為了研究生存素基因負性突變體生存素-D53A(SVV-D53A)對人肺腺癌SPC-A1移植瘤的治療作用, 并探討其作用機制, 我們在體外實驗中使用SVV-D53A質粒轉染人肺腺癌SPC-A1細胞, 蛋白免疫印跡檢測生存素突變體表達, 同時通過流式細胞檢測細胞凋亡情況。在體內實驗中, 裸鼠皮下接種人肺腺癌SPC-A1細胞建立肺癌移植瘤模型, 使用陽離子脂質體包裹SVV-D53A質粒進行治療。治療結束后免疫組化檢測各組腫瘤標本細胞增殖, 末端脫氧核苷酸轉移酶脫氧尿苷三磷酸切口末端標記(TUNEL)檢測腫瘤細胞凋亡。與對照組相比, SVV-D53A質粒在體外顯著誘導SPC-A1細胞凋亡, SVV-D53A組裸鼠皮下移植瘤體積減小, 細胞增殖減弱, 大量腫瘤細胞發生凋亡。研究結果表明SVV-D53A的表達在體外和體內均能夠顯著抑制人肺腺癌SPC-A1細胞的生長, 其作用機制主要為誘導腫瘤細胞凋亡。
引用本文： 余敏, 彭星辰, 盧鈾, 黃媚娟. 生存素-D53A突變體對人肺腺癌SPC-A1移植瘤的治療作用. 生物醫學工程學雜志, 2015, 32(3): 624-629. doi: 10.7507/1001-5515.20150113 復制
引言
肺癌是全世界死亡率最高的惡性腫瘤。隨著診斷水平提高，手術和放化療方案的不斷優化，新型靶向藥物不斷出現，肺癌的死亡率并未明顯下降，因此探索肺癌新的治療靶點非常迫切[1]。生存素是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein, IAP)家族的重要成員，選擇性表達于肺癌在內的大多數腫瘤組織，而在正常組織中不表達。相關研究表明，生存素在腫瘤細胞的放化療抵抗及腫瘤復發中發揮重要作用，使生存素成為生物靶向治療的熱點[2]。
目前的研究主要集中于生存素基因RNA干擾和顯性負突變體。生存素顯性負突變體研究目前較多的是生存素-T34A(survivin-T34A, SVV-T34A)即34位蘇氨酸突變成丙氨酸和生存素-D53A(survivin-D53A, SVV-D53A)即53位門冬氨酸突變成丙氨酸。有研究發現SVV-D53A能夠抑制人肝癌細胞移植瘤生長，尚未有治療肺癌的報道[3-4]。
本文使用陽離子脂質體包裹SVV-D53A質粒，研究復合物對人肺腺癌SPC-A1細胞的抑制作用及機制，為SVV-D53A應用于肺癌治療提供理論支持。
1 材料與方法
1.1 材料
體外實驗細胞轉染試劑Lipofectamine 2000購自invitrogen公司，體內實驗陽離子脂質體由本實驗室合成；對照質粒pORF9和重組質粒SVV-D53A購自InvivoGen公司；人肺腺癌SPC-A1細胞購自中科院上海細胞庫；質粒抽提試劑盒購自Qiagen公司；末端脫氧核苷酸轉移酶脫氧尿苷三磷酸切口末端標記(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling, TUNEL)試劑盒購自Promega公司；雌性Balb/c裸鼠購自四川大學實驗動物中心，動物實驗遵守四川大學制定的相關規定。
1.2 體外實驗方法
1.2.1 細胞培養
人肺腺癌SPC-A1細胞培養于含10%FBS的1640培養基，置37℃恒溫，5% CO2無菌孵箱生長，使用0.25%胰酶消化傳代培養。
1.2.2 質粒DNA制備
收集含對照質粒pORF9或重組質粒SVV-D53A的大腸桿菌10 g，根據Qiagen公司說明書，使用Endofree plasmid Giga試劑盒進行質粒抽提。
1.2.3 質粒體外轉染SPC-A1細胞
將SPC-A1細胞置于6孔板內培養，當細胞融合度達50%時將培養基換為無抗生素無血清培養基，實驗分組為空白組、pORF9組及SVV-D53A組，Lipofectamine 2000與質粒混合物300μL(含2μg質粒和5μL Lipofectamine 2000)靜置15 min后加入6孔板內，4 h后換成含抗生素和血清培養基，置孵箱48 h進行后續實驗。
1.2.4 蛋白印跡檢測SVV-D53A表達情況
48 h后收集各組細胞，分別用蛋白裂解液裂解，SDS-PAGE電泳后將蛋白質轉移到PVDF膜上，孵育一抗(1 :1 000稀釋)，二抗(辣根過氧化物酶標記，1 :5 000稀釋)，用化學發光法在X光片上顯影。以GAPDH蛋白為內參照, 比較各組的蛋白條帶的光密度值。
1.2.5 流式細胞術檢測凋亡率
48 h后收集各組細胞，用4℃預冷PBS液清洗細胞兩次，再加入4℃預冷70%的乙醇固定15 min。加入500μL碘化丙啶(PI)溶液，避光孵育30 min。上機檢測細胞亞G1峰細胞(凋亡細胞)。
1.3 體內實驗方法
1.3.1 體內實驗陽離子脂質體的制備
物質的量之比為1 :1的膽固醇(cholesterol, Chol)和1, 2-二油酰-3-三甲胺基丙烷(N-[1-(2, 3-dioleoyloxy)propyl-N, N, N-trimethylammonium methylsulfate, DOTAP]溶解于體積比為1 :3的乙醇和氯仿中，將混合物置于100 mL的圓底燒瓶中放置30 min，并在真空狀態下放置15 min除去殘留的有機物，接著加入5%葡萄糖溶液并在水浴超聲的狀態下使脂質完全溶解，通過聚碳酸酯膜將脂質連續擠壓產生單層小囊而制備脂質體。
1.3.2 裸鼠SPC-A1移植瘤模型的建立、分組及治療
參照經典實驗方法[5]，每只裸鼠于右肋側皮下接種1×107個細胞, 7 d后腫瘤長至約50 mm3，隨機分為三組(每組6只)：NS組、pORF9組(25μL脂質體和5μg質粒)及SVV-D53A組(25μL脂質體和5μg質粒)，均以尾靜脈注射。每周治療三次，共治療三周。每隔3 d用游標卡尺測量腫瘤的長徑和短徑，按下列公式計算腫瘤體積，腫瘤體積(mm3)=腫瘤長徑×腫瘤短徑2×0.52。腫瘤抑制率=(NS組腫瘤體積-SVV-D53A組腫瘤體積)/NS組腫瘤體積。接種后28 d處死裸鼠，剝取皮下腫瘤組織, 稱重并固定于中性福爾馬林溶液中，48 h后石蠟包埋并進行后續實驗。
1.3.3 免疫組化檢測腫瘤增殖細胞核抗原
采用鏈親和素過氧化酶法(streptavidin-peroxidasemethod, SP)檢測腫瘤組織中增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)表達。一抗工作濃度為1 :400，陽性反應定位于胞核內(棕黃色或棕褐色顆粒)。隨機選擇5個高倍視野，增殖指數=觀察視野中陽性細胞數/觀察視野中細胞總數×100%。
1.3.4 TUNEL檢測腫瘤組織內凋亡
取各組腫瘤組織石蠟切片，按照Promega公司TUNEL試劑盒說明書進行實驗。熒光顯微鏡下TUNEL染色陽性細胞的細胞核呈綠色，陰性細胞的細胞核無著色。隨機選擇5個高倍視野，凋亡指數=觀察視野中凋亡細胞數/觀察視野中細胞總數×100%。
1.3.5 不良反應觀察
裸鼠治療第1~21 d，每天觀察一般情況，包括食欲，活動變化等。裸鼠接種第28 d處死裸鼠后，取各組裸鼠的重要臟器進行HE染色，鏡下觀察有無組織學病理改變。
1.4 統計學方法
使用SPSS 18.0軟件進行統計學分析。各組數據資料以均數±標準差表示，多組資料比較采用單因素方差分析。P＜0.05時差異有統計學意義。
2 結果
2.1 SVV-D53A質粒細胞內表達并誘導細胞凋亡
如圖 1(a)所示, 與空白組和pORF9組相比，SVV-D53A質粒轉染48 h后SPC-A1細胞內SVV-D53A蛋白顯著表達。同時SVV-D53A質粒處理組的亞G1期細胞所占比例增高，凋亡率為39%±5%，如圖 1(b)所示。
圖1
SVV-D53A細胞內表達及其誘導作用
(a)Western blot檢測SVV-D53A在細胞內表達；(b)流式細胞術檢測SVV-D53A誘導細胞凋亡
Figure1. SVV-D53A expression and its induction effects in SPC-A1 cells(a) SVV-D53A expression detected by Western blot; (b) apoptosis of SPC-A1 cells detected by flow cytometry analysis
2.2 SVV-D53A質粒對SPC-A1皮下移植瘤的抑制作用
NS組和pORF9組腫瘤生長較快，而SVV-D53A組腫瘤生長明顯減慢，如圖 2所示。與NS組和pORF9組相比，SVV-D53A組在接種后28 d腫瘤體積抑制率分別為48%±7%和44%±3%(*P＜0.05)。
圖2
SVV-D53A質粒抑制SPC-A1皮下移植瘤的生長和重量
*SVV-D53A組與pORF9組比較,
*SVV-D53A group
2.3 SVV-D53A質粒抑制SPC-A1細胞增殖活性并誘導凋亡
免疫組化結果顯示，SVV-D53A組PCNA蛋白表達量明顯下調。TUNEL結果顯示，各組均檢測到凋亡細胞，但SVV-D53A組的凋亡細胞數要遠多于其他組。這表明SVV-D53A抑制SPC-A1皮下移植瘤原因很可能是減低細胞增殖活性并顯著誘導腫瘤細胞凋亡，如圖 3所示。
圖3
SVV-D53A質粒對SPC-A1皮下移植瘤的抑制機制
(a)SVV-D53A質粒抑制SPC-A1細胞增殖；(b)SVV-D53A質粒促進SPC-A1細胞凋亡; *SVV-D53A組與pORF9組比較,
(a) SVV-D53A plasmid decreased cell proliferation; (b) SVV-D53A plasmid induced apoptosis in tumor tissue; *SVV-D53A group
2.4 SVV-D53A質粒治療的毒副作用觀察
SVV-D53A組的荷瘤小鼠在整個實驗過程中狀態良好，重要臟器切片HE染色，未發現重要臟器組織形態學改變。
3 討論
生存素是IAP家族成員，是迄今發現最強的凋亡抑制因子之一，在腫瘤診斷和治療領域發揮重要作用。生存素的組織分布有明顯的選擇性，主要表達于胚胎組織和大多數腫瘤組織，而在成熟的正常組織中未見表達。生存素功能復雜，具有抑制細胞凋亡、促進細胞有絲分裂和血管生成作用。更重要的是，生存素的表達與腫瘤患者臨床預后相關，高表達常常預示對治療耐藥和較短的生存期。基于生存素基因在腫瘤組織中表達的特異性，它成為腫瘤治療中一個理想分子靶點，研究者采用不同的策略來研究其抗腫瘤活性[2, 6]。一些研究用小干擾RNA(siRNA)抑制腫瘤細胞生存素基因的表達，細胞出現典型的凋亡形態學特征，細胞凋亡率較對照組明顯增加[7-8]。但是siRNA在體外極不穩定，在體內環境中更易降解，限制其治療效果。生存素顯性負突變體是另一種新穎的策略，SVV-T34A是目前最常用的生存素突變體，為生存素基因34位蘇氨酸突變成丙氨酸(Thr34Ala)，使得該位點磷酸化缺失而缺少正常生存素功能。SVV-T34A能與細胞內野生型生存素蛋白競爭性結合cdc2/cyclin B1，使內源性生存素無法發揮其抑制凋亡的作用[9-10]。SVV-D53A是野生型生存素的另一種負性突變體，為第53位的門冬氨酸突變為丙氨酸，SVV-D53A不僅能形成SVV-D53A/SVV-D53A同源二聚體，與細胞內野生型生存素蛋白競爭性結合Smac/DIABLO；同時能夠與野生型生存素形成SVV-D53A/生存素異源二聚體，從而直接下調野生型生存素，可能具有更強的抗腫瘤活性[4]。
我們用陽離子脂質體包裹SVV-D53A質粒治療人肺腺癌SPC-A1細胞，SVV-D53A質粒能夠在SPC-A1細胞中表達SVV-D53蛋白，并在體外和體內顯示了強大的抑瘤活性。SPC-A1移植瘤進行免疫組化和TUNEL檢測顯示，SVV-D53A組裸鼠移植瘤組織內細胞增殖活性降低，同時大量腫瘤細胞凋亡，SVV-D53A質粒對SPC-A1移植瘤的抑制作用可能主要通過減低細胞增殖和誘導腫瘤細胞凋亡實現。
圖4
各組荷瘤小鼠的肝臟腎臟切片HE染色(400×)
Figure4.
Detect of toxic pathologic changes of liver and kidney by HE stain (400×)
載體系統一直是基因治療的瓶頸，研究者也不斷嘗試各種核酸傳遞系統[11-13]。病毒載體是現今常用的穩定轉染工具，然而重組病毒用于基因治療，其安全性一直為人質疑，病毒載體攜帶的基因可能整合于基因組隨機位置，導致細胞出現惡性表型。由于良好安全性和操作簡單，靜脈直接注射質粒已應用于實驗研究，但是由于質粒在體內短暫的半衰期，其使用受到很大限制。我們采用DOTAP-Chol脂質體包裹質粒，通過尾靜脈給藥方式傳遞治療基因。一方面，脂質體質粒復合物能夠保護進入血液的質粒不被很快清除；另一方面，有研究表明，通過尾靜脈注射的脂質體質粒復合物在體內各組織中的分布有差異，其中肺部表達量最高，同時陽離子脂質體本身具有腫瘤靶向性，因此應用于肺癌具有更大的優勢。此外，很多研究已證實DOTAP-Chol脂質體能夠有效傳遞基因，DOTAP-Chol脂質體與FUS1質粒復合物治療晚期肺癌已開始I期臨床試驗[14-17]。
我們首次將DOTAP-Chol脂質體介導的SVV-D53A基因治療用于人肺腺癌SPC-A1移植瘤，并取得明顯的抑瘤效果，為肺癌臨床治療提供了新思路，但是仍需進一步揭示潛在的分子機理。
引言
肺癌是全世界死亡率最高的惡性腫瘤。隨著診斷水平提高，手術和放化療方案的不斷優化，新型靶向藥物不斷出現，肺癌的死亡率并未明顯下降，因此探索肺癌新的治療靶點非常迫切[1]。生存素是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein, IAP)家族的重要成員，選擇性表達于肺癌在內的大多數腫瘤組織，而在正常組織中不表達。相關研究表明，生存素在腫瘤細胞的放化療抵抗及腫瘤復發中發揮重要作用，使生存素成為生物靶向治療的熱點[2]。
目前的研究主要集中于生存素基因RNA干擾和顯性負突變體。生存素顯性負突變體研究目前較多的是生存素-T34A(survivin-T34A, SVV-T34A)即34位蘇氨酸突變成丙氨酸和生存素-D53A(survivin-D53A, SVV-D53A)即53位門冬氨酸突變成丙氨酸。有研究發現SVV-D53A能夠抑制人肝癌細胞移植瘤生長，尚未有治療肺癌的報道[3-4]。
本文使用陽離子脂質體包裹SVV-D53A質粒，研究復合物對人肺腺癌SPC-A1細胞的抑制作用及機制，為SVV-D53A應用于肺癌治療提供理論支持。
1 材料與方法
1.1 材料
體外實驗細胞轉染試劑Lipofectamine 2000購自invitrogen公司，體內實驗陽離子脂質體由本實驗室合成；對照質粒pORF9和重組質粒SVV-D53A購自InvivoGen公司；人肺腺癌SPC-A1細胞購自中科院上海細胞庫；質粒抽提試劑盒購自Qiagen公司；末端脫氧核苷酸轉移酶脫氧尿苷三磷酸切口末端標記(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling, TUNEL)試劑盒購自Promega公司；雌性Balb/c裸鼠購自四川大學實驗動物中心，動物實驗遵守四川大學制定的相關規定。
1.2 體外實驗方法
1.2.1 細胞培養
人肺腺癌SPC-A1細胞培養于含10%FBS的1640培養基，置37℃恒溫，5% CO2無菌孵箱生長，使用0.25%胰酶消化傳代培養。
1.2.2 質粒DNA制備
收集含對照質粒pORF9或重組質粒SVV-D53A的大腸桿菌10 g，根據Qiagen公司說明書，使用Endofree plasmid Giga試劑盒進行質粒抽提。
1.2.3 質粒體外轉染SPC-A1細胞
將SPC-A1細胞置于6孔板內培養，當細胞融合度達50%時將培養基換為無抗生素無血清培養基，實驗分組為空白組、pORF9組及SVV-D53A組，Lipofectamine 2000與質粒混合物300μL(含2μg質粒和5μL Lipofectamine 2000)靜置15 min后加入6孔板內，4 h后換成含抗生素和血清培養基，置孵箱48 h進行后續實驗。
1.2.4 蛋白印跡檢測SVV-D53A表達情況
48 h后收集各組細胞，分別用蛋白裂解液裂解，SDS-PAGE電泳后將蛋白質轉移到PVDF膜上，孵育一抗(1 :1 000稀釋)，二抗(辣根過氧化物酶標記，1 :5 000稀釋)，用化學發光法在X光片上顯影。以GAPDH蛋白為內參照, 比較各組的蛋白條帶的光密度值。
1.2.5 流式細胞術檢測凋亡率
48 h后收集各組細胞，用4℃預冷PBS液清洗細胞兩次，再加入4℃預冷70%的乙醇固定15 min。加入500μL碘化丙啶(PI)溶液，避光孵育30 min。上機檢測細胞亞G1峰細胞(凋亡細胞)。
1.3 體內實驗方法
1.3.1 體內實驗陽離子脂質體的制備
物質的量之比為1 :1的膽固醇(cholesterol, Chol)和1, 2-二油酰-3-三甲胺基丙烷(N-[1-(2, 3-dioleoyloxy)propyl-N, N, N-trimethylammonium methylsulfate, DOTAP]溶解于體積比為1 :3的乙醇和氯仿中，將混合物置于100 mL的圓底燒瓶中放置30 min，并在真空狀態下放置15 min除去殘留的有機物，接著加入5%葡萄糖溶液并在水浴超聲的狀態下使脂質完全溶解，通過聚碳酸酯膜將脂質連續擠壓產生單層小囊而制備脂質體。
1.3.2 裸鼠SPC-A1移植瘤模型的建立、分組及治療
參照經典實驗方法[5]，每只裸鼠于右肋側皮下接種1×107個細胞, 7 d后腫瘤長至約50 mm3，隨機分為三組(每組6只)：NS組、pORF9組(25μL脂質體和5μg質粒)及SVV-D53A組(25μL脂質體和5μg質粒)，均以尾靜脈注射。每周治療三次，共治療三周。每隔3 d用游標卡尺測量腫瘤的長徑和短徑，按下列公式計算腫瘤體積，腫瘤體積(mm3)=腫瘤長徑×腫瘤短徑2×0.52。腫瘤抑制率=(NS組腫瘤體積-SVV-D53A組腫瘤體積)/NS組腫瘤體積。接種后28 d處死裸鼠，剝取皮下腫瘤組織, 稱重并固定于中性福爾馬林溶液中，48 h后石蠟包埋并進行后續實驗。
1.3.3 免疫組化檢測腫瘤增殖細胞核抗原
采用鏈親和素過氧化酶法(streptavidin-peroxidasemethod, SP)檢測腫瘤組織中增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)表達。一抗工作濃度為1 :400，陽性反應定位于胞核內(棕黃色或棕褐色顆粒)。隨機選擇5個高倍視野，增殖指數=觀察視野中陽性細胞數/觀察視野中細胞總數×100%。
1.3.4 TUNEL檢測腫瘤組織內凋亡
取各組腫瘤組織石蠟切片，按照Promega公司TUNEL試劑盒說明書進行實驗。熒光顯微鏡下TUNEL染色陽性細胞的細胞核呈綠色，陰性細胞的細胞核無著色。隨機選擇5個高倍視野，凋亡指數=觀察視野中凋亡細胞數/觀察視野中細胞總數×100%。
1.3.5 不良反應觀察
裸鼠治療第1~21 d，每天觀察一般情況，包括食欲，活動變化等。裸鼠接種第28 d處死裸鼠后，取各組裸鼠的重要臟器進行HE染色，鏡下觀察有無組織學病理改變。
1.4 統計學方法
使用SPSS 18.0軟件進行統計學分析。各組數據資料以均數±標準差表示，多組資料比較采用單因素方差分析。P＜0.05時差異有統計學意義。
2 結果
2.1 SVV-D53A質粒細胞內表達并誘導細胞凋亡
如圖 1(a)所示, 與空白組和pORF9組相比，SVV-D53A質粒轉染48 h后SPC-A1細胞內SVV-D53A蛋白顯著表達。同時SVV-D53A質粒處理組的亞G1期細胞所占比例增高，凋亡率為39%±5%，如圖 1(b)所示。
圖1
SVV-D53A細胞內表達及其誘導作用
(a)Western blot檢測SVV-D53A在細胞內表達；(b)流式細胞術檢測SVV-D53A誘導細胞凋亡
Figure1. SVV-D53A expression and its induction effects in SPC-A1 cells(a) SVV-D53A expression detected by Western blot; (b) apoptosis of SPC-A1 cells detected by flow cytometry analysis
2.2 SVV-D53A質粒對SPC-A1皮下移植瘤的抑制作用
NS組和pORF9組腫瘤生長較快，而SVV-D53A組腫瘤生長明顯減慢，如圖 2所示。與NS組和pORF9組相比，SVV-D53A組在接種后28 d腫瘤體積抑制率分別為48%±7%和44%±3%(*P＜0.05)。
圖2
SVV-D53A質粒抑制SPC-A1皮下移植瘤的生長和重量
*SVV-D53A組與pORF9組比較,
*SVV-D53A group
2.3 SVV-D53A質粒抑制SPC-A1細胞增殖活性并誘導凋亡
免疫組化結果顯示，SVV-D53A組PCNA蛋白表達量明顯下調。TUNEL結果顯示，各組均檢測到凋亡細胞，但SVV-D53A組的凋亡細胞數要遠多于其他組。這表明SVV-D53A抑制SPC-A1皮下移植瘤原因很可能是減低細胞增殖活性并顯著誘導腫瘤細胞凋亡，如圖 3所示。
圖3
SVV-D53A質粒對SPC-A1皮下移植瘤的抑制機制
(a)SVV-D53A質粒抑制SPC-A1細胞增殖；(b)SVV-D53A質粒促進SPC-A1細胞凋亡; *SVV-D53A組與pORF9組比較,
(a) SVV-D53A plasmid decreased cell proliferation; (b) SVV-D53A plasmid induced apoptosis in tumor tissue; *SVV-D53A group
2.4 SVV-D53A質粒治療的毒副作用觀察
SVV-D53A組的荷瘤小鼠在整個實驗過程中狀態良好，重要臟器切片HE染色，未發現重要臟器組織形態學改變。
3 討論
生存素是IAP家族成員，是迄今發現最強的凋亡抑制因子之一，在腫瘤診斷和治療領域發揮重要作用。生存素的組織分布有明顯的選擇性，主要表達于胚胎組織和大多數腫瘤組織，而在成熟的正常組織中未見表達。生存素功能復雜，具有抑制細胞凋亡、促進細胞有絲分裂和血管生成作用。更重要的是，生存素的表達與腫瘤患者臨床預后相關，高表達常常預示對治療耐藥和較短的生存期。基于生存素基因在腫瘤組織中表達的特異性，它成為腫瘤治療中一個理想分子靶點，研究者采用不同的策略來研究其抗腫瘤活性[2, 6]。一些研究用小干擾RNA(siRNA)抑制腫瘤細胞生存素基因的表達，細胞出現典型的凋亡形態學特征，細胞凋亡率較對照組明顯增加[7-8]。但是siRNA在體外極不穩定，在體內環境中更易降解，限制其治療效果。生存素顯性負突變體是另一種新穎的策略，SVV-T34A是目前最常用的生存素突變體，為生存素基因34位蘇氨酸突變成丙氨酸(Thr34Ala)，使得該位點磷酸化缺失而缺少正常生存素功能。SVV-T34A能與細胞內野生型生存素蛋白競爭性結合cdc2/cyclin B1，使內源性生存素無法發揮其抑制凋亡的作用[9-10]。SVV-D53A是野生型生存素的另一種負性突變體，為第53位的門冬氨酸突變為丙氨酸，SVV-D53A不僅能形成SVV-D53A/SVV-D53A同源二聚體，與細胞內野生型生存素蛋白競爭性結合Smac/DIABLO；同時能夠與野生型生存素形成SVV-D53A/生存素異源二聚體，從而直接下調野生型生存素，可能具有更強的抗腫瘤活性[4]。
我們用陽離子脂質體包裹SVV-D53A質粒治療人肺腺癌SPC-A1細胞，SVV-D53A質粒能夠在SPC-A1細胞中表達SVV-D53蛋白，并在體外和體內顯示了強大的抑瘤活性。SPC-A1移植瘤進行免疫組化和TUNEL檢測顯示，SVV-D53A組裸鼠移植瘤組織內細胞增殖活性降低，同時大量腫瘤細胞凋亡，SVV-D53A質粒對SPC-A1移植瘤的抑制作用可能主要通過減低細胞增殖和誘導腫瘤細胞凋亡實現。
圖4
各組荷瘤小鼠的肝臟腎臟切片HE染色(400×)
Figure4.
Detect of toxic pathologic changes of liver and kidney by HE stain (400×)
載體系統一直是基因治療的瓶頸，研究者也不斷嘗試各種核酸傳遞系統[11-13]。病毒載體是現今常用的穩定轉染工具，然而重組病毒用于基因治療，其安全性一直為人質疑，病毒載體攜帶的基因可能整合于基因組隨機位置，導致細胞出現惡性表型。由于良好安全性和操作簡單，靜脈直接注射質粒已應用于實驗研究，但是由于質粒在體內短暫的半衰期，其使用受到很大限制。我們采用DOTAP-Chol脂質體包裹質粒，通過尾靜脈給藥方式傳遞治療基因。一方面，脂質體質粒復合物能夠保護進入血液的質粒不被很快清除；另一方面，有研究表明，通過尾靜脈注射的脂質體質粒復合物在體內各組織中的分布有差異，其中肺部表達量最高，同時陽離子脂質體本身具有腫瘤靶向性，因此應用于肺癌具有更大的優勢。此外，很多研究已證實DOTAP-Chol脂質體能夠有效傳遞基因，DOTAP-Chol脂質體與FUS1質粒復合物治療晚期肺癌已開始I期臨床試驗[14-17]。
我們首次將DOTAP-Chol脂質體介導的SVV-D53A基因治療用于人肺腺癌SPC-A1移植瘤，并取得明顯的抑瘤效果，為肺癌臨床治療提供了新思路，但是仍需進一步揭示潛在的分子機理。
