引用本文： 項樺, 陳銳, 武姍, 席大力, 龍思琪, 沈圓, 范增杰, 任利玲. 基于細胞膜片技術構建三維真皮樣組織的體外研究. 中國修復重建外科雜志, 2020, 34(1): 116-123. doi: 10.7507/1002-1892.201904039 復制
自體皮膚移植修復皮膚大面積缺損時，往往因術后皮疹反應及瘢痕攣縮等影響修復效果，且自體皮膚存在來源有限的問題 [1-3]。因此，構建組織工程真皮對皮膚缺損修復、再生及功能重建具有重要作用。細胞膜片技術保留了細胞及細胞外基質結構，更接近于人正常組織[4]。與人工合成真皮替代物及天然脫細胞真皮基質相比，細胞膜片可避免使用外源性支架材料導致的一系列問題[5-6]，而且因自身含有細胞，可直接參與組織修復，從而提高傷口愈合速率。此外，有研究證實通過膜片基底處的黏聯蛋白將單層膜片逐層疊加，可以構建具有一定厚度的三維組織[7-8]。上述研究結果均提示細胞膜片技術有望用于制備組織工程真皮。
研究表明，內皮細胞在構建三維組織結構中非常重要[9-11]；BMSCs 因免疫原性較低及具有多向分化潛能，是再生醫學的研究熱點之一[12-13]；皮膚成纖維細胞是真皮組織的主要構成細胞，也是皮膚組織受損后的主要修復細胞[14]。故本課題組前期將內皮細胞接種到未分化干細胞膜片上，發現內皮細胞在膜片上遷移，重排形成血管網絡結構[15]。皮膚功能的正常發揮與維持離不開血液供應。基于此，本研究擬將預血管化干細胞膜片與 2 層人皮膚成纖維細胞（human dermal fibroblasts，HDFs）膜片復合形成三明治樣結構，進一步折疊后獲得具有一定厚度的三維真皮樣組織，通過免疫熒光染色及免疫組織化學染色檢測其中細胞分化、血管網絡形成及Ⅰ、Ⅲ型膠原生成和表達，為組織工程真皮的構建提供新的策略。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
2～3 周齡新西蘭大白兔 6 只，雌雄不限，體質量 1.2～1.8 kg，由蘭州獸醫研究所提供。HDFs（上海中喬新舟生物科技有限公司）；人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs；上海歌凡生物科技有限公司）。FBS（浙江天杭生物科技有限公司）；H-DMEM、DMEM/F12、L-DMEM、青霉素-鏈霉素雙抗（HyClone 公司，美國）；PBS 緩沖液（北京索萊寶生物科技有限公司）；胰蛋白酶、抗壞血酸（Sigma 公司，美國）；HE 試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司）；抗兔血小板內皮細胞黏附分子 CD31、Ⅰ型膠原抗體、Ⅲ型膠原抗體（Abcam 公司，英國）。恒溫培養箱（Heraeus 公司，德國）；倒置相差顯微鏡、倒置熒光顯微鏡（Olympus 公司，日本）；離心機（上海安亨科學儀器廠）；磁力振蕩器（江蘇環保儀器廠）。
1.2 細胞培養及觀察
① 采用全骨髓貼壁法分離培養兔 BMSCs（rabbit BMSCs，rBMSCs）。取 2 只新西蘭大白兔，脫頸法處死后取股骨和脛骨，去除附著的軟組織，無菌剪開骨兩端，用含 1% 青霉素-鏈霉素雙抗的 PBS 緩沖液將骨髓沖出至骨髓腔發白；置于含 12%FBS、1% 青霉素-鏈霉素雙抗的 DMEM/F12 培養基中培養，48 h 后首次半定量換液，之后隔天換液，待細胞融合至 80%～90% 時進行傳代。② 取 HDFs 置于含 10%FBS、1% 青霉素-鏈霉素雙抗的 L-DMEM 培養基中培養，每 2～3 天更換 1 次培養液，待培養瓶內細胞貼壁率達 80%～90% 時傳代培養。③ 取 HUVECs 置于含 FBS 25 mL、VEGF 5 mL、1% 青霉素-鏈霉素雙抗 5 mL 的內皮細胞培養基中，每 2～3 天更換 1 次培養液。上述細胞培養期間，采用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態及生長狀態。
1.3 體外構建細胞膜片及觀測
1.3.1 rBMSCs膜片及 HDFs膜片制備
取第 2 代 rBMSCs 采用胰蛋白酶消化制成細胞懸液，以 9×104個/cm2密度接種至 6 孔板，每孔加入 2.5 mL 膜片條件培養基（含 50 mg/L 抗壞血酸、1% 青霉素-鏈霉素雙抗、10%FBS 的 H-DMEM），于 37℃、5%CO2 恒溫培養箱內孵育，隔天換液。培養 2 周后 6 孔板底可見一層透明狀未分化 rBMSCs 膜片。使用細胞刮刀輕刮膜片邊緣，使其與 6 孔板內壁分離，同時配合鑷子輕輕夾住將細胞膜片整片揭起[16]。取第 3 代 HDFs 同上法培養制備 HDFs 膜片。培養期間于倒置相差顯微鏡下觀察細胞膜片形態變化。
1.3.2 rBMSCs預血管化膜片制備
取第 3 代 HUVECs 采用胰蛋白酶消化后，以 5×104個/cm2密度均勻接種于 1.3.1 中制備的 rBMSCs 膜片上，加入以 1∶1 比例混合的膜片條件培養基與內皮細胞完全培養基，于 37℃、5%CO2 恒溫培養箱內孵育培養，制備預血管化膜片。
1.3.3 觀測指標
取 1.3.2 中孵育培養 1、3、7、14 d 的預血管化膜片進行觀察。① 細胞形態觀察：各時間點采用倒置相差顯微鏡觀察預血管化膜片上細胞形態變化。② 組織學觀察：預血管化膜片以 OCT 包埋后冰凍橫切片，片厚 5 μm，常規 HE 染色后鏡下觀察。以膜片條件培養基培養 1、3、7、14 d 的 rBMSCs 膜片作為對照。③ 免疫熒光染色觀察：預血管化膜片于 4% 多聚甲醛固定 30 min，0.2%Triton X-100 通透 10 min，室溫下正常山羊血清封閉 30 min，PBS 漂洗，加入鼠抗人 CD31（1∶30），4℃ 條件下保濕盒內過夜。次日，PBS 漂洗后避光加入山羊抗鼠二抗（1∶500），室溫下孵育 2 h，PBS 漂洗后加入抗熒光淬滅劑。倒置熒光顯微鏡下觀察內皮細胞的遷移、聚集及毛細血管網絡生成情況。
1.4 基于細胞膜片技術體外構建三維真皮樣組織及觀測
1.4.1 真皮樣組織構建方法
利用高溫高壓滅菌蓋玻片作為皿間轉移細胞膜片載體，用鑷子將從培養皿底分離的細胞膜片轉移并平鋪于蓋玻片上，并移至新培養皿中。將培養 7 d 的預血管化細胞膜片與 2 層 HDFs 膜片疊加形成三明治樣結構，作為實驗組；將 rBMSCs 膜片與 2 層 HDFs 細胞膜片疊加，作為對照組。待 3 層膜片重疊之后，使用鑷子將其進行 2 次對折，形成具有 12 層膜片結構的三維真皮樣組織，將蓋玻片放于三維真皮樣組織上方，利用蓋玻片自身重力使其于皿內集中。實驗組置于以 1∶1 比例混合的膜片條件培養基與內皮細胞完全培養基后，繼續培養 24 h；對照組置于膜片條件培養基中培養相同時間。培養后去除蓋玻片，兩組三維真皮樣組織結構均緊密無分散。見圖1。
圖1
基于細胞膜片技術構建三維真皮樣組織示意圖
a. 實驗組；b. 對照組
Figure1. The schematic of the fabrication of three-dimensional dermoid tissue based on cell sheet technologya. Experimental group; b. Control group
1.4.2 觀測指標
① 免疫熒光染色觀察：取兩組三維真皮樣組織行冰凍橫切片，片厚 5 μm，置于 4% 多聚甲醛固定 30 min 后行 CD31 免疫熒光染色，方法同細胞膜片免疫熒光染色；封片前加入 0.5 μg/mL DAPI 進行核染，靜置 5 min 后 PBS 漂洗，干燥封片。熒光顯微鏡下觀察內皮細胞在細胞膜片組織中的分布。
② 免疫組織化學染色觀察：將兩組三維真皮樣組織同上法切片、固定后，添加內源性過氧化物酶阻斷劑，室溫孵育 10 min；PBS 漂洗，山羊血清封閉 10 min；分別滴加Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原一抗，37℃ 條件下孵育 1 h；PBS 漂洗后加生物素標記山羊抗小鼠 IgG，室溫下孵育 20 min；PBS 漂洗后加辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素，室溫孵育 15 min；PBS 漂洗后滴加 DAB 顯色液，室溫孵育 7 min；自來水沖洗，蘇木素復染 20 s，沖洗返藍，脫水透明，中性樹膠封片。鏡下觀察Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達，棕褐色為膠原陽性染色。兩組各取 3 張切片，于 200 倍鏡下每張切片隨機取 8 個視野，用 Image-Pro Plus 6.0 圖像處理軟件計算Ⅰ、Ⅲ型膠原表達量。
1.5 統計學方法
采用 SPSS22.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 培養細胞及細胞膜片觀察
2.1.1 細胞形態觀察
原代培養的 rBMSCs 可見細胞貼壁生長，以多角形、長梭形為主；傳代后培養 12 h 細胞即可貼壁伸展，懸浮細胞明顯減少，細胞大多為長梭形均勻貼于底壁，第 1 代細胞經 1～2 次換液即可鋪滿瓶底。第 3 代 HDFs 呈長梭形、多角形貼壁伸展，細胞核較大，卵圓形靠近細胞質中央。HUVECs 成簇貼壁生長，形態多呈卵圓形，類鋪路石樣增殖。見圖2。
圖2
倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態
a. 原代 rBMSCs（×100）；b. 第 2 代 rBMSCs（×40）；c. 第 3 代 HDFs（×200）；d. HUVECs（×100）
Figure2. Cell morphology under inverted phase contrast microscopea. Primary rBMSCs (×100); b. The 2nd generation rBMSCs (×40); c. The 3rd generation HDFs (×200); d. HUVECs (×100)
2.1.2 細胞膜片形態觀察
HDFs 經連續培養 2 周后獲得 HDFs 膜片，鏡下見細胞緊密依靠復層生長，形態由細長梭形變為不規則形。rBMSCs 經連續培養 2 周后獲得 rBMSCs 膜片，鏡下見細胞密集生長，長梭形緊密圍繞呈漩渦狀。HUVECs 接種于 rBMSCs 膜片 3 d 后在膜片上重新排列，形成空泡，7 d 后形成網狀結構，14 d 后網狀結構更明顯。見圖3。
圖3
倒置相差顯微鏡下觀察細胞膜片形態（×100）
a. HDFs 膜片；b. rBMSCs 膜片；c～f. HUVECs 接種 1、3、7、14 d 的預血管化膜片
Figure3. The morphology of the cell sheet under inverted phase contrast microscope (×100)a. HDFs sheet; b. rBMSCs sheet; c-f. Pre-vascularized cell sheet after HUVECs inoculation for 1, 3, 7, and 14 days
2.1.3 rBMSCs膜片及預血管化膜片觀察
① 組織學觀察：培養 1 d 時，預血管化膜片可觀察到部分細胞突起，膜片間有空泡形成。隨著培養時間延長，接種的 HUVECs 重排，膜片間空泡形成更明顯，膜片寬度增加。而 rBMSCs 膜片僅觀察到膜片增厚，未見空泡結構形成。見圖4。② 免疫熒光染色觀察：培養 1 d 后，預血管化膜片上 HUVECs 開始遷移聚集；3 d 后 HUVECs 重排、相互融合，可見空泡樣結構；7 d 后可見微血管管腔形成；14 d 后微血管管腔結構更明顯。見圖5。
圖4
細胞膜片組織學觀察（HE×400）
從左至右分別為培養 1、3、7、14 d a. rBMSCs 膜片；b. 預血管化膜片
Figure4. Histological observation of cell sheet (HE×400)From left to right for 1, 3, 7, and 14 days a. rBMSCs sheet; b. Pre-vascularized cell sheet
圖5
預血管化膜片免疫熒光染色觀察（倒置熒光顯微鏡×100）
a. 1 d；b. 3 d；c. 7 d；d. 14 d
Figure5. Immunofluorescence staining of pre-vascularized cell sheet (Inverted fluorescence microscope×100)a. At 1 day; b. At 3 days; c. At 7 days; d. At 14 days
2.2 三維真皮樣組織觀測
2.2.1 免疫熒光染色觀察
實驗組內皮細胞呈陽性表達，可遷移至整個三維真皮樣組織中，rBMSCs、HDFs 及 HUVECs 細胞排列整齊，細胞呈有序生長。而對照組 CD31 染色呈陰性，細胞隨機排列。見圖6。
圖6
三維真皮樣組織免疫熒光染色觀察（熒光顯微鏡×200）
從左至右分別為 CD31 染色、DAPI 染色及兩者疊加 a. 實驗組；b. 對照組
Figure6. Immunofluorescence staining of three-dimensional dermoid tissue (Fluorescence microscope×200)From left to right for CD31 staining, DAPI staining, and merge a. Experimental group; b. Control group
2.2.2 免疫組織化學染色觀察
兩組Ⅰ、Ⅲ型膠原均呈陽性表達。實驗組細胞基質分布規律，細胞排列緊密，呈“蜂巢狀”結構；對照組細胞無序排列，基質分散，無類“蜂巢狀”結構。見圖7。實驗組及對照組Ⅰ型膠原表達量分別為 60 547.4±36 646.0、62 799.1±31 308.5，Ⅲ型膠原表達量分別為 69 993.4±44 881.6、73 436.4±31 791.6，組間比較差異均無統計學意義（t=?0.132，P=0.897；t=?0.177，P=0.862）。
圖7
三維真皮樣組織免疫組織化學染色觀察（×200）
左側為對照組、右側為實驗組 a. Ⅰ型膠原；b. Ⅲ型膠原
Figure7. Immunohistochemical staining of three-dimensional dermoid tissue (×200)Left for control group and right for experimental group a. Collagen type Ⅰ; b. Collagen type Ⅲ
3 討論
組織工程真皮的發展為皮膚大面積缺損患者帶來了希望。傳統組織工程真皮替代物多為種子細胞與外源性支架材料相結合，或完全脫去細胞，僅存膠原纖維作為真皮再生模板，而自身不生成細胞兩大類。前者由于需使用外源性支架材料，修復過程中具有一定的免疫原性，易造成創口炎性反應；后者雖避免了免疫原性導致的問題，但因自身不含細胞，導致創傷愈合需時較久、修復效果不佳等問題。細胞膜片技術的發展為克服上述真皮替代物缺陷提供了思路。該技術無需借助外源性支架，避免了胰蛋白酶消化對細胞造成的損傷，通過體外擴增融合細胞，刺激細胞外基質獲得致密膜片狀細胞結構，在修復缺損、改善功能、組織再生中擁有良好的應用前景[17-22]。
本研究以 rBMSCs、HUVECs 及 HDFs 作為種子細胞，在體外構建三維真皮樣組織。rBMSCs 取材容易，自我更新復制能力強，免疫原性低，有分化潛能。共培養中干細胞不僅提供了具有多向分化能力的靶細胞來源，還可以作為促進組織動態平衡、新陳代謝、生長和修復的輔助細胞[23]。有學者將新生大鼠心肌細胞與單層人羊水干細胞共培養，結果顯示干細胞可以分化為心肌細胞樣表型，可以與心肌細胞建立通訊[24]。趙娜等[25]將人臍帶間充質干細胞及小鼠 BMSCs 分別于 1、4 和 15 d 經尾靜脈注射于小鼠體內，結果提示異種及同種異體 MSCs 移植不僅不引起受體動物的急慢性免疫排斥反應，并且能夠發揮免疫調節作用。因此，本實驗使用 rBMSCs 膜片與 HUVECs 共培養后復合 HDFs 膜片的方法具有理論及實踐可行性。
目前，常用的細胞膜片制備技術主要有 3 種：溫度敏感式培養技術、磁性分離技術以及細胞刮治技術。溫度敏感式培養技術是將細胞接種于溫敏性材料表面，當溫度降低到臨界溫度以下時，細胞膜片能夠自皿底完整剝落，但操作程序復雜、需特殊材料，且該材料可能會對細胞的增殖分化產生一定影響；而且該技術所獲得的膜片只有單層，很難滿足實驗以及臨床需求。磁性分離技術是將細胞與磁性納米脂質體混合培養后，接種到低黏附的培養皿中，再將培養皿放在釹磁鐵上，通過磁力將細胞吸附到皿底，從而形成細胞膜片。雖然該方法能形成 10～15 層的細胞膜片，但操作過程仍較復雜，實際研究應用較少。本實驗采用細胞刮治技術獲取細胞膜片，并利用高溫高壓滅菌的蓋玻片作為皿間轉移細胞膜片載體，構建三明治樣結構，進一步折疊后形成 12 層類真皮樣組織。該方法不用其他特殊材料，操作步驟簡單、方便。
本實驗中我們將 HUVECS 接種在 rBMSCs 膜片上，培養后可見內皮細胞在膜片上遷移、重排，形成血管網絡結構，提示體外可以構建預血管化膜片，與課題組前期研究結果一致[11]。進一步將預血管化膜片夾在 2 層 HDFs 膜片中形成三明治樣結構，培養 24 h 后 CD31 免疫熒光染色可觀察到內皮細胞分布在整個結構中，形成血管網絡結構，細胞呈有序排列，表明細胞之間相互連接，細胞基質相互融合。免疫組織化學染色發現因內皮細胞的加入，所構建的三維真皮樣組織呈現規律的互相連接的“蜂巢狀”結構，統計結果顯示實驗組與對照組Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原表達量差異無統計學意義，分析可能是體外培養時間過短，內皮細胞短期內不會影響膠原生成。
綜上述，采用 HDFs 膜片與 rBMSCs 預血管化膜片可以復合構建三維結構預血管化真皮樣組織，而且其超微結構與天然真皮類似，可形成互相交織的網狀結構；其內富含基質及纖維，可表達主要存在于皮膚真皮層的Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原。預血管化結構為移植體內后構建功能化血管提供了可能，也為工程化組織在體內的存活制造了營養通路，具有形成組織工程真皮的潛力，為組織工程真皮構建提供了新的思路。
作者貢獻：項樺、任利玲、范增杰負責實驗設計；項樺、陳銳、武姍、席大力負責實驗實施及論文寫作；項樺、陳銳、龍思琪、沈圓負責資料收集及數據整理分析。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。課題經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經蘭州大學口腔醫學院動物實驗倫理委員會批準（201710），實驗動物使用許可證號：SYXK（甘）2015-0001。
自體皮膚移植修復皮膚大面積缺損時，往往因術后皮疹反應及瘢痕攣縮等影響修復效果，且自體皮膚存在來源有限的問題 [1-3]。因此，構建組織工程真皮對皮膚缺損修復、再生及功能重建具有重要作用。細胞膜片技術保留了細胞及細胞外基質結構，更接近于人正常組織[4]。與人工合成真皮替代物及天然脫細胞真皮基質相比，細胞膜片可避免使用外源性支架材料導致的一系列問題[5-6]，而且因自身含有細胞，可直接參與組織修復，從而提高傷口愈合速率。此外，有研究證實通過膜片基底處的黏聯蛋白將單層膜片逐層疊加，可以構建具有一定厚度的三維組織[7-8]。上述研究結果均提示細胞膜片技術有望用于制備組織工程真皮。
研究表明，內皮細胞在構建三維組織結構中非常重要[9-11]；BMSCs 因免疫原性較低及具有多向分化潛能，是再生醫學的研究熱點之一[12-13]；皮膚成纖維細胞是真皮組織的主要構成細胞，也是皮膚組織受損后的主要修復細胞[14]。故本課題組前期將內皮細胞接種到未分化干細胞膜片上，發現內皮細胞在膜片上遷移，重排形成血管網絡結構[15]。皮膚功能的正常發揮與維持離不開血液供應。基于此，本研究擬將預血管化干細胞膜片與 2 層人皮膚成纖維細胞（human dermal fibroblasts，HDFs）膜片復合形成三明治樣結構，進一步折疊后獲得具有一定厚度的三維真皮樣組織，通過免疫熒光染色及免疫組織化學染色檢測其中細胞分化、血管網絡形成及Ⅰ、Ⅲ型膠原生成和表達，為組織工程真皮的構建提供新的策略。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
2～3 周齡新西蘭大白兔 6 只，雌雄不限，體質量 1.2～1.8 kg，由蘭州獸醫研究所提供。HDFs（上海中喬新舟生物科技有限公司）；人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs；上海歌凡生物科技有限公司）。FBS（浙江天杭生物科技有限公司）；H-DMEM、DMEM/F12、L-DMEM、青霉素-鏈霉素雙抗（HyClone 公司，美國）；PBS 緩沖液（北京索萊寶生物科技有限公司）；胰蛋白酶、抗壞血酸（Sigma 公司，美國）；HE 試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司）；抗兔血小板內皮細胞黏附分子 CD31、Ⅰ型膠原抗體、Ⅲ型膠原抗體（Abcam 公司，英國）。恒溫培養箱（Heraeus 公司，德國）；倒置相差顯微鏡、倒置熒光顯微鏡（Olympus 公司，日本）；離心機（上海安亨科學儀器廠）；磁力振蕩器（江蘇環保儀器廠）。
1.2 細胞培養及觀察
① 采用全骨髓貼壁法分離培養兔 BMSCs（rabbit BMSCs，rBMSCs）。取 2 只新西蘭大白兔，脫頸法處死后取股骨和脛骨，去除附著的軟組織，無菌剪開骨兩端，用含 1% 青霉素-鏈霉素雙抗的 PBS 緩沖液將骨髓沖出至骨髓腔發白；置于含 12%FBS、1% 青霉素-鏈霉素雙抗的 DMEM/F12 培養基中培養，48 h 后首次半定量換液，之后隔天換液，待細胞融合至 80%～90% 時進行傳代。② 取 HDFs 置于含 10%FBS、1% 青霉素-鏈霉素雙抗的 L-DMEM 培養基中培養，每 2～3 天更換 1 次培養液，待培養瓶內細胞貼壁率達 80%～90% 時傳代培養。③ 取 HUVECs 置于含 FBS 25 mL、VEGF 5 mL、1% 青霉素-鏈霉素雙抗 5 mL 的內皮細胞培養基中，每 2～3 天更換 1 次培養液。上述細胞培養期間，采用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態及生長狀態。
1.3 體外構建細胞膜片及觀測
1.3.1 rBMSCs膜片及 HDFs膜片制備
取第 2 代 rBMSCs 采用胰蛋白酶消化制成細胞懸液，以 9×104個/cm2密度接種至 6 孔板，每孔加入 2.5 mL 膜片條件培養基（含 50 mg/L 抗壞血酸、1% 青霉素-鏈霉素雙抗、10%FBS 的 H-DMEM），于 37℃、5%CO2 恒溫培養箱內孵育，隔天換液。培養 2 周后 6 孔板底可見一層透明狀未分化 rBMSCs 膜片。使用細胞刮刀輕刮膜片邊緣，使其與 6 孔板內壁分離，同時配合鑷子輕輕夾住將細胞膜片整片揭起[16]。取第 3 代 HDFs 同上法培養制備 HDFs 膜片。培養期間于倒置相差顯微鏡下觀察細胞膜片形態變化。
1.3.2 rBMSCs預血管化膜片制備
取第 3 代 HUVECs 采用胰蛋白酶消化后，以 5×104個/cm2密度均勻接種于 1.3.1 中制備的 rBMSCs 膜片上，加入以 1∶1 比例混合的膜片條件培養基與內皮細胞完全培養基，于 37℃、5%CO2 恒溫培養箱內孵育培養，制備預血管化膜片。
1.3.3 觀測指標
取 1.3.2 中孵育培養 1、3、7、14 d 的預血管化膜片進行觀察。① 細胞形態觀察：各時間點采用倒置相差顯微鏡觀察預血管化膜片上細胞形態變化。② 組織學觀察：預血管化膜片以 OCT 包埋后冰凍橫切片，片厚 5 μm，常規 HE 染色后鏡下觀察。以膜片條件培養基培養 1、3、7、14 d 的 rBMSCs 膜片作為對照。③ 免疫熒光染色觀察：預血管化膜片于 4% 多聚甲醛固定 30 min，0.2%Triton X-100 通透 10 min，室溫下正常山羊血清封閉 30 min，PBS 漂洗，加入鼠抗人 CD31（1∶30），4℃ 條件下保濕盒內過夜。次日，PBS 漂洗后避光加入山羊抗鼠二抗（1∶500），室溫下孵育 2 h，PBS 漂洗后加入抗熒光淬滅劑。倒置熒光顯微鏡下觀察內皮細胞的遷移、聚集及毛細血管網絡生成情況。
1.4 基于細胞膜片技術體外構建三維真皮樣組織及觀測
1.4.1 真皮樣組織構建方法
利用高溫高壓滅菌蓋玻片作為皿間轉移細胞膜片載體，用鑷子將從培養皿底分離的細胞膜片轉移并平鋪于蓋玻片上，并移至新培養皿中。將培養 7 d 的預血管化細胞膜片與 2 層 HDFs 膜片疊加形成三明治樣結構，作為實驗組；將 rBMSCs 膜片與 2 層 HDFs 細胞膜片疊加，作為對照組。待 3 層膜片重疊之后，使用鑷子將其進行 2 次對折，形成具有 12 層膜片結構的三維真皮樣組織，將蓋玻片放于三維真皮樣組織上方，利用蓋玻片自身重力使其于皿內集中。實驗組置于以 1∶1 比例混合的膜片條件培養基與內皮細胞完全培養基后，繼續培養 24 h；對照組置于膜片條件培養基中培養相同時間。培養后去除蓋玻片，兩組三維真皮樣組織結構均緊密無分散。見圖1。
圖1
基于細胞膜片技術構建三維真皮樣組織示意圖
a. 實驗組；b. 對照組
Figure1. The schematic of the fabrication of three-dimensional dermoid tissue based on cell sheet technologya. Experimental group; b. Control group
1.4.2 觀測指標
① 免疫熒光染色觀察：取兩組三維真皮樣組織行冰凍橫切片，片厚 5 μm，置于 4% 多聚甲醛固定 30 min 后行 CD31 免疫熒光染色，方法同細胞膜片免疫熒光染色；封片前加入 0.5 μg/mL DAPI 進行核染，靜置 5 min 后 PBS 漂洗，干燥封片。熒光顯微鏡下觀察內皮細胞在細胞膜片組織中的分布。
② 免疫組織化學染色觀察：將兩組三維真皮樣組織同上法切片、固定后，添加內源性過氧化物酶阻斷劑，室溫孵育 10 min；PBS 漂洗，山羊血清封閉 10 min；分別滴加Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原一抗，37℃ 條件下孵育 1 h；PBS 漂洗后加生物素標記山羊抗小鼠 IgG，室溫下孵育 20 min；PBS 漂洗后加辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素，室溫孵育 15 min；PBS 漂洗后滴加 DAB 顯色液，室溫孵育 7 min；自來水沖洗，蘇木素復染 20 s，沖洗返藍，脫水透明，中性樹膠封片。鏡下觀察Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達，棕褐色為膠原陽性染色。兩組各取 3 張切片，于 200 倍鏡下每張切片隨機取 8 個視野，用 Image-Pro Plus 6.0 圖像處理軟件計算Ⅰ、Ⅲ型膠原表達量。
1.5 統計學方法
采用 SPSS22.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 培養細胞及細胞膜片觀察
2.1.1 細胞形態觀察
原代培養的 rBMSCs 可見細胞貼壁生長，以多角形、長梭形為主；傳代后培養 12 h 細胞即可貼壁伸展，懸浮細胞明顯減少，細胞大多為長梭形均勻貼于底壁，第 1 代細胞經 1～2 次換液即可鋪滿瓶底。第 3 代 HDFs 呈長梭形、多角形貼壁伸展，細胞核較大，卵圓形靠近細胞質中央。HUVECs 成簇貼壁生長，形態多呈卵圓形，類鋪路石樣增殖。見圖2。
圖2
倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態
a. 原代 rBMSCs（×100）；b. 第 2 代 rBMSCs（×40）；c. 第 3 代 HDFs（×200）；d. HUVECs（×100）
Figure2. Cell morphology under inverted phase contrast microscopea. Primary rBMSCs (×100); b. The 2nd generation rBMSCs (×40); c. The 3rd generation HDFs (×200); d. HUVECs (×100)
2.1.2 細胞膜片形態觀察
HDFs 經連續培養 2 周后獲得 HDFs 膜片，鏡下見細胞緊密依靠復層生長，形態由細長梭形變為不規則形。rBMSCs 經連續培養 2 周后獲得 rBMSCs 膜片，鏡下見細胞密集生長，長梭形緊密圍繞呈漩渦狀。HUVECs 接種于 rBMSCs 膜片 3 d 后在膜片上重新排列，形成空泡，7 d 后形成網狀結構，14 d 后網狀結構更明顯。見圖3。
圖3
倒置相差顯微鏡下觀察細胞膜片形態（×100）
a. HDFs 膜片；b. rBMSCs 膜片；c～f. HUVECs 接種 1、3、7、14 d 的預血管化膜片
Figure3. The morphology of the cell sheet under inverted phase contrast microscope (×100)a. HDFs sheet; b. rBMSCs sheet; c-f. Pre-vascularized cell sheet after HUVECs inoculation for 1, 3, 7, and 14 days
2.1.3 rBMSCs膜片及預血管化膜片觀察
① 組織學觀察：培養 1 d 時，預血管化膜片可觀察到部分細胞突起，膜片間有空泡形成。隨著培養時間延長，接種的 HUVECs 重排，膜片間空泡形成更明顯，膜片寬度增加。而 rBMSCs 膜片僅觀察到膜片增厚，未見空泡結構形成。見圖4。② 免疫熒光染色觀察：培養 1 d 后，預血管化膜片上 HUVECs 開始遷移聚集；3 d 后 HUVECs 重排、相互融合，可見空泡樣結構；7 d 后可見微血管管腔形成；14 d 后微血管管腔結構更明顯。見圖5。
圖4
細胞膜片組織學觀察（HE×400）
從左至右分別為培養 1、3、7、14 d a. rBMSCs 膜片；b. 預血管化膜片
Figure4. Histological observation of cell sheet (HE×400)From left to right for 1, 3, 7, and 14 days a. rBMSCs sheet; b. Pre-vascularized cell sheet
圖5
預血管化膜片免疫熒光染色觀察（倒置熒光顯微鏡×100）
a. 1 d；b. 3 d；c. 7 d；d. 14 d
Figure5. Immunofluorescence staining of pre-vascularized cell sheet (Inverted fluorescence microscope×100)a. At 1 day; b. At 3 days; c. At 7 days; d. At 14 days
2.2 三維真皮樣組織觀測
2.2.1 免疫熒光染色觀察
實驗組內皮細胞呈陽性表達，可遷移至整個三維真皮樣組織中，rBMSCs、HDFs 及 HUVECs 細胞排列整齊，細胞呈有序生長。而對照組 CD31 染色呈陰性，細胞隨機排列。見圖6。
圖6
三維真皮樣組織免疫熒光染色觀察（熒光顯微鏡×200）
從左至右分別為 CD31 染色、DAPI 染色及兩者疊加 a. 實驗組；b. 對照組
Figure6. Immunofluorescence staining of three-dimensional dermoid tissue (Fluorescence microscope×200)From left to right for CD31 staining, DAPI staining, and merge a. Experimental group; b. Control group
2.2.2 免疫組織化學染色觀察
兩組Ⅰ、Ⅲ型膠原均呈陽性表達。實驗組細胞基質分布規律，細胞排列緊密，呈“蜂巢狀”結構；對照組細胞無序排列，基質分散，無類“蜂巢狀”結構。見圖7。實驗組及對照組Ⅰ型膠原表達量分別為 60 547.4±36 646.0、62 799.1±31 308.5，Ⅲ型膠原表達量分別為 69 993.4±44 881.6、73 436.4±31 791.6，組間比較差異均無統計學意義（t=?0.132，P=0.897；t=?0.177，P=0.862）。
圖7
三維真皮樣組織免疫組織化學染色觀察（×200）
左側為對照組、右側為實驗組 a. Ⅰ型膠原；b. Ⅲ型膠原
Figure7. Immunohistochemical staining of three-dimensional dermoid tissue (×200)Left for control group and right for experimental group a. Collagen type Ⅰ; b. Collagen type Ⅲ
3 討論
組織工程真皮的發展為皮膚大面積缺損患者帶來了希望。傳統組織工程真皮替代物多為種子細胞與外源性支架材料相結合，或完全脫去細胞，僅存膠原纖維作為真皮再生模板，而自身不生成細胞兩大類。前者由于需使用外源性支架材料，修復過程中具有一定的免疫原性，易造成創口炎性反應；后者雖避免了免疫原性導致的問題，但因自身不含細胞，導致創傷愈合需時較久、修復效果不佳等問題。細胞膜片技術的發展為克服上述真皮替代物缺陷提供了思路。該技術無需借助外源性支架，避免了胰蛋白酶消化對細胞造成的損傷，通過體外擴增融合細胞，刺激細胞外基質獲得致密膜片狀細胞結構，在修復缺損、改善功能、組織再生中擁有良好的應用前景[17-22]。
本研究以 rBMSCs、HUVECs 及 HDFs 作為種子細胞，在體外構建三維真皮樣組織。rBMSCs 取材容易，自我更新復制能力強，免疫原性低，有分化潛能。共培養中干細胞不僅提供了具有多向分化能力的靶細胞來源，還可以作為促進組織動態平衡、新陳代謝、生長和修復的輔助細胞[23]。有學者將新生大鼠心肌細胞與單層人羊水干細胞共培養，結果顯示干細胞可以分化為心肌細胞樣表型，可以與心肌細胞建立通訊[24]。趙娜等[25]將人臍帶間充質干細胞及小鼠 BMSCs 分別于 1、4 和 15 d 經尾靜脈注射于小鼠體內，結果提示異種及同種異體 MSCs 移植不僅不引起受體動物的急慢性免疫排斥反應，并且能夠發揮免疫調節作用。因此，本實驗使用 rBMSCs 膜片與 HUVECs 共培養后復合 HDFs 膜片的方法具有理論及實踐可行性。
目前，常用的細胞膜片制備技術主要有 3 種：溫度敏感式培養技術、磁性分離技術以及細胞刮治技術。溫度敏感式培養技術是將細胞接種于溫敏性材料表面，當溫度降低到臨界溫度以下時，細胞膜片能夠自皿底完整剝落，但操作程序復雜、需特殊材料，且該材料可能會對細胞的增殖分化產生一定影響；而且該技術所獲得的膜片只有單層，很難滿足實驗以及臨床需求。磁性分離技術是將細胞與磁性納米脂質體混合培養后，接種到低黏附的培養皿中，再將培養皿放在釹磁鐵上，通過磁力將細胞吸附到皿底，從而形成細胞膜片。雖然該方法能形成 10～15 層的細胞膜片，但操作過程仍較復雜，實際研究應用較少。本實驗采用細胞刮治技術獲取細胞膜片，并利用高溫高壓滅菌的蓋玻片作為皿間轉移細胞膜片載體，構建三明治樣結構，進一步折疊后形成 12 層類真皮樣組織。該方法不用其他特殊材料，操作步驟簡單、方便。
本實驗中我們將 HUVECS 接種在 rBMSCs 膜片上，培養后可見內皮細胞在膜片上遷移、重排，形成血管網絡結構，提示體外可以構建預血管化膜片，與課題組前期研究結果一致[11]。進一步將預血管化膜片夾在 2 層 HDFs 膜片中形成三明治樣結構，培養 24 h 后 CD31 免疫熒光染色可觀察到內皮細胞分布在整個結構中，形成血管網絡結構，細胞呈有序排列，表明細胞之間相互連接，細胞基質相互融合。免疫組織化學染色發現因內皮細胞的加入，所構建的三維真皮樣組織呈現規律的互相連接的“蜂巢狀”結構，統計結果顯示實驗組與對照組Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原表達量差異無統計學意義，分析可能是體外培養時間過短，內皮細胞短期內不會影響膠原生成。
綜上述，采用 HDFs 膜片與 rBMSCs 預血管化膜片可以復合構建三維結構預血管化真皮樣組織，而且其超微結構與天然真皮類似，可形成互相交織的網狀結構；其內富含基質及纖維，可表達主要存在于皮膚真皮層的Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原。預血管化結構為移植體內后構建功能化血管提供了可能，也為工程化組織在體內的存活制造了營養通路，具有形成組織工程真皮的潛力，為組織工程真皮構建提供了新的思路。
作者貢獻：項樺、任利玲、范增杰負責實驗設計；項樺、陳銳、武姍、席大力負責實驗實施及論文寫作；項樺、陳銳、龍思琪、沈圓負責資料收集及數據整理分析。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。課題經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經蘭州大學口腔醫學院動物實驗倫理委員會批準（201710），實驗動物使用許可證號：SYXK（甘）2015-0001。
