本研究旨在觀察壓力超負荷所致心肌肥厚的病理生理過程中是否發生細胞程序性壞死及洛沙坦對這一病理生理過程的影響。實驗采用腹主動脈縮窄術(TAC)建立壓力超負荷導致的心肌肥厚大鼠模型, 通過動脈血壓、超聲心動圖、左心室質量指數、心肌肥厚分子標志物等觀察左心室的結構功能變化。用real-time PCR和Western blot法分別檢測程序性壞死標志物——受體相互作用蛋白激酶1和3(RIPK1和RIPK3)的基因和蛋白表達變化。結果表明, SD大鼠TAC術后4周可發生心肌肥厚。心肌組織中RIPK1/RIPK3的表達升高, HE染色發現壞死樣心肌組織, 電鏡結果顯示線粒體結構受損, 提示心肌細胞可能發生程序性壞死。給予TAC大鼠血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑洛沙坦治療, 大鼠心臟結構及功能明顯改善, 心肌肥厚程度減輕, 而且對心肌肥厚過程中的程序性壞死有明顯的抑制作用。
引用本文： 趙明月, 秦育培, 陸立慧, 湯小菊, 吳文超, 付華, 劉小菁. 壓力超負荷所致心肌肥厚中程序性壞死的初步研究. 生物醫學工程學雜志, 2015, 32(3): 618-623. doi: 10.7507/1001-5515.20150112 復制
引言
心肌肥厚是心臟響應長期壓力或容量超負荷的重要代償機制。壓力超負荷所導致的心肌肥厚及心肌重塑在許多心血管疾病過程中起著重要作用，其過程也受到許多信號途徑的調控[1]。心肌肥厚是心血管疾病的獨立危險因素，但其發生的具體機制目前尚不完全清楚。
近來研究表明，程序性壞死是一種可調控的壞死途徑, 受體相互作用蛋白激酶(receptor interaction protein kinase, RIPK)家族是其中關鍵的調控因子[2]。已知程序性壞死參與了心肌缺血、心肌梗死及心衰等心血管疾病的病理生理過程，但是否參與心肌肥厚過程，目前尚未闡明。
洛沙坦(losartan)是血管緊張素Ⅱ的Ⅰ型受體(type one selective receptor of angiotensinⅡ, AT1)的特異拮抗劑[3]，在臨床上主要用于治療高血壓。研究表明，洛沙坦對減輕壓力超負荷所致的心肌肥厚亦有一定作用[4]，但其具體作用機制除了降血壓外，是否還涉及其他途徑并不清楚[5]。
大鼠腹主動脈縮窄(transverse abdominal aortic constriction, TAC)是目前公認的、比較成熟的一種制備后負荷增高型左心室肥厚動物模型的方法[6]。為了對壓力超負荷致心肌肥厚過程中發生的程序性壞死進行初步研究，我們擬通過建立大鼠經TAC術誘導的心肌肥厚模型，檢測大鼠心肌組織中是否發生了程序性壞死，同時觀察洛沙坦治療對大鼠心功能和程序性壞死的影響，為心肌肥厚的基礎研究及臨床治療提供實驗依據。
1 材料和試劑
1.1 主要試劑
TRIzol、real-time PCR引物均購自于美國Invitrogen公司，逆轉錄RT試劑盒(Rever Tra Ace組合型)購自TOYOBO，SYBR? Green PCR Master Mix購自BIO-RAD公司，增強化學發光試劑(enhanced chemiluminescence，ECL)、BCA蛋白定量試劑盒購自Pierce公司，兔抗RIPK1、兔抗RIPK3抗體購自Abcam公司，小鼠抗β-actin抗體購自Santa-Cruz公司，山羊抗小鼠、山羊抗兔IgG購自北京中杉金橋公司，PVDF膜購自Millipore公司。其余試劑購自美國Sigma公司。
洛沙坦(losartan)購自默沙東公司。
1.2 實驗動物
清潔級、健康Sprague-Dawley(SD)大鼠購自四川省達碩實驗動物中心, 年齡8~10周，體重200～250 g，本實驗通過了四川大學華西醫院動物倫理委員會批準。
2 實驗方法
2.1 壓力超負荷致心肌肥厚模型的建立及分組
SD大鼠45只，隨機分為三組：假手術組(sham)、TAC組及TAC+losartan組各15只。按文獻[7]報道的方法進行TAC手術。主要步驟如下：大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉。以劍突下緣1~2 cm為起點沿腹中線剪開皮膚，打開腹腔，分離左腎動脈上方腹主動脈，用4號手術縫線將8號注射針頭與腹主動脈一并結扎，然后取出注射針頭，造成腹主動脈縮窄。sham組動物只分離腹主動脈，不作結扎。每日觀察大鼠生命體征，常規飼養28 d。TAC+losartan組大鼠術后第一天起給予洛沙坦治療(每天60 mg/kg)[8]，洛沙坦用自來水溶解，供大鼠飲用飼養28 d。
2.2 超聲心動圖觀察大鼠心臟結構及功能變化
按2.1所述方法對各組大鼠進行相應處理, 4周后行超聲心動圖檢查[9]，以觀察其心臟室壁厚度及心功能變化。大鼠麻醉后用探頭頻率為14 MHz的Philips超聲顯像儀，于胸骨旁二維平乳頭肌短軸切面記錄左室圖像，連續觀察數個心動周期后于M超聲心動圖下測量室間隔厚度(interventricular septal thickness, IVST)、左室后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness, LVPWT)和左室射血分數(left ventricular ejection fraction, LVEF)。
2.3 頸總動脈測量動脈血壓
大鼠麻醉后頸部正中切口，頸總動脈插管，與壓力換能器相連到二道生理記錄儀，連續記錄血壓30 min[10]。測量收縮壓(diastolic blood pressure，DBP)、舒張壓(systolic blood pressure, SBP)和平均動脈壓(mean arterial pressure, MAP)。
2.4 左心室肥厚指數檢測
將麻醉大鼠開胸迅速取出心臟, 冰PBS沖洗、濾紙吸干, 剪去心房及血管組織, 沿室間隔分離左右心室, 電子天平稱左心室重量。左心室質量除以體重得左室質量指數(left ventricular mass index, LVMI)(mg/g)。
2.5 心肌組織形態學觀察
將左室心肌組織平均分為四份扇形，兩份凍存于-80℃冰箱備用，一份置于4%多聚甲醛中固定24 h以上行HE染色[11]，一份置于3%戊二醛中固定24 h以上用于電鏡檢測。400倍光鏡下觀察心肌組織的形態學變化，并用圖像分析軟件Image J，每個實驗組計數150個完整橫切面的心肌細胞，計算心肌橫切面積(cardiomyocyte cross-sectional area, CSA)。
2.6 心肌組織電鏡觀察
1%的四氧化鋨處理使心肌組織再次固定，利用丙酮依次脫水，Epon812包埋，半薄切片光學定位，超薄切片，醋酸鈾及枸櫞酸鉛雙重染色，透射電鏡(transmission electron microscope, TEM)(H-600IV，Japan)觀察不同處理組組織細胞的線粒體形態[12]。
2.7 real-time PCR法檢測基因表達變化[13 ]
用TRIzol提取心肌組織總RNA，將1.5μg總RNA逆轉錄后采用SYBR? Green PCR Master Mix在定量PCR儀(CFX96TM，BIO-RAD)上對心肌肥厚標志基因心房利尿鈉肽(atrial natriuretic peptide, anp)/腦鈉尿肽(brain natriuretic peptide, bnp)及程序性壞死標志基因ripk1/ripk3的變化進行熒光定量檢測。檢測基因的引物序列如表 1所示，以β-actin作為內參基因對目的基因的表達量進行校正。反應條件為：95℃預變性2 min，95℃變性10 s，59℃退火10 s，72℃延伸15 s，共40個循環。同時做溶解曲線以觀察擴增產物的特異性。運用Pfaffl數據模型計算檢測基因的相對表達，并比較處理組與對照組之間基因的表達差異。
表1
定量RT-PCR所用的引物序列
Table1.
Primer Sequences for real time PCR
2.8 Western blot檢測蛋白表達
提取心肌組織總蛋白：取左心室組織約50 mg，加入500μL預冷的含蛋白酶抑制劑cocktail的RIPA裂解液，將心室組織剪碎并轉移至玻璃勻漿器中，冰上反復研磨5 min后再行超聲裂解(40%能量超聲3 s，間隔5 s，共3次)。裂解液于4℃、14 000 g離心15 min，收集上清液，-80℃保存備用。
用BCA法蛋白定量后，取25μg總蛋白上樣，SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白后，將蛋白轉移至PVDF膜上；封閉后孵育一抗(RIPK1，1 :1 000；RIPK3，1 :1 000；β-actin，1 :2 000)4℃過夜。TBST洗滌后加二抗(1 :3 000)室溫2 h，ECL顯影。結果用Quantity One 4.6.1軟件對條帶進行灰度分析，將目的蛋白條帶與內參β-actin的比值作為半定量指標。
2.9 統計學方法
采用SPSS 17.0統計分析軟件處理實驗數據，計量資料以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間比較采用LSD法。以P＜0.05為差異有統計學意義。
3 結果
3.1 壓力超負荷所致大鼠心肌肥厚模型的建立
3.1.1 各組大鼠的血壓變化
與假手術組相比，大鼠術后28天時TAC組的收縮壓、平均動脈壓明顯升高；而給予洛沙坦處理，升高的收縮壓明顯下降(P＜0.05)，見表 2。
表2
動脈血壓變化
Table2.
Changes of arterial pressure in rats
3.1.2 超聲心動圖指標的變化
如圖 1所示，與sham組相比，術后4周時TAC組的LVPWT、IVST明顯升高，而LVEF明顯下降；給予洛沙坦治療后，LVPWT、IVST均下降，LVEF卻明顯升高。提示TAC術后4周大鼠心功能明顯受損，而給予洛沙坦口服治療4周后能明顯改善TAC大鼠受損的心功能。
圖1
大鼠心臟超聲心動圖指標變化
*
*
3.1.3 心肌肥厚指數及心肌肥厚分子標志物變化
與sham組相比，TAC組大鼠的左室質量指數明顯升高，洛沙坦處理后，左室質量指數則明顯下降。定量PCR結果顯示，與sham組相比，TAC組大鼠心肌肥厚的分子標志物anp及bnp基因表達均明顯上調，而洛沙坦治療后，升高的anp及bnp的基因表達水平則顯著下降(P＜0.05)。結果提示，TAC 4周后大鼠發生心肌肥厚，洛沙坦治療則能明顯減輕心肌肥厚的程度，如圖 2所示。
圖2
左室質量指數及心肌肥厚分子標志物表達變化
*
*
3.1.4 組織學HE染色結果
HE染色結果顯示，與sham組[見圖 3(a)]相比，TAC組[見圖 3(b)]大鼠的心臟組織中心肌細胞發生肥大；同時，還觀察到TAC組心肌細胞發生畸形，肌絲溶解，出現壞死樣心肌組織[見圖 3(d)]。而洛沙坦處理后[見圖 3(c)]，心肌細胞肥大及壞死均明顯減輕。sham組、TAC組和TAC+losartan組CSA值分別為(366.1±40)、(459.6±42)、(388.6±50)μm2，TAC組與sham組、TAC+losartan組與TAC組分別比較，差異均有統計學意義(P＜0.05)。
圖3
400倍光鏡下心肌組織的HE染色(400×)
(a)sham組；(b)、(d)：TAC組；(c)TAC+losartan組
Figure3. H & E staining of heart tissues in rats (400×)(a) sham group; (b), (d): TAC group; (c) TAC+losartan group
3.1.5 電鏡檢測結果
線粒體等細胞器受到損傷亦是程序性壞死發生的特征之一。經透射電鏡觀察細胞超微結構，發現心肌細胞線粒體形態改變明顯，如圖 4所示(箭頭所指為線粒體)，sham組細胞線粒體膜完整，嵴清晰可見；TAC組細胞線粒體腫脹，內出現空泡，部分線粒體膜及嵴消失，提示線粒體結構功能受損；TAC+losartan組細胞線粒體形態結構有一定程度的恢復，提示洛沙坦治療對心肌細胞線粒體有一定保護作用。
圖4
細胞超微結構變化(箭頭：線粒體)
Figure4.
Cellular ultra-structure changes(arrow:mitochondrial)
3.2 RIPK1及RIPK3在大鼠心肌組織的表達變化
如圖 5所示，定量PCR及Western blot結果顯示，TAC誘導的心肌肥厚大鼠心肌組織中，調控程序性壞死發生的關鍵激酶RIPK1和RIPK3的基因及蛋白表達水平均明顯上調。TAC術后經洛沙坦治療4周，大鼠心肌組織中升高的RIPK1及RIPK3的基因及蛋白表達水平明顯下降。結果提示，壓力超負荷所致大鼠心肌肥厚過程中，心肌細胞等可能發生了程序性壞死；給予洛沙坦治療對心肌肥厚過程中的程序性壞死則有明顯的抑制作用。
圖5
各組大鼠心肌組織RIPKI、RIPK3基因及蛋白表達變化
*
*
4 討論
在引發程序性壞死的信號通路中，RIPK這一類具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的蛋白酶扮演著關鍵角色[14]，而其它一些炎癥信號分子亦被發現參與了這一過程，如活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)、Ca2+等[15]。RIPK介導的程序性壞死，最近在肝臟，胰腺等多個器官中被確定為細胞死亡的一種新機制，并且介導了心血管疾病中的多種病理過程，如心肌梗死后的心肌重塑、缺血再灌注損傷過程中的炎癥發生及ROS生成等[16]。壓力超負荷導致的心肌肥厚過程中是否有程序性壞死的發生，目前尚無報道。
因此，本研究中我們首先建立了壓力超負荷所致心肌肥厚的大鼠模型，并通過動脈血壓、超聲心動圖、肥厚指數、HE染色、心肌肥厚分子標志物檢測等方法驗證心肌肥厚模型建立成功。同時通過檢測程序性壞死標志物RIPK1/RIPK3的基因及蛋白表達變化，觀察到程序性壞死存在于壓力超負荷引起的心肌肥厚中。進一步，我們觀察到臨床上使用的降壓藥血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑洛沙坦能明顯緩解TAC術后引起的心肌肥厚程度，同時下調程序性壞死中的關鍵酶RIPK1/RIPK3的表達水平。有文獻報道，洛沙坦能抑制自發性高血壓大鼠的左室心肌肥厚和血管壁增厚[8]。其作用范圍較廣，在降低動脈壓的同時可有效保護血管內膜[17]，那么其作用機制除了降低動脈血壓外，是否還通過抑制程序性壞死來緩解心肌肥厚尚不清楚。另外，洛沙坦緩解程序性壞死的作用是否與其能夠抑制炎癥反應或ROS生成有關[18-19]，也有待于我們進行更深層次的研究。
綜上所述，本研究觀察到程序性壞死可能參與了壓力超負荷引起的心肌肥厚過程，而洛沙坦對心肌肥厚的緩解作用還可能通過下調程序性壞死來實現。本課題為研究和治療壓力超負荷導致的心肌肥厚提供了新的思路。
引言
心肌肥厚是心臟響應長期壓力或容量超負荷的重要代償機制。壓力超負荷所導致的心肌肥厚及心肌重塑在許多心血管疾病過程中起著重要作用，其過程也受到許多信號途徑的調控[1]。心肌肥厚是心血管疾病的獨立危險因素，但其發生的具體機制目前尚不完全清楚。
近來研究表明，程序性壞死是一種可調控的壞死途徑, 受體相互作用蛋白激酶(receptor interaction protein kinase, RIPK)家族是其中關鍵的調控因子[2]。已知程序性壞死參與了心肌缺血、心肌梗死及心衰等心血管疾病的病理生理過程，但是否參與心肌肥厚過程，目前尚未闡明。
洛沙坦(losartan)是血管緊張素Ⅱ的Ⅰ型受體(type one selective receptor of angiotensinⅡ, AT1)的特異拮抗劑[3]，在臨床上主要用于治療高血壓。研究表明，洛沙坦對減輕壓力超負荷所致的心肌肥厚亦有一定作用[4]，但其具體作用機制除了降血壓外，是否還涉及其他途徑并不清楚[5]。
大鼠腹主動脈縮窄(transverse abdominal aortic constriction, TAC)是目前公認的、比較成熟的一種制備后負荷增高型左心室肥厚動物模型的方法[6]。為了對壓力超負荷致心肌肥厚過程中發生的程序性壞死進行初步研究，我們擬通過建立大鼠經TAC術誘導的心肌肥厚模型，檢測大鼠心肌組織中是否發生了程序性壞死，同時觀察洛沙坦治療對大鼠心功能和程序性壞死的影響，為心肌肥厚的基礎研究及臨床治療提供實驗依據。
1 材料和試劑
1.1 主要試劑
TRIzol、real-time PCR引物均購自于美國Invitrogen公司，逆轉錄RT試劑盒(Rever Tra Ace組合型)購自TOYOBO，SYBR? Green PCR Master Mix購自BIO-RAD公司，增強化學發光試劑(enhanced chemiluminescence，ECL)、BCA蛋白定量試劑盒購自Pierce公司，兔抗RIPK1、兔抗RIPK3抗體購自Abcam公司，小鼠抗β-actin抗體購自Santa-Cruz公司，山羊抗小鼠、山羊抗兔IgG購自北京中杉金橋公司，PVDF膜購自Millipore公司。其余試劑購自美國Sigma公司。
洛沙坦(losartan)購自默沙東公司。
1.2 實驗動物
清潔級、健康Sprague-Dawley(SD)大鼠購自四川省達碩實驗動物中心, 年齡8~10周，體重200～250 g，本實驗通過了四川大學華西醫院動物倫理委員會批準。
2 實驗方法
2.1 壓力超負荷致心肌肥厚模型的建立及分組
SD大鼠45只，隨機分為三組：假手術組(sham)、TAC組及TAC+losartan組各15只。按文獻[7]報道的方法進行TAC手術。主要步驟如下：大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉。以劍突下緣1~2 cm為起點沿腹中線剪開皮膚，打開腹腔，分離左腎動脈上方腹主動脈，用4號手術縫線將8號注射針頭與腹主動脈一并結扎，然后取出注射針頭，造成腹主動脈縮窄。sham組動物只分離腹主動脈，不作結扎。每日觀察大鼠生命體征，常規飼養28 d。TAC+losartan組大鼠術后第一天起給予洛沙坦治療(每天60 mg/kg)[8]，洛沙坦用自來水溶解，供大鼠飲用飼養28 d。
2.2 超聲心動圖觀察大鼠心臟結構及功能變化
按2.1所述方法對各組大鼠進行相應處理, 4周后行超聲心動圖檢查[9]，以觀察其心臟室壁厚度及心功能變化。大鼠麻醉后用探頭頻率為14 MHz的Philips超聲顯像儀，于胸骨旁二維平乳頭肌短軸切面記錄左室圖像，連續觀察數個心動周期后于M超聲心動圖下測量室間隔厚度(interventricular septal thickness, IVST)、左室后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness, LVPWT)和左室射血分數(left ventricular ejection fraction, LVEF)。
2.3 頸總動脈測量動脈血壓
大鼠麻醉后頸部正中切口，頸總動脈插管，與壓力換能器相連到二道生理記錄儀，連續記錄血壓30 min[10]。測量收縮壓(diastolic blood pressure，DBP)、舒張壓(systolic blood pressure, SBP)和平均動脈壓(mean arterial pressure, MAP)。
2.4 左心室肥厚指數檢測
將麻醉大鼠開胸迅速取出心臟, 冰PBS沖洗、濾紙吸干, 剪去心房及血管組織, 沿室間隔分離左右心室, 電子天平稱左心室重量。左心室質量除以體重得左室質量指數(left ventricular mass index, LVMI)(mg/g)。
2.5 心肌組織形態學觀察
將左室心肌組織平均分為四份扇形，兩份凍存于-80℃冰箱備用，一份置于4%多聚甲醛中固定24 h以上行HE染色[11]，一份置于3%戊二醛中固定24 h以上用于電鏡檢測。400倍光鏡下觀察心肌組織的形態學變化，并用圖像分析軟件Image J，每個實驗組計數150個完整橫切面的心肌細胞，計算心肌橫切面積(cardiomyocyte cross-sectional area, CSA)。
2.6 心肌組織電鏡觀察
1%的四氧化鋨處理使心肌組織再次固定，利用丙酮依次脫水，Epon812包埋，半薄切片光學定位，超薄切片，醋酸鈾及枸櫞酸鉛雙重染色，透射電鏡(transmission electron microscope, TEM)(H-600IV，Japan)觀察不同處理組組織細胞的線粒體形態[12]。
2.7 real-time PCR法檢測基因表達變化[13 ]
用TRIzol提取心肌組織總RNA，將1.5μg總RNA逆轉錄后采用SYBR? Green PCR Master Mix在定量PCR儀(CFX96TM，BIO-RAD)上對心肌肥厚標志基因心房利尿鈉肽(atrial natriuretic peptide, anp)/腦鈉尿肽(brain natriuretic peptide, bnp)及程序性壞死標志基因ripk1/ripk3的變化進行熒光定量檢測。檢測基因的引物序列如表 1所示，以β-actin作為內參基因對目的基因的表達量進行校正。反應條件為：95℃預變性2 min，95℃變性10 s，59℃退火10 s，72℃延伸15 s，共40個循環。同時做溶解曲線以觀察擴增產物的特異性。運用Pfaffl數據模型計算檢測基因的相對表達，并比較處理組與對照組之間基因的表達差異。
表1
定量RT-PCR所用的引物序列
Table1.
Primer Sequences for real time PCR
2.8 Western blot檢測蛋白表達
提取心肌組織總蛋白：取左心室組織約50 mg，加入500μL預冷的含蛋白酶抑制劑cocktail的RIPA裂解液，將心室組織剪碎并轉移至玻璃勻漿器中，冰上反復研磨5 min后再行超聲裂解(40%能量超聲3 s，間隔5 s，共3次)。裂解液于4℃、14 000 g離心15 min，收集上清液，-80℃保存備用。
用BCA法蛋白定量后，取25μg總蛋白上樣，SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白后，將蛋白轉移至PVDF膜上；封閉后孵育一抗(RIPK1，1 :1 000；RIPK3，1 :1 000；β-actin，1 :2 000)4℃過夜。TBST洗滌后加二抗(1 :3 000)室溫2 h，ECL顯影。結果用Quantity One 4.6.1軟件對條帶進行灰度分析，將目的蛋白條帶與內參β-actin的比值作為半定量指標。
2.9 統計學方法
采用SPSS 17.0統計分析軟件處理實驗數據，計量資料以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間比較采用LSD法。以P＜0.05為差異有統計學意義。
3 結果
3.1 壓力超負荷所致大鼠心肌肥厚模型的建立
3.1.1 各組大鼠的血壓變化
與假手術組相比，大鼠術后28天時TAC組的收縮壓、平均動脈壓明顯升高；而給予洛沙坦處理，升高的收縮壓明顯下降(P＜0.05)，見表 2。
表2
動脈血壓變化
Table2.
Changes of arterial pressure in rats
3.1.2 超聲心動圖指標的變化
如圖 1所示，與sham組相比，術后4周時TAC組的LVPWT、IVST明顯升高，而LVEF明顯下降；給予洛沙坦治療后，LVPWT、IVST均下降，LVEF卻明顯升高。提示TAC術后4周大鼠心功能明顯受損，而給予洛沙坦口服治療4周后能明顯改善TAC大鼠受損的心功能。
圖1
大鼠心臟超聲心動圖指標變化
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3.1.3 心肌肥厚指數及心肌肥厚分子標志物變化
與sham組相比，TAC組大鼠的左室質量指數明顯升高，洛沙坦處理后，左室質量指數則明顯下降。定量PCR結果顯示，與sham組相比，TAC組大鼠心肌肥厚的分子標志物anp及bnp基因表達均明顯上調，而洛沙坦治療后，升高的anp及bnp的基因表達水平則顯著下降(P＜0.05)。結果提示，TAC 4周后大鼠發生心肌肥厚，洛沙坦治療則能明顯減輕心肌肥厚的程度，如圖 2所示。
圖2
左室質量指數及心肌肥厚分子標志物表達變化
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3.1.4 組織學HE染色結果
HE染色結果顯示，與sham組[見圖 3(a)]相比，TAC組[見圖 3(b)]大鼠的心臟組織中心肌細胞發生肥大；同時，還觀察到TAC組心肌細胞發生畸形，肌絲溶解，出現壞死樣心肌組織[見圖 3(d)]。而洛沙坦處理后[見圖 3(c)]，心肌細胞肥大及壞死均明顯減輕。sham組、TAC組和TAC+losartan組CSA值分別為(366.1±40)、(459.6±42)、(388.6±50)μm2，TAC組與sham組、TAC+losartan組與TAC組分別比較，差異均有統計學意義(P＜0.05)。
圖3
400倍光鏡下心肌組織的HE染色(400×)
(a)sham組；(b)、(d)：TAC組；(c)TAC+losartan組
Figure3. H & E staining of heart tissues in rats (400×)(a) sham group; (b), (d): TAC group; (c) TAC+losartan group
3.1.5 電鏡檢測結果
線粒體等細胞器受到損傷亦是程序性壞死發生的特征之一。經透射電鏡觀察細胞超微結構，發現心肌細胞線粒體形態改變明顯，如圖 4所示(箭頭所指為線粒體)，sham組細胞線粒體膜完整，嵴清晰可見；TAC組細胞線粒體腫脹，內出現空泡，部分線粒體膜及嵴消失，提示線粒體結構功能受損；TAC+losartan組細胞線粒體形態結構有一定程度的恢復，提示洛沙坦治療對心肌細胞線粒體有一定保護作用。
圖4
細胞超微結構變化(箭頭：線粒體)
Figure4.
Cellular ultra-structure changes(arrow:mitochondrial)
3.2 RIPK1及RIPK3在大鼠心肌組織的表達變化
如圖 5所示，定量PCR及Western blot結果顯示，TAC誘導的心肌肥厚大鼠心肌組織中，調控程序性壞死發生的關鍵激酶RIPK1和RIPK3的基因及蛋白表達水平均明顯上調。TAC術后經洛沙坦治療4周，大鼠心肌組織中升高的RIPK1及RIPK3的基因及蛋白表達水平明顯下降。結果提示，壓力超負荷所致大鼠心肌肥厚過程中，心肌細胞等可能發生了程序性壞死；給予洛沙坦治療對心肌肥厚過程中的程序性壞死則有明顯的抑制作用。
圖5
各組大鼠心肌組織RIPKI、RIPK3基因及蛋白表達變化
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4 討論
在引發程序性壞死的信號通路中，RIPK這一類具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的蛋白酶扮演著關鍵角色[14]，而其它一些炎癥信號分子亦被發現參與了這一過程，如活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)、Ca2+等[15]。RIPK介導的程序性壞死，最近在肝臟，胰腺等多個器官中被確定為細胞死亡的一種新機制，并且介導了心血管疾病中的多種病理過程，如心肌梗死后的心肌重塑、缺血再灌注損傷過程中的炎癥發生及ROS生成等[16]。壓力超負荷導致的心肌肥厚過程中是否有程序性壞死的發生，目前尚無報道。
因此，本研究中我們首先建立了壓力超負荷所致心肌肥厚的大鼠模型，并通過動脈血壓、超聲心動圖、肥厚指數、HE染色、心肌肥厚分子標志物檢測等方法驗證心肌肥厚模型建立成功。同時通過檢測程序性壞死標志物RIPK1/RIPK3的基因及蛋白表達變化，觀察到程序性壞死存在于壓力超負荷引起的心肌肥厚中。進一步，我們觀察到臨床上使用的降壓藥血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑洛沙坦能明顯緩解TAC術后引起的心肌肥厚程度，同時下調程序性壞死中的關鍵酶RIPK1/RIPK3的表達水平。有文獻報道，洛沙坦能抑制自發性高血壓大鼠的左室心肌肥厚和血管壁增厚[8]。其作用范圍較廣，在降低動脈壓的同時可有效保護血管內膜[17]，那么其作用機制除了降低動脈血壓外，是否還通過抑制程序性壞死來緩解心肌肥厚尚不清楚。另外，洛沙坦緩解程序性壞死的作用是否與其能夠抑制炎癥反應或ROS生成有關[18-19]，也有待于我們進行更深層次的研究。
綜上所述，本研究觀察到程序性壞死可能參與了壓力超負荷引起的心肌肥厚過程，而洛沙坦對心肌肥厚的緩解作用還可能通過下調程序性壞死來實現。本課題為研究和治療壓力超負荷導致的心肌肥厚提供了新的思路。
