骨髓間充質干細胞(BMSCs)由于具有向心肌方向分化的潛能, 目前已成為一種新的能夠修復心臟組織損傷的重要治療選擇。在本實驗中我們探討了體外不同的電刺激時間對BMSCs向心肌方向分化的影響。實驗共分為三組:①電刺激組, 完全培養基培養的大鼠骨髓間充質干細胞(rBMSCs)受到電壓為2 V, 頻率為2 Hz, 脈寬為5 ms的電刺激, 作用時間為30 min/d、2 h /d、4 h/d、6 h/d, 連續作用10 d; ②5-氮胞苷(5-Aza)組, 5-Aza(10μmol/L)誘導rBMSCs 24 h, 然后采用完全培養基培養10 d; ③空白對照組, 完全培養基靜態培養rBMSCs 10 d。通過實時熒光定量PCR方法檢測各組rBMSCs的肌細胞特異性增強因子-2C(MEF-2C) mRNA和縫隙連接蛋白43(Cx43) mRNA的表達; 通過Western blot方法檢測各組rBMSCs的MEF-2C蛋白和Cx43蛋白的表達。實驗結果顯示:不同持續時間的電刺激組及5-Aza組的MEF-2C mRNA、Cx43 mRNA表達量及MEF-2C蛋白、Cx43蛋白表達量均明顯高于空白對照組(P＜0.05)。本實驗結果提示, 體外電刺激可以誘導rBMSCs向心肌方向分化, 其中2 h/d作用效果最佳, 但其機制尚未明確。
引用本文： 唐敏, 楊剛, 姜建, 何學令, 李匯明, 張夢穎, 吳文超, 劉小菁, 李良. 體外電刺激誘導大鼠骨髓間充質干細胞心肌特異性標志物MEF-2C和Cx43的表達. 生物醫學工程學雜志, 2015, 32(3): 629-634. doi: 10.7507/1001-5515.20150114 復制
引言
骨髓間充質干細胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BMSCs)是一種存在于骨髓中，具有多向分化潛能，自我更新能力很強的成體干細胞。BMSCs在一定條件下可以向骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、心肌細胞、成纖維細胞、肌纖維細胞、上皮細胞和神經細胞系分化[1]。已有文獻報道，通過直接或間接的方法向冠狀動脈注入BMSCs可以有效治療慢性心臟病[2]。另外也有研究報道，BMSCs可以促進心肌再生[3]。由于心臟作為機體全身的“泵”器官，一直處于持續搏動的狀態，而心肌細胞處于力、電、生物化學各種因素共存的復雜微環境中，因此電刺激對心肌細胞的分化與生長起著至關重要的作用[4]。我們實驗室的前期研究發現，電刺激可調控大鼠骨髓間充質干細胞(rBMSCs)心肌特異性標志物GATA4 mRNA、Nkx2.5 mRNA、ACTN2 mRNA、TNNT2 mRNA的表達[5]。在本實驗中，我們將進一步探討體外不同的電刺激時間對rBMSCs心肌特異性標志物——肌細胞特異性增強因子-2C(myocyte-specific enhancer factor 2C, MEF-2C)和縫隙連接蛋白43(connexin 43, Cx43)的mRNA和蛋白表達的影響，期望為探討體外電刺激促進rBMSCs向心肌樣細胞分化以及可能的機制提供實驗基礎。
1 材料和方法
1.1 實驗動物、主要儀器和試劑
1.1.1 實驗動物
健康清潔SpragueDawley(SD)大鼠(4~6周齡)，體重為100~150 g，由四川大學動物實驗中心提供。
1.1.2 主要儀器和試劑
CO2細胞培養孵箱(SANYO公司)，CFX96TM Real-time PCR System(BIO-RAD公司), 澳洲胎牛血清(FBS)，DMEM低糖培養基干粉(Gibco公司)，胰蛋白酶、雙抗(Penicillin-Streptomycin Solution)(Hyclone公司), Trizol Reagent(Invitrogen公司), 逆轉錄聚合酶鏈反應試劑盒(IScriptTM cDNA Synthesis Kit)、實時熒光定量PCR試劑盒(SsoFastTM EvaGreen? Supermix)(BIO-RAD公司), 縫隙連接蛋白Cx43(connexin43, Cx43)抗體(Santa公司)，肌細胞特異性增強因子-2C(MEF-2C)抗體(proteintech，PTG公司)，辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔抗體(中杉金橋公司)。凝膠成像儀(ChemiDocTM XRS+ with Image LabTM, Bio-Rad, Inc., USA)。DMEM-LG基礎培養基：DMEM-LG+無菌雙蒸水；DMEM-LG完全培養基：DMEM-LG基礎培養基+15%胎牛血清+1%雙抗。
1.1.3 電刺激裝置
采用本實驗室自制的電刺激裝置[5]：該電刺激裝置由示波器、電壓控制系統、六孔板、碳棒電極、電線等組成。將碳棒電極固定在六孔板蓋子上，對六孔板中培養的細胞加載電刺激，參數為：電壓2 V，頻率2 Hz，脈寬5 ms。
1.2 rBMSCs的分離與培養
采用我們實驗室常規全骨髓貼壁法分離并鑒定rBMSCs[6-7]。首先，采用斷頸法處死SD大鼠，在無菌條件下分離出股骨和脛骨，用組織剪去除軟組織及骨膜，放入75%乙醇中浸泡消毒1 min。然后用PBS沖洗股骨和脛骨3遍，去除兩端骨骺，用無菌注射器吸取10 mL DMEM-LG基礎培養基沖出骨髓，直至骨頭發白，將骨髓收集至15 mL的離心管內，4℃，900 r/min離心5 min，棄除上清，再加入3 mL DMEM-LG完全培養基收集細胞，按3×105個/cm2的細胞密度接種于25 cm2細胞培養瓶中，然后將細胞瓶置于37℃、5% CO2飽和濕度的細胞孵箱中培養。細胞于接種后3 h首次換液，此后的72 h內每8 h換液1次；第4 d起，每隔3 d換液1次。待細胞生長至80%～90%融合狀態時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。選用第3代～第4代(P3～P4)細胞用于實驗，并于接種前對rBMSCs進行臺盼藍細胞活力計數，細胞活力均在98%以上。
1.3 實驗分組
將rBMSCs隨機分為三組：電刺激組、5-Aza組和空白對照組。各組均將rBMSCs以3×104個/cm2接種于6孔板中，DMEM-LG完全培養基培養，待細胞完全貼壁后，用含2% FBS的DMEM-LG培養基饑餓細胞過夜(12 h)。第二天吸去培養基后，換成DMEM-LG完全培養基，然后各組分別給予相應處理。
1.3.1 電刺激組
給予電壓2 V、頻率2 Hz、脈寬5 ms的電刺激，分別作用30 min/d、2 h/d、4 h/d、6 h/d，持續作用10 d，于實驗第11天收集樣本。
1.3.2 5-Aza組
用含10μmol/L 5-Aza的培養基誘導24 h后，換成DMEM-LG完全培養基繼續培養10 d，于實驗第11天收集樣本。
1.3.3 空白對照組
不作任何處理，采用DMEM-LG完全培養基靜態培養10 d，于實驗第11天收集樣本。
1.4 檢測指標
1.4.1 實時熒光定量PCR法
檢測各組MEF-2C mRNA和Cx43 mRNA表達。按照Trizol Reagent說明書分別收集電刺激組、5-Aza組和空白對照組的總mRNA。利用1%瓊脂糖凝膠電泳的方法對各組提取到的總mRNA進行完整性的檢測，經紫外分光光度計檢測A260與A280的比值以判斷總mRNA的純度，然后計算出所提總mRNA的濃度。從每組樣品中取1.5μg總mRNA逆轉錄生成cDNA，據濃度推算出所需體積。依據逆轉錄試劑盒使用說明書依次向EP管中加入反應液及樣本mRNA。將EP管置于PCR儀中，依次設定逆轉錄反應參數：25℃5 min，42℃30 min，85℃5 min，進行逆轉錄。取2μL生成的cDNA作為模板進行熒光定量PCR反應，按照SsoFastTM EvaGreen@ Supermix試劑盒說明書進行操作，反應體系為20μL。反應參數為：95℃變性10 s，59℃退火10 s，72℃延伸10 s，總共40個循環，同時做溶解曲線分析。用內參基因(GAPDH)來校正目的基因，即用目的基因表達量與內參基因表達量的比值來表示。GAPDH mRNA、MEF-2C mRNA、Cx43 mRNA引物序列如表 1所示。
表1
GAPDH mRNA、MEF-2c mRNA、Cx43 mRNA的Real-time PCR的引物序列
Table1.
Primer sequences of the real-time PCR for GAPDH mRNA, MEF-2c mRNA, and Cx43 mRNA
1.4.2 蛋白免疫印記實驗(Western blot)
檢測各組MEF-2C蛋白和Cx43蛋白表達。具體方法，分別采用4℃預冷的PBS漂洗電刺激組、5-Aza組和空白對照組細胞3次，每次5 min，洗完后每孔加入100μL預先配好的RIPA蛋白裂解液，用細胞刮子盡量刮下所有的細胞，分別將各組含有細胞碎片的裂解液移至相應的1.5 mL EP管中，靜置30 min(所有的操作都要在冰上進行)；然后經4℃, 12 000 r/min離心8 min后，小心吸取上清至新的EP管中。用BCA法對各組總蛋白進行定量，變性，后經Western blot跑膠，轉膜，封閉后孵育一抗(β-actin，MEF-2C，Cx43，1 :200)，4℃過夜。第二天經TBST漂洗，室溫下孵育二抗(辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔，1 :5 000)，37℃孵育2～3 h后，經TBST漂洗，加入ECL顯色液，在凝膠成像儀上顯影，蛋白條帶灰度值用Image Lab軟件進行分析。用內參蛋白(β-actin)來校正目的蛋白，即用目的蛋白條帶灰度值與內參蛋白條帶灰度值的比值來表示。
1.5 統計學分析
本實驗所有數據均采用SPSS 17.0統計軟件處理，所有參數檢測均有n=3。采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進行組間差別比較，用SNK法進行組間兩兩比較，用均數±標準差來表示每組數據，以P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 MEF-2C mRNA和Cx43 mRNA的表達
如圖 1所示，電刺激組與5-Aza組中的MEF-2C mRNA、Cx43 mRNA的表達量均明顯高于空白對照組(分別有P＜0.05)。不同時間的電刺激組之間相比較，2 h/d電刺激組rBMSCs中的2個心肌特異性基因的表達量最高(均有P＜0.05)。與5-Aza組比較，2 h/d電刺激組MEF-2C mRNA的表達量高于5-Aza組(P＜0.05), 而Cx43 mRNA的表達量低于5-Aza組(P＜0.05)。
圖1
各組rBMSCs的Cx43 mRNA、MEF-2C mRNA的相對表達量(與相應的空白對照組比較，*
compared to the corresponding control group, *
2.2 MEF-2C蛋白和Cx43蛋白的表達
如圖 2、圖 3所示，除空白對照組與電刺激6 h/d組沒有Cx43蛋白表達外，其余各電刺激組與5-Aza組的MEF-2C蛋白、Cx43蛋白表達量均明顯高于空白對照組(均有P＜0.05)。當電刺激時間加載至2 h/d時，rBMSCs心肌特異性蛋白MEF-2C、Cx43的表達量最高，此后隨著加載時間的推移，蛋白表達量逐漸下降。在電刺激30 min/d、2 h/d、4 h/d組中，MEF-2C蛋白的表達量均高于5-Aza組(均有P＜0.05)。但在5-Aza組中，Cx43蛋白的表達量高于2 h/d電刺激組(P＜0.05)。
圖2
各組rBMSCs的MEF-2C蛋白電泳條帶及其相對表達量(與相應的空白對照組比較，*
*
圖3
各組rBMSCs的Cx43蛋白電泳條帶及其相對表達量(與相應的空白對照組比較，*
*
3 討論
心肌梗死可能會引起嚴重的心肌功能異常, 但由于心肌細胞不可再生, 所以最終會導致心力衰竭。目前用于治療心梗的主要方法包括藥物治療和手術治療，雖然這些措施能緩解患者心悸、胸悶等癥狀，但是由于病程長、患者依從性差和治療費用昂貴等原因，治療效果常不理想[8]。因此，干細胞治療可以促心肌再生恢復心臟功能就成為一種新的治療方案[9]。而目前用于治療的干細胞主要有胚胎干細胞、脂肪間充質干細胞、BMSCs等。
BMSCs由于取材容易，自我更新能力強，相對無免疫原性，可以分化成多種細胞系的特點，因此已成為多種疾病治療的研究選擇[6]。目前已有多種方法可以促BMSCs向心肌方向分化，例如BMSCs與心肌細胞共培養，通過細胞與細胞間的接觸及相互作用，BMSCs就可以獲得心肌細胞的表面特征[7]；BMSCs經5-Aza作用后具有心肌樣細胞的亞顯微結構，并表達了MEF mRNA[10]。然而，與心肌細胞共培養及經5-Aza作用這些方法并不適合于臨床應用，而且5-Aza還具有潛在的非特異性去甲基化毒性作用[11]。因此國內外的研究者們正在尋找新的方法來促進BMSCs向心肌方向分化。
由于心臟是一個維持血液循環的泵，因此心肌細胞處于復雜的力學、電學、生物化學等各種因素存在的復雜微環境中，這些微環境對于維持心臟功能都是不可或缺的。內源性電磁場位于發育和再生組織細胞外隙和細胞胞漿內，因此電刺激對于控制細胞的功能是非常重要的。目前電刺激已經用于組織工程來加強干細胞的增殖與分化。Genovese等[12]用微小電流刺激心肌成纖維細胞，檢測到心肌特異型標志物Cx43的表達。Radisic等[13]以雙向矩形脈沖電刺激模擬心臟跳動頻率, 研究結果顯示, 接受電刺激的心肌細胞與體外普通培養的心肌細胞相比, 收縮力強且生長更好。而且本實驗室有關電刺激前期實驗也表明，電刺激組rBMSCs中心肌早期發育轉錄因子GATA4 mRNA、Nkx2.5 mRNA表達量明顯高于空白對照組，心肌特異性蛋白ACTN2 mRNA、TNNT2 mRNA表達量明顯高于空白對照組[5]。本實驗所采用的電刺激是雙向脈沖交流電，以脈沖形式發放矩形方波的微小交流電，電刺激時培養液中電流方向隨時變化，細胞不會向某單一方向遷移。本實驗選用MEF-2C和Cx43作為基因和蛋白檢測指標。Cx43是一種重要的細胞間隙連接蛋白，主要表達在心肌組織中，位于心肌閏盤處，屬于晚期表達蛋白。MEF-2C在心臟形態形成中發揮著重要的作用，屬于早期轉錄因子。由于本實驗室一直專注于研究物理化學刺激對干細胞分化的影響，本室其他研究結果也表明，利用低頻脈沖電磁場[14]及雙周拉伸應變[15]也能誘導rBMSCs向心肌方向分化。
目前多數研究認為被用于細胞實驗的電刺激，脈寬范圍應為0.025～380 ms，頻率應在100 Hz以下，電壓應在10 V以下，在這個范圍以外的都是對細胞無效或者有害的。根據本實驗室前期實驗結果，本研究選用的電刺激參數為電壓2 V，頻率2 Hz，脈寬5 ms，作用時間為30 min/d、2 h/d、4 h/d、6 h/d，連續作用10 d。實驗結果表明，電刺激組心肌特異性基因MEF-2C mRNA、Cx43 mRNA相對表達量明顯高于空白對照組(P＜0.05)，且電刺激2 h/d組這兩個基因的表達量最高；電刺激組心肌特異性蛋白Cx43及MEF-2C蛋白相對表達量均明顯高于空白對照組(P＜0.05)，且在電刺激2 h/d組表達量最高。電刺激2 h/d組rBMSCs中MEF-2C基因及蛋白的相對表達量高于5-Aza組(P＜0.05)，但Cx43基因及蛋白的相對表達量低于5-Aza組，這可能是由于電刺激更有利于心肌早期蛋白的表達[5, 10]。因此本實驗得出結論：體外電刺激可以促進rBMSCs向心肌方向分化，本實驗條件下比較好的電刺激參數為電壓2 V，頻率2 Hz，脈寬5 ms，且2 h/d是較好的作用時間。但電刺激促rBMSCs向心肌分化的機制尚不清楚，電刺激與力及化學因素聯合作用也不清楚，所以還需進一步探討。
引言
骨髓間充質干細胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BMSCs)是一種存在于骨髓中，具有多向分化潛能，自我更新能力很強的成體干細胞。BMSCs在一定條件下可以向骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、心肌細胞、成纖維細胞、肌纖維細胞、上皮細胞和神經細胞系分化[1]。已有文獻報道，通過直接或間接的方法向冠狀動脈注入BMSCs可以有效治療慢性心臟病[2]。另外也有研究報道，BMSCs可以促進心肌再生[3]。由于心臟作為機體全身的“泵”器官，一直處于持續搏動的狀態，而心肌細胞處于力、電、生物化學各種因素共存的復雜微環境中，因此電刺激對心肌細胞的分化與生長起著至關重要的作用[4]。我們實驗室的前期研究發現，電刺激可調控大鼠骨髓間充質干細胞(rBMSCs)心肌特異性標志物GATA4 mRNA、Nkx2.5 mRNA、ACTN2 mRNA、TNNT2 mRNA的表達[5]。在本實驗中，我們將進一步探討體外不同的電刺激時間對rBMSCs心肌特異性標志物——肌細胞特異性增強因子-2C(myocyte-specific enhancer factor 2C, MEF-2C)和縫隙連接蛋白43(connexin 43, Cx43)的mRNA和蛋白表達的影響，期望為探討體外電刺激促進rBMSCs向心肌樣細胞分化以及可能的機制提供實驗基礎。
1 材料和方法
1.1 實驗動物、主要儀器和試劑
1.1.1 實驗動物
健康清潔SpragueDawley(SD)大鼠(4~6周齡)，體重為100~150 g，由四川大學動物實驗中心提供。
1.1.2 主要儀器和試劑
CO2細胞培養孵箱(SANYO公司)，CFX96TM Real-time PCR System(BIO-RAD公司), 澳洲胎牛血清(FBS)，DMEM低糖培養基干粉(Gibco公司)，胰蛋白酶、雙抗(Penicillin-Streptomycin Solution)(Hyclone公司), Trizol Reagent(Invitrogen公司), 逆轉錄聚合酶鏈反應試劑盒(IScriptTM cDNA Synthesis Kit)、實時熒光定量PCR試劑盒(SsoFastTM EvaGreen? Supermix)(BIO-RAD公司), 縫隙連接蛋白Cx43(connexin43, Cx43)抗體(Santa公司)，肌細胞特異性增強因子-2C(MEF-2C)抗體(proteintech，PTG公司)，辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔抗體(中杉金橋公司)。凝膠成像儀(ChemiDocTM XRS+ with Image LabTM, Bio-Rad, Inc., USA)。DMEM-LG基礎培養基：DMEM-LG+無菌雙蒸水；DMEM-LG完全培養基：DMEM-LG基礎培養基+15%胎牛血清+1%雙抗。
1.1.3 電刺激裝置
采用本實驗室自制的電刺激裝置[5]：該電刺激裝置由示波器、電壓控制系統、六孔板、碳棒電極、電線等組成。將碳棒電極固定在六孔板蓋子上，對六孔板中培養的細胞加載電刺激，參數為：電壓2 V，頻率2 Hz，脈寬5 ms。
1.2 rBMSCs的分離與培養
采用我們實驗室常規全骨髓貼壁法分離并鑒定rBMSCs[6-7]。首先，采用斷頸法處死SD大鼠，在無菌條件下分離出股骨和脛骨，用組織剪去除軟組織及骨膜，放入75%乙醇中浸泡消毒1 min。然后用PBS沖洗股骨和脛骨3遍，去除兩端骨骺，用無菌注射器吸取10 mL DMEM-LG基礎培養基沖出骨髓，直至骨頭發白，將骨髓收集至15 mL的離心管內，4℃，900 r/min離心5 min，棄除上清，再加入3 mL DMEM-LG完全培養基收集細胞，按3×105個/cm2的細胞密度接種于25 cm2細胞培養瓶中，然后將細胞瓶置于37℃、5% CO2飽和濕度的細胞孵箱中培養。細胞于接種后3 h首次換液，此后的72 h內每8 h換液1次；第4 d起，每隔3 d換液1次。待細胞生長至80%～90%融合狀態時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。選用第3代～第4代(P3～P4)細胞用于實驗，并于接種前對rBMSCs進行臺盼藍細胞活力計數，細胞活力均在98%以上。
1.3 實驗分組
將rBMSCs隨機分為三組：電刺激組、5-Aza組和空白對照組。各組均將rBMSCs以3×104個/cm2接種于6孔板中，DMEM-LG完全培養基培養，待細胞完全貼壁后，用含2% FBS的DMEM-LG培養基饑餓細胞過夜(12 h)。第二天吸去培養基后，換成DMEM-LG完全培養基，然后各組分別給予相應處理。
1.3.1 電刺激組
給予電壓2 V、頻率2 Hz、脈寬5 ms的電刺激，分別作用30 min/d、2 h/d、4 h/d、6 h/d，持續作用10 d，于實驗第11天收集樣本。
1.3.2 5-Aza組
用含10μmol/L 5-Aza的培養基誘導24 h后，換成DMEM-LG完全培養基繼續培養10 d，于實驗第11天收集樣本。
1.3.3 空白對照組
不作任何處理，采用DMEM-LG完全培養基靜態培養10 d，于實驗第11天收集樣本。
1.4 檢測指標
1.4.1 實時熒光定量PCR法
檢測各組MEF-2C mRNA和Cx43 mRNA表達。按照Trizol Reagent說明書分別收集電刺激組、5-Aza組和空白對照組的總mRNA。利用1%瓊脂糖凝膠電泳的方法對各組提取到的總mRNA進行完整性的檢測，經紫外分光光度計檢測A260與A280的比值以判斷總mRNA的純度，然后計算出所提總mRNA的濃度。從每組樣品中取1.5μg總mRNA逆轉錄生成cDNA，據濃度推算出所需體積。依據逆轉錄試劑盒使用說明書依次向EP管中加入反應液及樣本mRNA。將EP管置于PCR儀中，依次設定逆轉錄反應參數：25℃5 min，42℃30 min，85℃5 min，進行逆轉錄。取2μL生成的cDNA作為模板進行熒光定量PCR反應，按照SsoFastTM EvaGreen@ Supermix試劑盒說明書進行操作，反應體系為20μL。反應參數為：95℃變性10 s，59℃退火10 s，72℃延伸10 s，總共40個循環，同時做溶解曲線分析。用內參基因(GAPDH)來校正目的基因，即用目的基因表達量與內參基因表達量的比值來表示。GAPDH mRNA、MEF-2C mRNA、Cx43 mRNA引物序列如表 1所示。
表1
GAPDH mRNA、MEF-2c mRNA、Cx43 mRNA的Real-time PCR的引物序列
Table1.
Primer sequences of the real-time PCR for GAPDH mRNA, MEF-2c mRNA, and Cx43 mRNA
1.4.2 蛋白免疫印記實驗(Western blot)
檢測各組MEF-2C蛋白和Cx43蛋白表達。具體方法，分別采用4℃預冷的PBS漂洗電刺激組、5-Aza組和空白對照組細胞3次，每次5 min，洗完后每孔加入100μL預先配好的RIPA蛋白裂解液，用細胞刮子盡量刮下所有的細胞，分別將各組含有細胞碎片的裂解液移至相應的1.5 mL EP管中，靜置30 min(所有的操作都要在冰上進行)；然后經4℃, 12 000 r/min離心8 min后，小心吸取上清至新的EP管中。用BCA法對各組總蛋白進行定量，變性，后經Western blot跑膠，轉膜，封閉后孵育一抗(β-actin，MEF-2C，Cx43，1 :200)，4℃過夜。第二天經TBST漂洗，室溫下孵育二抗(辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔，1 :5 000)，37℃孵育2～3 h后，經TBST漂洗，加入ECL顯色液，在凝膠成像儀上顯影，蛋白條帶灰度值用Image Lab軟件進行分析。用內參蛋白(β-actin)來校正目的蛋白，即用目的蛋白條帶灰度值與內參蛋白條帶灰度值的比值來表示。
1.5 統計學分析
本實驗所有數據均采用SPSS 17.0統計軟件處理，所有參數檢測均有n=3。采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進行組間差別比較，用SNK法進行組間兩兩比較，用均數±標準差來表示每組數據，以P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 MEF-2C mRNA和Cx43 mRNA的表達
如圖 1所示，電刺激組與5-Aza組中的MEF-2C mRNA、Cx43 mRNA的表達量均明顯高于空白對照組(分別有P＜0.05)。不同時間的電刺激組之間相比較，2 h/d電刺激組rBMSCs中的2個心肌特異性基因的表達量最高(均有P＜0.05)。與5-Aza組比較，2 h/d電刺激組MEF-2C mRNA的表達量高于5-Aza組(P＜0.05), 而Cx43 mRNA的表達量低于5-Aza組(P＜0.05)。
圖1
各組rBMSCs的Cx43 mRNA、MEF-2C mRNA的相對表達量(與相應的空白對照組比較，*
compared to the corresponding control group, *
2.2 MEF-2C蛋白和Cx43蛋白的表達
如圖 2、圖 3所示，除空白對照組與電刺激6 h/d組沒有Cx43蛋白表達外，其余各電刺激組與5-Aza組的MEF-2C蛋白、Cx43蛋白表達量均明顯高于空白對照組(均有P＜0.05)。當電刺激時間加載至2 h/d時，rBMSCs心肌特異性蛋白MEF-2C、Cx43的表達量最高，此后隨著加載時間的推移，蛋白表達量逐漸下降。在電刺激30 min/d、2 h/d、4 h/d組中，MEF-2C蛋白的表達量均高于5-Aza組(均有P＜0.05)。但在5-Aza組中，Cx43蛋白的表達量高于2 h/d電刺激組(P＜0.05)。
圖2
各組rBMSCs的MEF-2C蛋白電泳條帶及其相對表達量(與相應的空白對照組比較，*
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圖3
各組rBMSCs的Cx43蛋白電泳條帶及其相對表達量(與相應的空白對照組比較，*
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3 討論
心肌梗死可能會引起嚴重的心肌功能異常, 但由于心肌細胞不可再生, 所以最終會導致心力衰竭。目前用于治療心梗的主要方法包括藥物治療和手術治療，雖然這些措施能緩解患者心悸、胸悶等癥狀，但是由于病程長、患者依從性差和治療費用昂貴等原因，治療效果常不理想[8]。因此，干細胞治療可以促心肌再生恢復心臟功能就成為一種新的治療方案[9]。而目前用于治療的干細胞主要有胚胎干細胞、脂肪間充質干細胞、BMSCs等。
BMSCs由于取材容易，自我更新能力強，相對無免疫原性，可以分化成多種細胞系的特點，因此已成為多種疾病治療的研究選擇[6]。目前已有多種方法可以促BMSCs向心肌方向分化，例如BMSCs與心肌細胞共培養，通過細胞與細胞間的接觸及相互作用，BMSCs就可以獲得心肌細胞的表面特征[7]；BMSCs經5-Aza作用后具有心肌樣細胞的亞顯微結構，并表達了MEF mRNA[10]。然而，與心肌細胞共培養及經5-Aza作用這些方法并不適合于臨床應用，而且5-Aza還具有潛在的非特異性去甲基化毒性作用[11]。因此國內外的研究者們正在尋找新的方法來促進BMSCs向心肌方向分化。
由于心臟是一個維持血液循環的泵，因此心肌細胞處于復雜的力學、電學、生物化學等各種因素存在的復雜微環境中，這些微環境對于維持心臟功能都是不可或缺的。內源性電磁場位于發育和再生組織細胞外隙和細胞胞漿內，因此電刺激對于控制細胞的功能是非常重要的。目前電刺激已經用于組織工程來加強干細胞的增殖與分化。Genovese等[12]用微小電流刺激心肌成纖維細胞，檢測到心肌特異型標志物Cx43的表達。Radisic等[13]以雙向矩形脈沖電刺激模擬心臟跳動頻率, 研究結果顯示, 接受電刺激的心肌細胞與體外普通培養的心肌細胞相比, 收縮力強且生長更好。而且本實驗室有關電刺激前期實驗也表明，電刺激組rBMSCs中心肌早期發育轉錄因子GATA4 mRNA、Nkx2.5 mRNA表達量明顯高于空白對照組，心肌特異性蛋白ACTN2 mRNA、TNNT2 mRNA表達量明顯高于空白對照組[5]。本實驗所采用的電刺激是雙向脈沖交流電，以脈沖形式發放矩形方波的微小交流電，電刺激時培養液中電流方向隨時變化，細胞不會向某單一方向遷移。本實驗選用MEF-2C和Cx43作為基因和蛋白檢測指標。Cx43是一種重要的細胞間隙連接蛋白，主要表達在心肌組織中，位于心肌閏盤處，屬于晚期表達蛋白。MEF-2C在心臟形態形成中發揮著重要的作用，屬于早期轉錄因子。由于本實驗室一直專注于研究物理化學刺激對干細胞分化的影響，本室其他研究結果也表明，利用低頻脈沖電磁場[14]及雙周拉伸應變[15]也能誘導rBMSCs向心肌方向分化。
目前多數研究認為被用于細胞實驗的電刺激，脈寬范圍應為0.025～380 ms，頻率應在100 Hz以下，電壓應在10 V以下，在這個范圍以外的都是對細胞無效或者有害的。根據本實驗室前期實驗結果，本研究選用的電刺激參數為電壓2 V，頻率2 Hz，脈寬5 ms，作用時間為30 min/d、2 h/d、4 h/d、6 h/d，連續作用10 d。實驗結果表明，電刺激組心肌特異性基因MEF-2C mRNA、Cx43 mRNA相對表達量明顯高于空白對照組(P＜0.05)，且電刺激2 h/d組這兩個基因的表達量最高；電刺激組心肌特異性蛋白Cx43及MEF-2C蛋白相對表達量均明顯高于空白對照組(P＜0.05)，且在電刺激2 h/d組表達量最高。電刺激2 h/d組rBMSCs中MEF-2C基因及蛋白的相對表達量高于5-Aza組(P＜0.05)，但Cx43基因及蛋白的相對表達量低于5-Aza組，這可能是由于電刺激更有利于心肌早期蛋白的表達[5, 10]。因此本實驗得出結論：體外電刺激可以促進rBMSCs向心肌方向分化，本實驗條件下比較好的電刺激參數為電壓2 V，頻率2 Hz，脈寬5 ms，且2 h/d是較好的作用時間。但電刺激促rBMSCs向心肌分化的機制尚不清楚，電刺激與力及化學因素聯合作用也不清楚，所以還需進一步探討。
