圖像。
2 結果
2.1 mmTRAIL基因的擴增
以恒河猴PBMCs來源的RNA為模板，根據GenBank預測的mmTRAIL全長分子編碼基因設計引物，首先通過RT-PCR擴增mmTRAIL全長基因。結果如圖 1(a)所示，擴增片段分子量介于750~1 000 bp之間，與預期片段大小符合。DNA測序結果表明，擴增片段與GenBank預測的mmTRAIL全長序列相同。根據mmTRAIL全長分子序列設計引物，進一步擴增由114~281位氨基酸組成可溶性mmTRAIL基因片段。結果如圖 1(b)所示，擴增獲得分子量大約為500 bp的片段。DNA測序證明序列正確。若未特別指明，后續文中所述mmTRAIL即為可溶性mmTRAIL。
圖1
RT-PCR擴增mmTRAIL全長(a)和可溶性胞外段(b)基因
M：DNA分子量標準；1：mmTRAIL全長基因; 2：mmTRAIL胞外段基因
Figure1. Amplification of the full length of mmTRAIL by RT-PCR (a) and soluble extracellular domain (b)M: DNA markers, 1: full length of mmTRAIL; 2 :extracellular domain of mmTRAIL
2.2 mmTRAIL表達質粒的構建
為方便克隆，在上游和下游PCR引物中分別添加BamHⅠ和KpnⅠ兩個酶切位點。PCR產物雙酶切后，與經相同酶切的pQE30質粒載體連接，獲得重組表達質粒pQE30-mmTRAIL。為驗證質粒的正確性，提取質粒再行雙酶切。結果發現，未經酶切的質粒顯示單一條帶[見圖 2(a), 2]，雙酶切的質粒在與mmTRAIL編碼基因大小相符的位置出現條帶[見圖 2(a)，1]，表明PCR產物成功插入pQE30。DNA序列分析進一步驗證了表達質粒的正確性。圖 2(b)顯示了mmTRAIL基因插入pQE30后的框架結構。由于載體本身引入了6His標簽，因此，表達后的mmTRAIL在N-末端也含有該標簽，可用Ni-NTA agarose親和層析分離純化重組蛋白。
圖2
pQE30-mmTRAIL質粒的構建
(a)pQE30-mmTRAIL質粒鑒定；M：DNA分子量標準；1：pQE30-mmTRAIL質粒雙酶切產物；2：pQE30-mmTRAIL質粒；(b)pQE30-mmTRAIL表達質粒結構示意圖
Figure2. Construction of pQE30-mmTRAIL palsmid(a) identification of pQE30-mmTRAIL plasmid; M: DNA marker; 1: plasmid digested with double restriction enzymes; 2: plasmid digested without enzyme; (b) schematic diagram of pQE30-mmTRAIL plasmid
2.3 mmTRAIL蛋白的誘導表達和分離純化
將含有pQE30-mmTRAIL的大腸桿菌M15接種到抗性培養基中，待細菌進入對數生長期后加入IPTG誘導蛋白表達。取誘導前后的菌體，提取細菌總蛋白電泳分析發現，誘導后細菌總蛋白中出現了含量明顯增加的蛋白條帶，分子量與目的蛋白預期分子量相符，提示目的蛋白獲得表達。進一步將誘導后的細菌超聲破碎，電泳分析破菌上清和沉淀蛋白，發現目的蛋白以包涵體和可溶蛋白兩種形式存在。破菌上清經Ni-NTA agarose親和層析，純化的蛋白在SDS-PAGE凝膠上顯示為單一條帶[見圖 3(a)，1]。Western blot分析進一步確證獲得的蛋白為mmTRAIL[見圖 3(a)，2]。還原狀態下，SDS-PAGE電泳顯示mmTRAIL分子量大約為20 kD，與預期單體分子量相符[見圖 3(a), 1]。但凝膠過濾層析發現，mmTRAIL的保留體積為10.59 mL[見圖 3(b)], BSA的保留體積為10.12 mL[見圖 3(c)]，提示mmTRAIL在溶液中的表觀分子量與BSA相近。BSA分子量為66 kD，而mmTRAIL單體分子量為20 kD，由此推測mmTRAIL在溶液里主要以三聚體形式存在。
圖3
mmTRAIL的分離純化
(a)純化后mmTRAIL的SDS-PAGE和Western blot。M:蛋白質分子量標準；1：SDS-PAGE電泳后考馬斯亮藍染色；2：Western blot (WB)；(b)mmTRAIL凝膠過濾層析；(c) BSA凝膠過濾層析
Figure3. Purification of recombinant protein(a) SDS-PAGE and Western blot of purified mmTRAIL. M: protein markers; 1: Coomassie brilliant blue staining after SDS-PAGE; 2: Western blot (WB); (b) size exclusion chromatography of mmTRAIL; (c) size exclusion chromatography of BSA
2.4 mmTRAIL對腫瘤細胞的選擇性殺傷作用
將細胞接種于96孔板中，加入不同濃度mmTRAIL處理過夜后，用CCK-8法測定細胞存活率。結果如圖 4(a)所示，隨著蛋白濃度提高，mmTRAIL對人結腸癌細胞COLO205的殺傷作用逐漸增強。而相同濃度mmTRAIL對正常細胞BEA2b無明顯殺傷作用。這表明mmTRAIL對腫瘤細胞有選擇性殺傷作用。
圖4
mmTRAIL對腫瘤細胞的選擇性殺傷作用
(a)mmTRAIL處理后腫瘤細胞COLO205的形態觀察；(b)mmTRAIL對腫瘤細胞COLO205和正常細胞BEA2b的殺傷作用
Figure4. Selective cytotoxicity of mmTRAIL in tumor cells(a) morphology of tumor cells COLO205 treated with mmTRAIL; (b) cytotoxicity of mmTRAIL in tumor cells COLO205 and normal cells BEA2b
2.5 mmTRAIL體內抗腫瘤作用
腫瘤細胞COLO205接種到裸鼠右后肢皮下。待腫瘤生長到平均體積大約為150 mm3時，將mmTRAIL蛋白直接注入瘤內，通過觀察腫瘤生長速度來判定蛋白抗腫瘤效果。結果發現，PBS對照組腫瘤生長快速，細胞接種后20 d，腫瘤平均體積達800 mm3(由于部分腫瘤過大開始破裂，不適合再繼續觀察，對照組裸鼠此時全部被處死)[見圖 5(a)(c)]。而在蛋白處理組，注射蛋白后，腫瘤迅速縮小[見圖 5(a)]。給藥一周后部分裸鼠瘤體消失(肉眼不見皮下突起)，荷瘤率開始下降[見圖 5(b)]。20 d后，蛋白處理組所有瘤體均消失且一直維持無瘤狀態[見圖 5(c)]。直至第30天，15 mg/kg處理組有1只裸鼠腫瘤重現，但瘤體生長緩慢。第49天時，15 mg/kg處理組共有2只裸鼠腫瘤重現。而30 mg/kg處理組直到實驗觀察結束時依舊沒有腫瘤重現。這些結果表明mmTRAIL具有抗腫瘤作用。
圖5
瘤內注射mmTRAIL的抗腫瘤作用
(a)瘤內注射mmTRAIL對COLO205腫瘤的生長抑制；(b)瘤內注射mmTRAIL對裸鼠荷瘤率的影響; (c)接種20 d，mmTRAIL(15 mg/kg)和PBS處理組實驗鼠瘤體觀察
Figure5. Antitumor activity of intratumorally injected mmTRAIL(a) growth inhibition of intratumorally injected mmTRAIL on COLO205 xenograft in mice; (b) tumor incidence in mice with intratumoral injection of mmTRAIL; (c) tumor xenografts on mmTRAIL-(15 mg/kg) and PBS-treated mice on Day 20 post-implantation
3 討論
本文克隆了mmTRAIL基因，并將其插入原核表達載體誘導表達獲得了重組蛋白。mmTRAIL與hTRAIL相似，在溶液中主要以三聚體形式存在。細胞毒性測試發現，mmTRAIL能殺傷人腫瘤細胞而對正常細胞無害，具有殺傷選擇性。在裸鼠荷瘤模型中，瘤內注射mmTRAIL對腫瘤有顯著生長抑制作用。這些初步研究提示，mmTRAIL作為抗腫瘤藥物，具有潛在研究和應用價值。
獲得足量蛋白是研究其功能的必要條件。眾所周知，大多數基因在大腸桿菌中的表達均以無活性的包涵體為主，通過包涵體復性獲得可溶蛋白工作量大，難度高[16]。本文研究的mmTRAIL在大腸桿菌中也主要以包涵體形式表達，獲得可溶蛋白較少，一定程度上限制了后續蛋白功能研究的進度。我們在后續工作中將嘗試利用畢赤酵母等真核表達系統來提高可溶蛋白產量。
前期臨床試驗發現，hTRAIL對多種腫瘤都有一定治療效果[8-9]。但動物試驗顯示，與傳統化療藥物聯用，效果可能更佳[10-11]。因此，尋求與hTRAIL具有協同效應的藥物組合，已成為新的研究熱點。當然，hTRAIL也面臨因體內半衰期短而降低抗腫瘤效果的問題。體外條件下，蛋白在很低的濃度(nmol級別)就對腫瘤細胞產生殺傷作用。但體內實驗仍需10 mg/kg左右才能顯示明確抗腫瘤效果。最近，有研究把hTRAIL與人IgG1抗體Fc段融合，通過延長半衰期而產生增效作用[17]。mmTRAIL與hTRAIL抗腫瘤特性高度相似，同樣具有開發應用價值。但mmTRAIL與hTRAIL也可能面臨相同的問題。因此，還需對其作用機制、作用范圍和體內抗腫瘤效果、藥物穩定性和藥代動力學、生物安全性等內容進行深入研究后，才能評價其作為新型腫瘤藥物的可能性。
