研究間接共培養條件下肝癌細胞培養基對血管內皮細胞增殖及血管生成能力的影響, 初步探討腫瘤微環境下血管新生的分子機制。體外培養人臍靜脈內皮細胞株EA.hy926, 與肝癌細胞株HepG2條件培養基進行共培養; 四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測肝癌細胞條件培養基對血管內皮細胞增殖的影響; 血管管腔形成實驗檢測血管內皮細胞的血管生成能力。Western blot測定肝癌細胞條件培養基對血管內皮EA.hy926細胞血管內皮生長因子(VEGF)及其受體Flk-1表達的影響。結果表明, EA.hy926細胞經HepG2條件培養基處理后, 其增殖能力明顯增加。接種于Matrigel膠的EA.hy926細胞經HepG2條件培養基刺激后, 形成管腔數目增加, 成血管能力明顯增強; 同時, 其胞內VEGF及其受體Flk-1的表達呈時間依賴性上調。腫瘤微環境下肝癌細胞作用于血管內皮細胞, 可促進血管內皮細胞的增殖并提高其血管生成能力。
引用本文： 夏慶, 尹紅梅, 沈陽, 劉靜霞, 閆志平, 洪錦勇, 周法庭, 劉肖珩. 肝癌腫瘤微環境對血管內皮細胞增殖及血管生成能力的影響. 生物醫學工程學雜志, 2015, 32(3): 612-617. doi: 10.7507/1001-5515.20150111 復制
引言
腫瘤轉移(tumor metastasis)是造成術后化療和放療失敗的重要原因，亦為患者死亡的根本原因[1]。腫瘤細胞的轉移是一個多階梯瀑布過程，主要包括早期原發癌生長、腫瘤血管形成(tumor angiogenesis)、腫瘤細胞脫落、遷移并侵入基質和進入脈管系統等過程[2-3]。其中血管新生(angiogenesis)為腫瘤細胞提供氧氣、營養物質和保障腫瘤細胞生長，是腫瘤發生轉移的必要條件。肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC，簡稱肝癌)是發生于肝臟組織的惡性腫瘤，也是臨床上常見的惡性腫瘤之一。HCC是典型的血管富集的實體腫瘤，其發生、發展、侵襲以及轉移都與腫瘤血管新生密切相關[4]。血管新生是指在已存在的血管上形成新的血管，其中腫瘤血管新生對腫瘤生長和轉移至關重要，一方面新生血管為腫瘤生長提供營養和氧氣供給以及廢物排泄途徑；另一方面，新生血管的形成也為腫瘤提供了轉移通道。一般情況下，直徑超過2 mm的腫瘤若沒有形成新生血管則不會正常生長[5]。因此，以腫瘤內血管生成為靶點的治療逐漸成為重要的抗腫瘤策略[6]。
腫瘤的生長除了血管新生外，還必須有適合其生長的微環境，這種微環境稱為腫瘤微環境(tumor microenvironment，TME)[7]。腫瘤微環境是腫瘤細胞產生和存活所處的內部環境，包括腫瘤細胞、血管內皮細胞(vascular endothelial cells，VECs)等細胞成分，以及存在于腫瘤附近區域的細胞間質和生長因子等生物大分子，如血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)和表皮細胞生長因子(epidermal growth factor, EGF)。此外，腫瘤所處低氧環境、酸性環境等條件構成了腫瘤的物理微環境[8]。以往的研究均集中在某單一因子對血管生成的影響，而對于復雜多因子所構成的腫瘤微環境對血管內皮細胞的增殖及血管生成能力及其受配體研究還鮮有報道。
腫瘤細胞與腫瘤內的血管內皮細胞是腫瘤微環境的主要細胞成分，其相互作用貫穿于腫瘤內血管新生的整個過程。腫瘤內血管的形成是一個復雜過程，受促血管形成生長因子和血管抑制因子的雙重調控[9-10]。腫瘤細胞分泌VEGF、EGF、血管抑制素和內皮抑制素等多種生長因子，通過VEGF/VEGFR、Notch等信號通路作用于VECs，調控VECs的增殖和血管形成能力[11]。其中VEGF-A是目前研究較多的血管生長因子，它是血管生成的有效刺激物，因為在這種生長因子的存在下，內皮細胞將增殖并遷移，最終形成管狀結構樣的毛細血管[12]。VEGF-A與內皮細胞上的受體結合，激活下游信號分子。PI3K和FAK作為VEGF/VEGFR信號通路的下游信號分子，前者通過PIP3、PDK1、Akt、eNOS增加一氧化氮(Nitrogen monoxide, NO)的分泌，促進血管舒張；后者通過Vinculin、Talin、Paxillin等粘著斑蛋白復合物促進粘著斑的裝配和轉換，最終引起血管新生[13]。
由于微環境中富含多種血管生成因子，而共培養是研究腫瘤細胞與血管內皮細胞相互作用較好的模型[14]。因此，在本研究中，我們采用間接共培養方法，體外模擬肝癌血管內皮細胞復雜的微環境，研究肝癌細胞HepG2細胞釋放的多種細胞因子對EA.hy926細胞增殖以及血管生成的影響，旨在為腫瘤的抗血管治療以及進一步研究腫瘤細胞、血管內皮細胞相互作用的分子機制提供實驗依據。
1 材料
本研究所采用的肝癌細胞株HepG2和人臍靜脈內皮細胞株EA.hy926為本實驗室常規培養；RPMI 1640培養基購自Invitrogen公司；胰蛋白酶購自Thermo公司；胎牛血清購自復蒙基因生物科技有限公司；白介素-8(Interleukin-8，IL-8)購自Millipore公司；PI3K抑制劑(LY294002)購自碧云天生物技術研究所；FAK抑制劑、HAT培養基添加劑(HAT Supplement)購自Sigma公司。
2 方法
2.1 HepG2細胞和EA.hy926細胞的培養
HepG2細胞和EA.hy926細胞的鑒定由本實驗室前期工作完成。HepG2細胞用含10%胎牛血清和100 U/mL青霉素和鏈霉素的RPMI 1640培養基進行培養；EA.hy926細胞用含10%胎牛血清、2% HAT和100 U/mL青霉素和鏈霉素的RPMI 1640培養基進行培養；HepG2細胞和EA.hy926細胞置于37℃、5% CO2的孵箱中于飽和濕度條件下靜置培養。待細胞達80%~90%融合度時，用0.25%胰酶消化、傳代。實驗取對數生長期細胞。
2.2 HepG2細胞條件培養基制備
HepG2細胞融合度達90%時，棄去原培養基，用PBS緩沖液清洗3遍后加入無血清RPMI 1640培養基過夜饑餓處理，次日收集培養基于1000 r/min離心10 min，去除培養基中的殘余細胞取上清液，即為HepG2細胞條件培養基(HepG2 conditioned medium)，置于-20℃保存備用。
2.3 四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測細胞增殖
收集對數生長期EA.hy926細胞，以每孔100μL細胞懸液(2.5×105個/mL)接種于96孔板中，過夜培養，吸出培養基，實驗組加入100μL HepG2細胞條件培養基，對照組加入100μL無血清RPMI 1640培養基，同時以只加入100μL無菌PBS緩沖液的孔做為調零孔，每組設置平行5孔。根據EA.hy926接種濃度及其生長特性，隨著時間的延長細胞會由增殖期漸漸趨向G0期而趨于靜止，影響實驗結果，所以選擇37℃、5% CO2條件下連續培養24 h。培養24 h后吸走孔內培養基，每孔加入20μL MTT，37℃、5% CO2培養4 h后孔內形成紫色結晶，每孔加入150μL二甲亞砜(DMSO)，震蕩混勻使結晶充分溶解，在酶聯免疫檢測儀(ST-360, 上海科華實驗系統有限公司)490 nm波長處測量各孔的吸光值(A)。實驗重復3次。根據以下公式計算細胞的增殖率：細胞增殖率(P)=(實驗組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)×100%。
2.4 小管實驗檢測血管內皮細胞的血管生成能力
每孔50μL Matirgel膠(10 ng/mL)加入96孔板中，于37℃、5% CO2中靜置30 min使Matirgel膠充分凝固。取對數生長期的EA.hy926細胞，胰酶消化將細胞制成細胞懸液，用細胞計數板計數并稀釋至2×106個/mL，每孔加入50μL細胞懸液，用槍頭輕輕吹打使細胞均勻分布。實驗分為對照組和實驗組，其中對照組包括無血清RPMI 1640培養基組和IL-8組(使用無血清RPMI 1640培養基稀釋，100 ng/mL)，本實驗中將無血清RPMI 1640培養基組設為空白對照組，而IL-8組為陽性對照組。實驗組包括HepG2細胞條件培養基組、PI3K抑制劑組(使用HepG2細胞條件培養基稀釋，10μmol/L)和FAK抑制劑組(使用HepG2細胞條件培養基稀釋，50 nmol/mL)。根據本實驗室前期實驗結果，將各組樣品處理的細胞置于37℃、5% CO2中孵育4 h之后，每組在倒置相差顯微鏡(Olympus，CK2型，日本Olympus)下觀察并隨機選取5個視野，拍照并選取5個40倍視野下的管腔數目進行計數。實驗重復3次。
2.5 Western blot檢測VEGF及其受體Flk-1表達
當培養瓶中EA.hy926細胞生長至90%融合度后，棄去原培養基，無菌PBS緩沖液清洗3次。加入HepG2細胞條件培養基，分別設置對照組(使用無血清RPMI 1640培養基處理)、15 s、30 s、5 min、15 min、30 min、60 min共計7組，在各時間點收集總蛋白，BCA法蛋白定量后，95℃變性，經凝膠電泳、轉膜、封閉后孵育對應一抗(1 :200)，4℃過夜。TBST洗滌一抗3遍，室溫孵育二抗(1 :5 000)2 h，TBST洗滌二抗3遍后加入增強化學發光液(enhanced chemiluminescence, ECL)并于凝膠成像儀(ChemiDoc TM XRS+with Image LabTM, Bio-Rad, Inc., USA)下顯影呈現，使用Image J圖像分析軟件分析結果。實驗重復3次。
2.6 統計學方法
所有對照組實驗數據轉化為100%，同時實驗組以相同比例轉化。采用SPSS 13.0統計學軟件，對實驗數據進行單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統計學意義。
3 結果
3.1 HepG2細胞對EA.hy926細胞的增殖作用的影響
HepG2細胞可分泌VEGF、EGF等多種細胞生長因子促進血管內皮細胞增殖。MTT實驗結果表明，對照組細胞增殖率為100.0%±1.2%，實驗組細胞增殖率為111.0%±2.2%(P＜0.05)。由此可見HepG2細胞的條件培養基作用于EA.hy926細胞24 h后，對EA.hy926細胞的增殖具有顯著的促進作用。
3.2 HepG2細胞條件培養基對EA.hy926血管內皮細胞血管生成能力的影響
圖 1顯示EA.hy926血管內皮細胞管腔形成的實驗結果。由圖 1a可以看出，無血清RPMI 1640組和IL-8組處理細胞4 h后，無血清RPMI 1640組的EA.hy926血管內皮細胞在Matirgel膠上呈管腔樣分布，形成類血管樣結構，但數量較少且管腔直徑小；而IL-8組中，EA.hy926細胞形成小管樣結構數量多且管腔直徑大[見圖 1(a)]，小管數目153.6±12.1，與無血清RPMI 1640組比較差異有統計學意義(P＜0.05)。
圖1
HepG2條件培養基對EA.hy926細胞血管生成能力的影響
(a)IL-8、HepG2培養基、PI3K抑制劑和FAK抑制劑對EA.hy926細胞血管生生影響，圖中標尺500μm；(b)平均管腔數量統計結果
Figure1. Effect of HepG2 conditioned medium on the vascular angiogenesis of EA.hy926 cells(a) the tuber formation of EA.hy926 cells stimulated by IL-8, HepG2 conditioned medium, PI3K inhibitors and FAK inhibitor; Scale bar=500μm; (b) the results of average number of tubes
使用HepG2細胞的條件培養基培養EA.hy926細胞，4 h后EA.hy926細胞呈與IL-8相似的變化，細胞呈管腔樣分布，形成小管樣結構，管腔數量與IL-8組相比較少(見圖 1b)，小管數目為135.2±10.4，但與無血清RPMI 1640組比較有明顯差異(P＜0.05)，證明了HepG2細胞條件培養基能夠增強EA.hy926細胞的血管生成能力。而加入PI3K抑制劑或FAK抑制劑的EA.hy926血管內皮細胞分布散亂，均沒有形成小管樣結構，如見圖 1(a)所示，該結果表明胞內PI3K和FAK信號軸均參與了HepG2細胞條件培養基誘導的EA.hy926血管內皮細胞血管新生。
3.3 HepG2細胞條件培養基對VEGF及其受體Flk-1表達的影響
采用Western blot檢測在不同時間點(0 s、15 s、30 s、5 min、15 min、30 min、60 min)，EA.hy926細胞胞內VEGF及其受體Flk-1的表達。由圖 2可以看出，隨著HepG2細胞條件培養基作用于EA.hy926細胞時間的增加，VEGF的表達水平在初始階段(15 s)降低，在5 min后逐漸升高，至30 min時超過對照組。而VEGF受體Flk-1蛋白表達在初始階段即呈現出顯著上調，并在隨后的1h內逐漸升高，則呈明顯的時間依賴性上調趨勢。我們推測，VEGF的表達水平在初始階段降低的原因可能是受到HepG2細胞條件培養基作用后，HepG2細胞條件培養基中存在的VEGF使EA.hy926細胞胞外VEGF的濃度增高，而VEGF為分泌型細胞因子，胞外高濃度的VEGF使EA.hy926細胞暫停合成分泌VEGF，而后隨著胞外VEGF以及其他細胞因子作用于EA.hy926細胞，胞外VEGF的含量降低，EA.hy926細胞又開始合成分泌VEGF，這導致初始階段胞內VEGF的含量降低，而后胞內VEGF的合成繼續進行，直至表達量高于對照組。
圖2
HepG2細胞條件培養基對EA.hy926細胞VEGF及其受體Flk-1的影響
(a)VEGF及其受體Flk-1的表達; (b)根據(a)中的蛋白條帶灰度值統計得到的相對于內參β-actin的表達
Figure2. Effects of HepG2 conditioned medium on the expression of VEGF and Flk-1(a) Western blot bands of VEGF and Flk-1; (b) quantification of each protein expression level by image analysis of the Western blot bands. The expression ofβ-actin in each group was used as intrinsic controls, and relative expression of VEGF and Flk-1 were calculated
4 討論
肝癌是最常見的消化道腫瘤，在癌癥引起的死亡率位居第二位[15]。我國肝癌的發生率和死亡率一直較高，每年我國的肝癌患者約占全世界的54%左右，因此尋求積極有效的肝癌治療方法迫不及待。
遷移性是惡性腫瘤細胞最顯著的基本特性之一，同時也是臨床肝癌治療的難點。肝癌有較高的轉移率和復發率，轉移后的腫瘤具有更強的致死性[16]。腫瘤血管生成是腫瘤生長轉移的關鍵步驟，對腫瘤生長和轉移至關重要，也是臨床腫瘤治療的重要靶標。一方面，新生血管為腫瘤生長提供營養和氧氣供給以及廢物排泄途徑；另一方面，新生血管的形成也為腫瘤提供了轉移通道。腫瘤血管生成是多種細胞因子和細胞參與調控的過程，其中細胞因子主要包括促血管形成生長因子和血管生成抑制因子。常見促血管形成生長因子的有VEGF、EGF、轉化生長因子(transforming growth factor-β, TGF-β)、IL-8和NO等，這些生長因子不僅可刺激血管內皮細胞增殖，而且抑制其凋亡。血管抑制素、內皮抑制素和腫瘤抑制素等都能誘導內皮細胞凋亡，進而引起血管退化。肝臟血流豐富，受肝動脈和門靜脈雙重血供，因此肝癌的血管生成作用最為典型[17]。同時，新生血管也為肝癌細胞進入循環系統提供通道，從而促進了肝癌的轉移。腫瘤細胞與血管內皮細胞相互作用，腫瘤細胞可分泌血管生長因子促進血管新生，而血管內皮細胞增多后，為腫瘤細胞生長提供氧氣和營養物質，保障腫瘤細胞生長。因此，共同培養兩種細胞的研究模式能較好的反映兩者相互作用的分子機制。Chen等[18]分別將VEGF121、VEGF156和eNO轉入平滑肌細胞(smooth musclce cells，SMCs)中，單獨培養或共培養SMCcont與內皮細胞(endothelial cells，ECs)，ECs增殖不明顯，而在ECs與SMCVEGF121或SMCeNO共培養后，ECs明顯增殖，且形成較多的小管結構；加入NO阻斷劑后，上述變化被抑制。本研究采用間接共同培養模式，體外模擬肝癌血管內皮細胞所處的微環境，研究肝癌腫瘤微環境對血管內皮細胞增殖以及血管生成的影響。本實驗首先通過MTT實驗發現，HepG2細胞的條件培養基可以明顯地促進EA.hy926細胞增殖，說明肝癌細胞釋放到腫瘤微環境中的某些因子可以促進血管內皮細胞的增殖。而同時小管實驗也發現HepG2細胞的條件培養基可以促進EA.hy926細胞生成管腔狀結構，這說明這些由肝癌細胞釋放到腫瘤微環境中的因子還可以促進血管內皮細胞生成新生血管。這些現象會不會與促血管生成因子相關呢？
最具代表性的促血管生成因子是VEGF，它在肝癌中高度表達，主要為VEGF121和VEGF165。VEGF通過與其受體VEGFR相結合從而發揮生物學作用，VEGF主要于Flt-1和Flk-1相結合[19]。Flk-1是VEGF介導的促進肝癌發展和血管生成的主要受體[20]。VEGF與VEGFR結合，激活級聯酪氨酸激酶信號轉導通路，釋放相關細胞因子、生長因子和相關酶類，促進腫瘤血管內皮細胞表型變化、增殖、遷移、提高血管通透性，最終促使新生血管形成[21]。本實驗假設肝癌細胞通過促進血管內皮細胞VEGF及其受體Flk-1的表達使血管內皮細胞增殖和血管生成。因為細胞對于其所處環境的變化非常敏感，主要表現在其胞內關鍵信號基因和蛋白在較短時間(＜5 s)即可迅速作出響應，所以本實驗選擇1h內的EA.hy926細胞胞內蛋白的變化。通過Western blot實驗發現血管內皮細胞中VEGF及其受體Flk-1的表達呈時間依賴性上調，說明血管內皮細胞增殖以及血管生成與VEGF及其受體Flk-1表達上調與相關，而這些都是由肝癌細胞對血管內皮細胞的作用。以上結果表明肝癌腫瘤微環境不僅可以促進血管內皮細胞的增殖，而且使血管內皮細胞VEGF及其受體Flk-1表達的升高，從而進一步促進了血管內皮細胞的血管生成能力，為肝癌腫瘤的生長提供有利條件。本實驗通過間接共同培養模式，發現了肝癌腫瘤微環境對血管內皮細胞的作用，同時也為肝癌的靶向治療提供一定的理論依據。
引言
腫瘤轉移(tumor metastasis)是造成術后化療和放療失敗的重要原因，亦為患者死亡的根本原因[1]。腫瘤細胞的轉移是一個多階梯瀑布過程，主要包括早期原發癌生長、腫瘤血管形成(tumor angiogenesis)、腫瘤細胞脫落、遷移并侵入基質和進入脈管系統等過程[2-3]。其中血管新生(angiogenesis)為腫瘤細胞提供氧氣、營養物質和保障腫瘤細胞生長，是腫瘤發生轉移的必要條件。肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC，簡稱肝癌)是發生于肝臟組織的惡性腫瘤，也是臨床上常見的惡性腫瘤之一。HCC是典型的血管富集的實體腫瘤，其發生、發展、侵襲以及轉移都與腫瘤血管新生密切相關[4]。血管新生是指在已存在的血管上形成新的血管，其中腫瘤血管新生對腫瘤生長和轉移至關重要，一方面新生血管為腫瘤生長提供營養和氧氣供給以及廢物排泄途徑；另一方面，新生血管的形成也為腫瘤提供了轉移通道。一般情況下，直徑超過2 mm的腫瘤若沒有形成新生血管則不會正常生長[5]。因此，以腫瘤內血管生成為靶點的治療逐漸成為重要的抗腫瘤策略[6]。
腫瘤的生長除了血管新生外，還必須有適合其生長的微環境，這種微環境稱為腫瘤微環境(tumor microenvironment，TME)[7]。腫瘤微環境是腫瘤細胞產生和存活所處的內部環境，包括腫瘤細胞、血管內皮細胞(vascular endothelial cells，VECs)等細胞成分，以及存在于腫瘤附近區域的細胞間質和生長因子等生物大分子，如血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)和表皮細胞生長因子(epidermal growth factor, EGF)。此外，腫瘤所處低氧環境、酸性環境等條件構成了腫瘤的物理微環境[8]。以往的研究均集中在某單一因子對血管生成的影響，而對于復雜多因子所構成的腫瘤微環境對血管內皮細胞的增殖及血管生成能力及其受配體研究還鮮有報道。
腫瘤細胞與腫瘤內的血管內皮細胞是腫瘤微環境的主要細胞成分，其相互作用貫穿于腫瘤內血管新生的整個過程。腫瘤內血管的形成是一個復雜過程，受促血管形成生長因子和血管抑制因子的雙重調控[9-10]。腫瘤細胞分泌VEGF、EGF、血管抑制素和內皮抑制素等多種生長因子，通過VEGF/VEGFR、Notch等信號通路作用于VECs，調控VECs的增殖和血管形成能力[11]。其中VEGF-A是目前研究較多的血管生長因子，它是血管生成的有效刺激物，因為在這種生長因子的存在下，內皮細胞將增殖并遷移，最終形成管狀結構樣的毛細血管[12]。VEGF-A與內皮細胞上的受體結合，激活下游信號分子。PI3K和FAK作為VEGF/VEGFR信號通路的下游信號分子，前者通過PIP3、PDK1、Akt、eNOS增加一氧化氮(Nitrogen monoxide, NO)的分泌，促進血管舒張；后者通過Vinculin、Talin、Paxillin等粘著斑蛋白復合物促進粘著斑的裝配和轉換，最終引起血管新生[13]。
由于微環境中富含多種血管生成因子，而共培養是研究腫瘤細胞與血管內皮細胞相互作用較好的模型[14]。因此，在本研究中，我們采用間接共培養方法，體外模擬肝癌血管內皮細胞復雜的微環境，研究肝癌細胞HepG2細胞釋放的多種細胞因子對EA.hy926細胞增殖以及血管生成的影響，旨在為腫瘤的抗血管治療以及進一步研究腫瘤細胞、血管內皮細胞相互作用的分子機制提供實驗依據。
1 材料
本研究所采用的肝癌細胞株HepG2和人臍靜脈內皮細胞株EA.hy926為本實驗室常規培養；RPMI 1640培養基購自Invitrogen公司；胰蛋白酶購自Thermo公司；胎牛血清購自復蒙基因生物科技有限公司；白介素-8(Interleukin-8，IL-8)購自Millipore公司；PI3K抑制劑(LY294002)購自碧云天生物技術研究所；FAK抑制劑、HAT培養基添加劑(HAT Supplement)購自Sigma公司。
2 方法
2.1 HepG2細胞和EA.hy926細胞的培養
HepG2細胞和EA.hy926細胞的鑒定由本實驗室前期工作完成。HepG2細胞用含10%胎牛血清和100 U/mL青霉素和鏈霉素的RPMI 1640培養基進行培養；EA.hy926細胞用含10%胎牛血清、2% HAT和100 U/mL青霉素和鏈霉素的RPMI 1640培養基進行培養；HepG2細胞和EA.hy926細胞置于37℃、5% CO2的孵箱中于飽和濕度條件下靜置培養。待細胞達80%~90%融合度時，用0.25%胰酶消化、傳代。實驗取對數生長期細胞。
2.2 HepG2細胞條件培養基制備
HepG2細胞融合度達90%時，棄去原培養基，用PBS緩沖液清洗3遍后加入無血清RPMI 1640培養基過夜饑餓處理，次日收集培養基于1000 r/min離心10 min，去除培養基中的殘余細胞取上清液，即為HepG2細胞條件培養基(HepG2 conditioned medium)，置于-20℃保存備用。
2.3 四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測細胞增殖
收集對數生長期EA.hy926細胞，以每孔100μL細胞懸液(2.5×105個/mL)接種于96孔板中，過夜培養，吸出培養基，實驗組加入100μL HepG2細胞條件培養基，對照組加入100μL無血清RPMI 1640培養基，同時以只加入100μL無菌PBS緩沖液的孔做為調零孔，每組設置平行5孔。根據EA.hy926接種濃度及其生長特性，隨著時間的延長細胞會由增殖期漸漸趨向G0期而趨于靜止，影響實驗結果，所以選擇37℃、5% CO2條件下連續培養24 h。培養24 h后吸走孔內培養基，每孔加入20μL MTT，37℃、5% CO2培養4 h后孔內形成紫色結晶，每孔加入150μL二甲亞砜(DMSO)，震蕩混勻使結晶充分溶解，在酶聯免疫檢測儀(ST-360, 上海科華實驗系統有限公司)490 nm波長處測量各孔的吸光值(A)。實驗重復3次。根據以下公式計算細胞的增殖率：細胞增殖率(P)=(實驗組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)×100%。
2.4 小管實驗檢測血管內皮細胞的血管生成能力
每孔50μL Matirgel膠(10 ng/mL)加入96孔板中，于37℃、5% CO2中靜置30 min使Matirgel膠充分凝固。取對數生長期的EA.hy926細胞，胰酶消化將細胞制成細胞懸液，用細胞計數板計數并稀釋至2×106個/mL，每孔加入50μL細胞懸液，用槍頭輕輕吹打使細胞均勻分布。實驗分為對照組和實驗組，其中對照組包括無血清RPMI 1640培養基組和IL-8組(使用無血清RPMI 1640培養基稀釋，100 ng/mL)，本實驗中將無血清RPMI 1640培養基組設為空白對照組，而IL-8組為陽性對照組。實驗組包括HepG2細胞條件培養基組、PI3K抑制劑組(使用HepG2細胞條件培養基稀釋，10μmol/L)和FAK抑制劑組(使用HepG2細胞條件培養基稀釋，50 nmol/mL)。根據本實驗室前期實驗結果，將各組樣品處理的細胞置于37℃、5% CO2中孵育4 h之后，每組在倒置相差顯微鏡(Olympus，CK2型，日本Olympus)下觀察并隨機選取5個視野，拍照并選取5個40倍視野下的管腔數目進行計數。實驗重復3次。
2.5 Western blot檢測VEGF及其受體Flk-1表達
當培養瓶中EA.hy926細胞生長至90%融合度后，棄去原培養基，無菌PBS緩沖液清洗3次。加入HepG2細胞條件培養基，分別設置對照組(使用無血清RPMI 1640培養基處理)、15 s、30 s、5 min、15 min、30 min、60 min共計7組，在各時間點收集總蛋白，BCA法蛋白定量后，95℃變性，經凝膠電泳、轉膜、封閉后孵育對應一抗(1 :200)，4℃過夜。TBST洗滌一抗3遍，室溫孵育二抗(1 :5 000)2 h，TBST洗滌二抗3遍后加入增強化學發光液(enhanced chemiluminescence, ECL)并于凝膠成像儀(ChemiDoc TM XRS+with Image LabTM, Bio-Rad, Inc., USA)下顯影呈現，使用Image J圖像分析軟件分析結果。實驗重復3次。
2.6 統計學方法
所有對照組實驗數據轉化為100%，同時實驗組以相同比例轉化。采用SPSS 13.0統計學軟件，對實驗數據進行單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統計學意義。
3 結果
3.1 HepG2細胞對EA.hy926細胞的增殖作用的影響
HepG2細胞可分泌VEGF、EGF等多種細胞生長因子促進血管內皮細胞增殖。MTT實驗結果表明，對照組細胞增殖率為100.0%±1.2%，實驗組細胞增殖率為111.0%±2.2%(P＜0.05)。由此可見HepG2細胞的條件培養基作用于EA.hy926細胞24 h后，對EA.hy926細胞的增殖具有顯著的促進作用。
3.2 HepG2細胞條件培養基對EA.hy926血管內皮細胞血管生成能力的影響
圖 1顯示EA.hy926血管內皮細胞管腔形成的實驗結果。由圖 1a可以看出，無血清RPMI 1640組和IL-8組處理細胞4 h后，無血清RPMI 1640組的EA.hy926血管內皮細胞在Matirgel膠上呈管腔樣分布，形成類血管樣結構，但數量較少且管腔直徑小；而IL-8組中，EA.hy926細胞形成小管樣結構數量多且管腔直徑大[見圖 1(a)]，小管數目153.6±12.1，與無血清RPMI 1640組比較差異有統計學意義(P＜0.05)。
圖1
HepG2條件培養基對EA.hy926細胞血管生成能力的影響
(a)IL-8、HepG2培養基、PI3K抑制劑和FAK抑制劑對EA.hy926細胞血管生生影響，圖中標尺500μm；(b)平均管腔數量統計結果
Figure1. Effect of HepG2 conditioned medium on the vascular angiogenesis of EA.hy926 cells(a) the tuber formation of EA.hy926 cells stimulated by IL-8, HepG2 conditioned medium, PI3K inhibitors and FAK inhibitor; Scale bar=500μm; (b) the results of average number of tubes
使用HepG2細胞的條件培養基培養EA.hy926細胞，4 h后EA.hy926細胞呈與IL-8相似的變化，細胞呈管腔樣分布，形成小管樣結構，管腔數量與IL-8組相比較少(見圖 1b)，小管數目為135.2±10.4，但與無血清RPMI 1640組比較有明顯差異(P＜0.05)，證明了HepG2細胞條件培養基能夠增強EA.hy926細胞的血管生成能力。而加入PI3K抑制劑或FAK抑制劑的EA.hy926血管內皮細胞分布散亂，均沒有形成小管樣結構，如見圖 1(a)所示，該結果表明胞內PI3K和FAK信號軸均參與了HepG2細胞條件培養基誘導的EA.hy926血管內皮細胞血管新生。
3.3 HepG2細胞條件培養基對VEGF及其受體Flk-1表達的影響
采用Western blot檢測在不同時間點(0 s、15 s、30 s、5 min、15 min、30 min、60 min)，EA.hy926細胞胞內VEGF及其受體Flk-1的表達。由圖 2可以看出，隨著HepG2細胞條件培養基作用于EA.hy926細胞時間的增加，VEGF的表達水平在初始階段(15 s)降低，在5 min后逐漸升高，至30 min時超過對照組。而VEGF受體Flk-1蛋白表達在初始階段即呈現出顯著上調，并在隨后的1h內逐漸升高，則呈明顯的時間依賴性上調趨勢。我們推測，VEGF的表達水平在初始階段降低的原因可能是受到HepG2細胞條件培養基作用后，HepG2細胞條件培養基中存在的VEGF使EA.hy926細胞胞外VEGF的濃度增高，而VEGF為分泌型細胞因子，胞外高濃度的VEGF使EA.hy926細胞暫停合成分泌VEGF，而后隨著胞外VEGF以及其他細胞因子作用于EA.hy926細胞，胞外VEGF的含量降低，EA.hy926細胞又開始合成分泌VEGF，這導致初始階段胞內VEGF的含量降低，而后胞內VEGF的合成繼續進行，直至表達量高于對照組。
圖2
HepG2細胞條件培養基對EA.hy926細胞VEGF及其受體Flk-1的影響
(a)VEGF及其受體Flk-1的表達; (b)根據(a)中的蛋白條帶灰度值統計得到的相對于內參β-actin的表達
Figure2. Effects of HepG2 conditioned medium on the expression of VEGF and Flk-1(a) Western blot bands of VEGF and Flk-1; (b) quantification of each protein expression level by image analysis of the Western blot bands. The expression ofβ-actin in each group was used as intrinsic controls, and relative expression of VEGF and Flk-1 were calculated
4 討論
肝癌是最常見的消化道腫瘤，在癌癥引起的死亡率位居第二位[15]。我國肝癌的發生率和死亡率一直較高，每年我國的肝癌患者約占全世界的54%左右，因此尋求積極有效的肝癌治療方法迫不及待。
遷移性是惡性腫瘤細胞最顯著的基本特性之一，同時也是臨床肝癌治療的難點。肝癌有較高的轉移率和復發率，轉移后的腫瘤具有更強的致死性[16]。腫瘤血管生成是腫瘤生長轉移的關鍵步驟，對腫瘤生長和轉移至關重要，也是臨床腫瘤治療的重要靶標。一方面，新生血管為腫瘤生長提供營養和氧氣供給以及廢物排泄途徑；另一方面，新生血管的形成也為腫瘤提供了轉移通道。腫瘤血管生成是多種細胞因子和細胞參與調控的過程，其中細胞因子主要包括促血管形成生長因子和血管生成抑制因子。常見促血管形成生長因子的有VEGF、EGF、轉化生長因子(transforming growth factor-β, TGF-β)、IL-8和NO等，這些生長因子不僅可刺激血管內皮細胞增殖，而且抑制其凋亡。血管抑制素、內皮抑制素和腫瘤抑制素等都能誘導內皮細胞凋亡，進而引起血管退化。肝臟血流豐富，受肝動脈和門靜脈雙重血供，因此肝癌的血管生成作用最為典型[17]。同時，新生血管也為肝癌細胞進入循環系統提供通道，從而促進了肝癌的轉移。腫瘤細胞與血管內皮細胞相互作用，腫瘤細胞可分泌血管生長因子促進血管新生，而血管內皮細胞增多后，為腫瘤細胞生長提供氧氣和營養物質，保障腫瘤細胞生長。因此，共同培養兩種細胞的研究模式能較好的反映兩者相互作用的分子機制。Chen等[18]分別將VEGF121、VEGF156和eNO轉入平滑肌細胞(smooth musclce cells，SMCs)中，單獨培養或共培養SMCcont與內皮細胞(endothelial cells，ECs)，ECs增殖不明顯，而在ECs與SMCVEGF121或SMCeNO共培養后，ECs明顯增殖，且形成較多的小管結構；加入NO阻斷劑后，上述變化被抑制。本研究采用間接共同培養模式，體外模擬肝癌血管內皮細胞所處的微環境，研究肝癌腫瘤微環境對血管內皮細胞增殖以及血管生成的影響。本實驗首先通過MTT實驗發現，HepG2細胞的條件培養基可以明顯地促進EA.hy926細胞增殖，說明肝癌細胞釋放到腫瘤微環境中的某些因子可以促進血管內皮細胞的增殖。而同時小管實驗也發現HepG2細胞的條件培養基可以促進EA.hy926細胞生成管腔狀結構，這說明這些由肝癌細胞釋放到腫瘤微環境中的因子還可以促進血管內皮細胞生成新生血管。這些現象會不會與促血管生成因子相關呢？
最具代表性的促血管生成因子是VEGF，它在肝癌中高度表達，主要為VEGF121和VEGF165。VEGF通過與其受體VEGFR相結合從而發揮生物學作用，VEGF主要于Flt-1和Flk-1相結合[19]。Flk-1是VEGF介導的促進肝癌發展和血管生成的主要受體[20]。VEGF與VEGFR結合，激活級聯酪氨酸激酶信號轉導通路，釋放相關細胞因子、生長因子和相關酶類，促進腫瘤血管內皮細胞表型變化、增殖、遷移、提高血管通透性，最終促使新生血管形成[21]。本實驗假設肝癌細胞通過促進血管內皮細胞VEGF及其受體Flk-1的表達使血管內皮細胞增殖和血管生成。因為細胞對于其所處環境的變化非常敏感，主要表現在其胞內關鍵信號基因和蛋白在較短時間(＜5 s)即可迅速作出響應，所以本實驗選擇1h內的EA.hy926細胞胞內蛋白的變化。通過Western blot實驗發現血管內皮細胞中VEGF及其受體Flk-1的表達呈時間依賴性上調，說明血管內皮細胞增殖以及血管生成與VEGF及其受體Flk-1表達上調與相關，而這些都是由肝癌細胞對血管內皮細胞的作用。以上結果表明肝癌腫瘤微環境不僅可以促進血管內皮細胞的增殖，而且使血管內皮細胞VEGF及其受體Flk-1表達的升高，從而進一步促進了血管內皮細胞的血管生成能力，為肝癌腫瘤的生長提供有利條件。本實驗通過間接共同培養模式，發現了肝癌腫瘤微環境對血管內皮細胞的作用，同時也為肝癌的靶向治療提供一定的理論依據。
