引用本文： 邢飛, 段鑫, 劉明, 陳家磊, 龍成, 陳然, 孫嘉辰, 吳雙, 陳力, 項舟. 外周血來源間充質干細胞/內皮祖細胞復合細胞膜片的構建及其生物學特性初步研究. 中國修復重建外科雜志, 2020, 34(1): 109-115. doi: 10.7507/1002-1892.201901087 復制
臨床工作中，對于由遺傳、腫瘤、創傷、感染、退變等多種原因導致的組織缺損的治療，一直是臨床醫生需要面對的一個挑戰[1-2]。而在組織修復過程中，細胞與細胞之間、細胞與細胞外基質之間的相關信號傳導通路，對組織修復起著十分重要的作用[3]。與傳統的胰蛋白酶消化細胞間連接獲取細胞的方式不同，細胞膜片技術因其可以良好地保護細胞間連接以及細胞外基質，在組織缺損修復領域展現出了巨大發展潛力[4-5]。研究者還可以通過疊加、折疊細胞膜片，采用包裹、注射、填塞的方式植入不同組織缺損部位進行修復[6]。許多研究通過構建細胞膜片并開始逐步應用于皮膚、角膜、心臟、膀胱、牙周等組織修復中，但目前大多數研究主要利用單一種子細胞來源構建細胞膜片[7-10]。
研究者發現外周血中也存在少量 MSCs，經過體外成骨、成脂、成軟骨誘導后，同樣展現出了良好的三向分化能力[11]。與傳統骨髓、脂肪等組織來源的 MSCs 相比，外周血來源間充質干細胞（peripheral blood mesenchymal stem cells，PBMSC）因其取材微創，具有良好的發展應用前景。有研究利用內皮細胞以共培養方式促進了 MSCs 的成骨能力[12-13]。因此，本研究嘗試利用 PBMSC 與外周血內皮祖細胞（peripheral blood endothelial progenitor cells，PBEPC）通過共培養、成膜誘導等手段構建復合細胞膜片，旨在為組織工程骨缺損修復提供一種新的思路與探索。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
健康雄性成年新西蘭大白兔 5 只，體質量約 3 kg，由四川大學華西醫院轉化醫學中心動物實驗室提供。
集落刺激因子、抗壞血酸（華北制藥集團有限責任公司）；CXC 趨化因子受體 4 拮抗劑 AMD3100（Selleck 公司，美國）；淋巴細胞分離液（Ficoll 液；天津灝洋生物制品科技有限責任公司）；肝素（山東辰中生物制藥有限公司）；DMEM 培養基（Sigma 公司，美國）；Matrigel 膠（BD 公司，美國）；成骨培養基（Cyagen 公司，美國）；內皮細胞生長培養基 2（endothelial cell growth medium，EGM-2；Lonza 公司，美國）；Hank 液（GIBCO 公司，美國）；PBS（武漢博士德生物工程有限公司）。細胞培養超凈臺、CO2 細胞培養箱（SANYO 公司，日本）；倒置相差顯微鏡（Leica 公司，德國）；流式細胞分析儀（BD 公司，美國）；離心機（Eppendorf 公司，德國）。
1.2 PBMSC 分離、培養與鑒定
按照本課題組前期研究中介紹的方法獲取 PBMSC 并進行相關鑒定[11, 14]。取新西蘭大白兔 1 只，連續 5 d 皮下注射集落刺激因子（100 μg/kg），第 6 天皮下注射 AMD3100（5 mg/kg）后，經頸動脈抽取 50 mL 血液；用含肝素（25 U/mL）的 DMEM 培養基等體積稀釋后，緩慢加入到相同體積的淋巴細胞分離液（Ficoll 液），室溫下以 500×g 離心 30 min 后，收集中間白膜層，再次室溫下以 200×g 離心 10 min 后，去上清液，培養基重懸，獲取 PBMSC。見圖 1。倒置相差顯微鏡下觀察細胞特性，取第 3 代細胞用于后續實驗。
圖1
獲取 PBMSC 過程中的密度梯度離心
a. 外周血加入淋巴細胞分離液（密度梯度離心前）；b. 外周血密度梯度離心后的單核細胞層（白膜層，黑框區域）
Figure1. Density gradient centrifugation in the process of obtaining PBMSCa. Peripheral blood added with lymphocyte separation solution (before density gradient centrifugation); b. Mononuclear cell layer after peripheral blood density gradient centrifugation (white membrane layer, black box region)
將第 3 代 PBMSC 按 3×104個/孔密度分別接種于 6 孔板內，成骨誘導 21 d 后行茜素紅染色，觀察有無鈣結節生成。將第 3 代 PBMSC 按細胞密度 1×105個/孔分別接種于 6 孔板內，成脂誘導 14 d 后行油紅 O 染色，觀察有無脂滴生成。
1.3 PBEPC 分離、培養與鑒定
按照本課題組前期研究中介紹的方法獲取 PBEPC 并進行相關鑒定[11]。取新西蘭大白兔 1 只，以 3% 戊巴比妥耳緣靜脈注射麻醉（1 mg/kg）后，經頸動脈抽取約 50 mL 血液。用含肝素（25 U/mL）的 PBS 等體積稀釋后，緩慢加入到相同體積的淋巴細胞分離液（Ficoll 液），室溫下以 500×g 離心 30 min 后收集中間白膜層，再次以 200×g 離心 10 min 后，洗滌、重懸獲取 PBEPC。倒置相差顯微鏡下觀察細胞特性，取第 3 代細胞用于后續實驗。
取 Matrigel 基質膠經等體積無血清 EGM-2 培養基稀釋后，均勻加入 24 孔板底部；調整細胞密度為 2×105 個/mL 后吸取細胞懸液 500 μL，加入 Matrigel 基質膠表面 8 h 后，倒置相差顯微鏡下觀察 PBEPC 的成管情況。
1.4 細胞膜片相關觀測
1.4.1 細胞膜片的構建
將 PBMSC 和 PBEPC 分別按細胞密度 1.5×105 個/孔均勻混合接種于 6 孔板內底部，待細胞完全貼壁后，加入培養液（含 10%FBS 的 DMEM 培養基和 EGM-2 培養基按 1∶1 混合）培養 2 d 后，更換為成膜誘導液（含 10%FBS、50 mg/L 抗壞血酸、10 mmol/L β 甘油磷酸鈉、10 nmol/L 地塞米松的 DMEM 培養基）誘導 2 周后，可見孔板底部有白色半透明膜狀物形成。使用眼科鑷小心沿著孔板邊緣將形成的白色膜狀物分離，獲得復合細胞膜片進行后續研究。采用倒置相差顯微鏡觀察細胞膜片內細胞形態。另取 PBMSC 按 3×105 個/孔密度均勻接種于 6 孔板底部，待細胞完全貼壁后，加入含 10%FBS 的 DMEM 培養基，2 d 后更換為成膜誘導液進行培養，2 周后可獲得單一 PBMSC 細胞膜片，用于后續研究。
1.4.2 組織學觀察
將獲得的復合細胞膜片與單一細胞膜片行多聚甲醛固定，乙醇梯度脫水，石蠟包埋，切片，常規 HE 染色觀察兩種細胞膜片組織學情況。
1.4.3 ELISA 法檢測成骨、成血管相關蛋白表達
取復合細胞膜片和單一細胞膜片，行成骨誘導培養，分別于成骨誘導 1、5、10 d 收集上清液，利用 ELISA 法檢測兩組細胞膜片上清液內 ALP、骨鈣素（osteocalcin，OCN）和 VEGF 的表達情況。
1.5 統計學方法
采用 SPSS19.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 PBMSC 和 PBEPC 形態學觀察與鑒定
倒置相差顯微鏡觀察示，第 3 代 PBMSC 展現出良好的貼壁性，細胞形態較為單一，呈紡錘形或多角形，漩渦狀生長。PBMSC 經成骨誘導 21 d 后茜素紅染色可見形態大小不一的深紅色鈣結節出現；經成脂誘導 14 d 后油紅 O 染色可見細胞質內出現大量紅色脂滴。見圖 2。
圖2
PBMSC 形態學觀察及鑒定
a. 第 3 代 PBMSC 形態學觀察（倒置相差顯微鏡×100）；b. 成骨分化鑒定（茜素紅染色×400）；c. 成脂分化鑒定（油紅 O 染色×400）
Figure2. Morphological observation and identification of PBMSCa. Morphological observation of the 3rd generation PBMSC (Inverted phase contrast microscope×100); b. Osteogenic differentiation identification (Alizarin red staining×400); c. Adipogenic differentiation identification (Oil red O staining×400)
倒置相差顯微鏡觀察示，第 3 代 PBEPC 具備良好的貼壁性，細胞形態呈典型鋪路石外觀，細胞呈團簇樣快速生長。PBEPC 貼附于 Matrigel 基質膠表面 8 h 后，細胞逐漸伸出偽足，與周圍細胞相互接觸，形成類似血管的管腔狀結構。見圖 3。
圖3
PBEPC 形態學觀察及鑒定
a. 第 3 代 PBEPC 形態學觀察（倒置相差顯微鏡×100）；b. 成管實驗（倒置相差顯微鏡×200）
Figure3. Morphological observation and identification of PBEPCa. Morphological observation of the 3rd generation PBEPC (Inverted phase contrast microscope×100); b. Tube experiment (Inverted phase contrast microscope×200)2.2 細胞膜片相關觀測
2.2.1 形態學觀察
倒置相差顯微鏡觀察示，復合細胞膜片組隨成膜誘導時間延長，PBMSC 和 PBEPC 均生長迅速，細胞形態逐漸變長，呈漩渦狀，兩種細胞的界限逐漸消失。見圖 4。2 周后復合細胞膜片組和單一細胞膜片組均可見孔板底部有白色半透明膜狀物形成，二者無明顯差異。見圖 5。
圖4
復合細胞膜片成膜誘導各時間點觀察（倒置相差顯微鏡×100）
a. 2 d；b. 5 d；c. 8 d；d. 14 d
Figure4. Observation of composite cell sheet at different time points (Inverted phase contrast microscope×100)a. At 2 days;b. At 5 days; c. At 8 days; d. At 14 days
圖5
細胞膜片大體觀察
a. 復合細胞膜片；b. 單一細胞膜片
Figure5. General observation of cell sheetsa. Composite cell sheet; b. Single cell sheet
2.2.2 組織學觀察
HE 染色示，兩組細胞膜片均由多層細胞堆疊而成，膜片內細胞分布均勻，富含細胞外基質；與單一細胞膜片組相比，復合細胞膜片組膜片更厚，具備更多細胞層數及更高的細胞密度。見圖 6。
圖6
細胞膜片 HE 染色觀察（×400）
a. 復合細胞膜片；b. 單一細胞膜片
Figure6. HE staining of cell sheets (×400)a. Composite cell sheet;b. Single cell sheet
2.2.3 ELISA 法檢測
隨誘導時間延長，兩組細胞膜片上清液中 ALP、OCN 和 VEGF 表達量均有所增加。復合細胞膜片組誘導培養 5、10 d OCN 表達量顯著高于單一細胞膜片組，10 d ALP 表達量顯著高于單一細胞膜片組，1、5、10 d VEGF 表達量均顯著高于單一細胞膜片組，差異均有統計學意義（P<0.05）；其余各時間點兩組間各蛋白表達量比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 7。
圖7
ELISA 法檢測成骨誘導各時間點兩種細胞膜片上清液中成骨、成血管相關蛋白表達
a. OCN；b. ALP；c. VEGF
Figure7. The expressions of osteogenic and angiogenic proteins in the supernatant of cell sheets at different time points detected by ELISAa. OCN; b. ALP; c. VEGF
3 討論
MSCs 廣泛存在于骨髓、脂肪、胎盤、滑膜等多種組織，因其具備良好的多向分化能力，被廣泛應用于多種組織修復[15-17]。但這些骨髓、脂肪等來源的 MSCs 獲取，需要采用骨髓穿刺、抽脂術等侵入性操作。Zvaifler 等[18]最早從人的外周血液中分離得到了具備多向分化能力的 MSCs。本課題組前期嘗試從外周血中分離獲取 MSCs，應用于構建組織工程骨進行骨缺損修復[11]。本實驗通過外周血動員結合密度梯度離心等方法，成功從兔外周血中分離獲取了 MSCs，體外實驗結果表明 PBMSC 具備良好的成骨、成脂分化能力。與傳統來源 MSCs 相比，PBMSC 取材更加微創，對供體創傷更小，為組織修復提供了一種新的種子細胞來源，在組織工程領域具備良好的應用前景。本實驗中的內皮細胞通過外周血采血，結合密度梯度離心法獲得。該 PBEPC 具備良好的貼壁性，細胞形態呈現典型的鋪路石外觀，細胞呈團簇樣快速生長，具備良好的內皮細胞成管特性。自 Asahara 等[19]最早從外周血分離出內皮祖細胞以來，許多研究者從外周血中分離獲取內皮祖細胞并應用于組織工程研究中[20-22]。相比于傳統骨髓穿刺獲取內皮祖細胞，外周血中分離內皮祖細胞更加微創，具備一定的應用前景。
細胞外基質以及細胞間連接對細胞的增殖分化起著十分重要的作用[23]。而傳統的胰蛋白酶消化獲取種子細胞的方式大大破壞了細胞表面相關受體蛋白以及細胞間連接，降低了細胞間以及細胞與細胞外基質的相互作用，一定程度上影響了種子細胞的活性。細胞膜片最早自 Okano 等[24]發現以來，因其可以盡可能保護細胞膜表面相關蛋白、細胞間連接、細胞-細胞外基質連接等結構，受到越來越多學者關注。細胞膜片是利用高密度接種細胞、成膜誘導以及相關物理化學手段構建的富含細胞外基質的、具備一定機械強度和可操作性的細胞膜片結構[25-26]。目前構建細胞膜片的方法多種多樣，主要包括溫敏材料法[24]、聚合電解質材料法[27]、磁性脂質體法[15]、抗壞血酸法[28]等。研究發現抗壞血酸作為細胞分泌膠原類物質的重要因子，可以快速促進細胞外基質合成與分泌，并能抑制細胞分化[29]。抗壞血酸法是利用抗壞血酸可以促進細胞分泌細胞外基質的特點，再利用細胞刮刀將細胞膜片從培養皿中刮取獲得。因抗壞血酸法簡便易行、可重復性高，近年來被廣泛應用于細胞膜片的構建[30]。本實驗利用抗壞血酸法成功構建出了具備一定物理特性的細胞膜片。
組織缺損的修復往往依靠多種不同細胞的參與[31-32]。許多研究通過將內皮細胞與 MSCs 共培養來加強 MSCs 成骨分化能力[33-35]。Zigdon-Giladi 等[36]將大鼠 BMSCs 與骨髓來源內皮祖細胞按照 1∶1 細胞比例進行共培養后，接種于生物支架材料上，植入小鼠體內進行骨缺損修復，3 個月后發現共培養體系組的體內成骨能力遠遠高于單一 MSCs 組。此外，Liang 等[37]通過分離大鼠 BMSCs 與骨髓來源內皮祖細胞，按照 1∶1 細胞比例進行共培養以及成膜誘導，發現復合細胞膜片的成骨能力遠遠高于單一 MSCs 細胞膜片。本實驗利用兔來源的 PBMSC 與 PBEPC 構建復合細胞膜片，結果發現與單一 PBMSC 細胞膜片相比，復合細胞膜片具備更多的細胞層數以及細胞外基質，且具備更好的成骨分化能力。
綜上述，本研究結果顯示，利用 PBMSC 與 PBEPC 經共培養、成膜誘導等操作構建的復合細胞膜片，比傳統的單一 PBMSC 細胞膜片具備更多的細胞層數和細胞外基質，具有更好的成骨分化能力，為骨缺損修復提供了一種新方法。此外，本課題組將就復合細胞膜片促進組織修復的分子機制以及體內實驗作進一步研究探索。
作者貢獻：邢飛、段鑫、劉明負責實驗設計、實施及文章撰寫；陳家磊、龍成、陳然、孫嘉辰負責數據收集整理；孫嘉辰、吳雙、陳力負責統計分析；項舟負責對文章的知識性內容作批評性審閱。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。課題經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經四川大學華西醫院醫學/動物實驗倫理委員會批準。實驗動物生產許可證號：SCXK（川）2013-026，實驗動物使用許可證號：SYXK（川）2013-119。
臨床工作中，對于由遺傳、腫瘤、創傷、感染、退變等多種原因導致的組織缺損的治療，一直是臨床醫生需要面對的一個挑戰[1-2]。而在組織修復過程中，細胞與細胞之間、細胞與細胞外基質之間的相關信號傳導通路，對組織修復起著十分重要的作用[3]。與傳統的胰蛋白酶消化細胞間連接獲取細胞的方式不同，細胞膜片技術因其可以良好地保護細胞間連接以及細胞外基質，在組織缺損修復領域展現出了巨大發展潛力[4-5]。研究者還可以通過疊加、折疊細胞膜片，采用包裹、注射、填塞的方式植入不同組織缺損部位進行修復[6]。許多研究通過構建細胞膜片并開始逐步應用于皮膚、角膜、心臟、膀胱、牙周等組織修復中，但目前大多數研究主要利用單一種子細胞來源構建細胞膜片[7-10]。
研究者發現外周血中也存在少量 MSCs，經過體外成骨、成脂、成軟骨誘導后，同樣展現出了良好的三向分化能力[11]。與傳統骨髓、脂肪等組織來源的 MSCs 相比，外周血來源間充質干細胞（peripheral blood mesenchymal stem cells，PBMSC）因其取材微創，具有良好的發展應用前景。有研究利用內皮細胞以共培養方式促進了 MSCs 的成骨能力[12-13]。因此，本研究嘗試利用 PBMSC 與外周血內皮祖細胞（peripheral blood endothelial progenitor cells，PBEPC）通過共培養、成膜誘導等手段構建復合細胞膜片，旨在為組織工程骨缺損修復提供一種新的思路與探索。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
健康雄性成年新西蘭大白兔 5 只，體質量約 3 kg，由四川大學華西醫院轉化醫學中心動物實驗室提供。
集落刺激因子、抗壞血酸（華北制藥集團有限責任公司）；CXC 趨化因子受體 4 拮抗劑 AMD3100（Selleck 公司，美國）；淋巴細胞分離液（Ficoll 液；天津灝洋生物制品科技有限責任公司）；肝素（山東辰中生物制藥有限公司）；DMEM 培養基（Sigma 公司，美國）；Matrigel 膠（BD 公司，美國）；成骨培養基（Cyagen 公司，美國）；內皮細胞生長培養基 2（endothelial cell growth medium，EGM-2；Lonza 公司，美國）；Hank 液（GIBCO 公司，美國）；PBS（武漢博士德生物工程有限公司）。細胞培養超凈臺、CO2 細胞培養箱（SANYO 公司，日本）；倒置相差顯微鏡（Leica 公司，德國）；流式細胞分析儀（BD 公司，美國）；離心機（Eppendorf 公司，德國）。
1.2 PBMSC 分離、培養與鑒定
按照本課題組前期研究中介紹的方法獲取 PBMSC 并進行相關鑒定[11, 14]。取新西蘭大白兔 1 只，連續 5 d 皮下注射集落刺激因子（100 μg/kg），第 6 天皮下注射 AMD3100（5 mg/kg）后，經頸動脈抽取 50 mL 血液；用含肝素（25 U/mL）的 DMEM 培養基等體積稀釋后，緩慢加入到相同體積的淋巴細胞分離液（Ficoll 液），室溫下以 500×g 離心 30 min 后，收集中間白膜層，再次室溫下以 200×g 離心 10 min 后，去上清液，培養基重懸，獲取 PBMSC。見圖 1。倒置相差顯微鏡下觀察細胞特性，取第 3 代細胞用于后續實驗。
圖1
獲取 PBMSC 過程中的密度梯度離心
a. 外周血加入淋巴細胞分離液（密度梯度離心前）；b. 外周血密度梯度離心后的單核細胞層（白膜層，黑框區域）
Figure1. Density gradient centrifugation in the process of obtaining PBMSCa. Peripheral blood added with lymphocyte separation solution (before density gradient centrifugation); b. Mononuclear cell layer after peripheral blood density gradient centrifugation (white membrane layer, black box region)
將第 3 代 PBMSC 按 3×104個/孔密度分別接種于 6 孔板內，成骨誘導 21 d 后行茜素紅染色，觀察有無鈣結節生成。將第 3 代 PBMSC 按細胞密度 1×105個/孔分別接種于 6 孔板內，成脂誘導 14 d 后行油紅 O 染色，觀察有無脂滴生成。
1.3 PBEPC 分離、培養與鑒定
按照本課題組前期研究中介紹的方法獲取 PBEPC 并進行相關鑒定[11]。取新西蘭大白兔 1 只，以 3% 戊巴比妥耳緣靜脈注射麻醉（1 mg/kg）后，經頸動脈抽取約 50 mL 血液。用含肝素（25 U/mL）的 PBS 等體積稀釋后，緩慢加入到相同體積的淋巴細胞分離液（Ficoll 液），室溫下以 500×g 離心 30 min 后收集中間白膜層，再次以 200×g 離心 10 min 后，洗滌、重懸獲取 PBEPC。倒置相差顯微鏡下觀察細胞特性，取第 3 代細胞用于后續實驗。
取 Matrigel 基質膠經等體積無血清 EGM-2 培養基稀釋后，均勻加入 24 孔板底部；調整細胞密度為 2×105 個/mL 后吸取細胞懸液 500 μL，加入 Matrigel 基質膠表面 8 h 后，倒置相差顯微鏡下觀察 PBEPC 的成管情況。
1.4 細胞膜片相關觀測
1.4.1 細胞膜片的構建
將 PBMSC 和 PBEPC 分別按細胞密度 1.5×105 個/孔均勻混合接種于 6 孔板內底部，待細胞完全貼壁后，加入培養液（含 10%FBS 的 DMEM 培養基和 EGM-2 培養基按 1∶1 混合）培養 2 d 后，更換為成膜誘導液（含 10%FBS、50 mg/L 抗壞血酸、10 mmol/L β 甘油磷酸鈉、10 nmol/L 地塞米松的 DMEM 培養基）誘導 2 周后，可見孔板底部有白色半透明膜狀物形成。使用眼科鑷小心沿著孔板邊緣將形成的白色膜狀物分離，獲得復合細胞膜片進行后續研究。采用倒置相差顯微鏡觀察細胞膜片內細胞形態。另取 PBMSC 按 3×105 個/孔密度均勻接種于 6 孔板底部，待細胞完全貼壁后，加入含 10%FBS 的 DMEM 培養基，2 d 后更換為成膜誘導液進行培養，2 周后可獲得單一 PBMSC 細胞膜片，用于后續研究。
1.4.2 組織學觀察
將獲得的復合細胞膜片與單一細胞膜片行多聚甲醛固定，乙醇梯度脫水，石蠟包埋，切片，常規 HE 染色觀察兩種細胞膜片組織學情況。
1.4.3 ELISA 法檢測成骨、成血管相關蛋白表達
取復合細胞膜片和單一細胞膜片，行成骨誘導培養，分別于成骨誘導 1、5、10 d 收集上清液，利用 ELISA 法檢測兩組細胞膜片上清液內 ALP、骨鈣素（osteocalcin，OCN）和 VEGF 的表達情況。
1.5 統計學方法
采用 SPSS19.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 PBMSC 和 PBEPC 形態學觀察與鑒定
倒置相差顯微鏡觀察示，第 3 代 PBMSC 展現出良好的貼壁性，細胞形態較為單一，呈紡錘形或多角形，漩渦狀生長。PBMSC 經成骨誘導 21 d 后茜素紅染色可見形態大小不一的深紅色鈣結節出現；經成脂誘導 14 d 后油紅 O 染色可見細胞質內出現大量紅色脂滴。見圖 2。
圖2
PBMSC 形態學觀察及鑒定
a. 第 3 代 PBMSC 形態學觀察（倒置相差顯微鏡×100）；b. 成骨分化鑒定（茜素紅染色×400）；c. 成脂分化鑒定（油紅 O 染色×400）
Figure2. Morphological observation and identification of PBMSCa. Morphological observation of the 3rd generation PBMSC (Inverted phase contrast microscope×100); b. Osteogenic differentiation identification (Alizarin red staining×400); c. Adipogenic differentiation identification (Oil red O staining×400)
倒置相差顯微鏡觀察示，第 3 代 PBEPC 具備良好的貼壁性，細胞形態呈典型鋪路石外觀，細胞呈團簇樣快速生長。PBEPC 貼附于 Matrigel 基質膠表面 8 h 后，細胞逐漸伸出偽足，與周圍細胞相互接觸，形成類似血管的管腔狀結構。見圖 3。
圖3
PBEPC 形態學觀察及鑒定
a. 第 3 代 PBEPC 形態學觀察（倒置相差顯微鏡×100）；b. 成管實驗（倒置相差顯微鏡×200）
Figure3. Morphological observation and identification of PBEPCa. Morphological observation of the 3rd generation PBEPC (Inverted phase contrast microscope×100); b. Tube experiment (Inverted phase contrast microscope×200)2.2 細胞膜片相關觀測
2.2.1 形態學觀察
倒置相差顯微鏡觀察示，復合細胞膜片組隨成膜誘導時間延長，PBMSC 和 PBEPC 均生長迅速，細胞形態逐漸變長，呈漩渦狀，兩種細胞的界限逐漸消失。見圖 4。2 周后復合細胞膜片組和單一細胞膜片組均可見孔板底部有白色半透明膜狀物形成，二者無明顯差異。見圖 5。
圖4
復合細胞膜片成膜誘導各時間點觀察（倒置相差顯微鏡×100）
a. 2 d；b. 5 d；c. 8 d；d. 14 d
Figure4. Observation of composite cell sheet at different time points (Inverted phase contrast microscope×100)a. At 2 days;b. At 5 days; c. At 8 days; d. At 14 days
圖5
細胞膜片大體觀察
a. 復合細胞膜片；b. 單一細胞膜片
Figure5. General observation of cell sheetsa. Composite cell sheet; b. Single cell sheet
2.2.2 組織學觀察
HE 染色示，兩組細胞膜片均由多層細胞堆疊而成，膜片內細胞分布均勻，富含細胞外基質；與單一細胞膜片組相比，復合細胞膜片組膜片更厚，具備更多細胞層數及更高的細胞密度。見圖 6。
圖6
細胞膜片 HE 染色觀察（×400）
a. 復合細胞膜片；b. 單一細胞膜片
Figure6. HE staining of cell sheets (×400)a. Composite cell sheet;b. Single cell sheet
2.2.3 ELISA 法檢測
隨誘導時間延長，兩組細胞膜片上清液中 ALP、OCN 和 VEGF 表達量均有所增加。復合細胞膜片組誘導培養 5、10 d OCN 表達量顯著高于單一細胞膜片組，10 d ALP 表達量顯著高于單一細胞膜片組，1、5、10 d VEGF 表達量均顯著高于單一細胞膜片組，差異均有統計學意義（P<0.05）；其余各時間點兩組間各蛋白表達量比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 7。
圖7
ELISA 法檢測成骨誘導各時間點兩種細胞膜片上清液中成骨、成血管相關蛋白表達
a. OCN；b. ALP；c. VEGF
Figure7. The expressions of osteogenic and angiogenic proteins in the supernatant of cell sheets at different time points detected by ELISAa. OCN; b. ALP; c. VEGF
3 討論
MSCs 廣泛存在于骨髓、脂肪、胎盤、滑膜等多種組織，因其具備良好的多向分化能力，被廣泛應用于多種組織修復[15-17]。但這些骨髓、脂肪等來源的 MSCs 獲取，需要采用骨髓穿刺、抽脂術等侵入性操作。Zvaifler 等[18]最早從人的外周血液中分離得到了具備多向分化能力的 MSCs。本課題組前期嘗試從外周血中分離獲取 MSCs，應用于構建組織工程骨進行骨缺損修復[11]。本實驗通過外周血動員結合密度梯度離心等方法，成功從兔外周血中分離獲取了 MSCs，體外實驗結果表明 PBMSC 具備良好的成骨、成脂分化能力。與傳統來源 MSCs 相比，PBMSC 取材更加微創，對供體創傷更小，為組織修復提供了一種新的種子細胞來源，在組織工程領域具備良好的應用前景。本實驗中的內皮細胞通過外周血采血，結合密度梯度離心法獲得。該 PBEPC 具備良好的貼壁性，細胞形態呈現典型的鋪路石外觀，細胞呈團簇樣快速生長，具備良好的內皮細胞成管特性。自 Asahara 等[19]最早從外周血分離出內皮祖細胞以來，許多研究者從外周血中分離獲取內皮祖細胞并應用于組織工程研究中[20-22]。相比于傳統骨髓穿刺獲取內皮祖細胞，外周血中分離內皮祖細胞更加微創，具備一定的應用前景。
細胞外基質以及細胞間連接對細胞的增殖分化起著十分重要的作用[23]。而傳統的胰蛋白酶消化獲取種子細胞的方式大大破壞了細胞表面相關受體蛋白以及細胞間連接，降低了細胞間以及細胞與細胞外基質的相互作用，一定程度上影響了種子細胞的活性。細胞膜片最早自 Okano 等[24]發現以來，因其可以盡可能保護細胞膜表面相關蛋白、細胞間連接、細胞-細胞外基質連接等結構，受到越來越多學者關注。細胞膜片是利用高密度接種細胞、成膜誘導以及相關物理化學手段構建的富含細胞外基質的、具備一定機械強度和可操作性的細胞膜片結構[25-26]。目前構建細胞膜片的方法多種多樣，主要包括溫敏材料法[24]、聚合電解質材料法[27]、磁性脂質體法[15]、抗壞血酸法[28]等。研究發現抗壞血酸作為細胞分泌膠原類物質的重要因子，可以快速促進細胞外基質合成與分泌，并能抑制細胞分化[29]。抗壞血酸法是利用抗壞血酸可以促進細胞分泌細胞外基質的特點，再利用細胞刮刀將細胞膜片從培養皿中刮取獲得。因抗壞血酸法簡便易行、可重復性高，近年來被廣泛應用于細胞膜片的構建[30]。本實驗利用抗壞血酸法成功構建出了具備一定物理特性的細胞膜片。
組織缺損的修復往往依靠多種不同細胞的參與[31-32]。許多研究通過將內皮細胞與 MSCs 共培養來加強 MSCs 成骨分化能力[33-35]。Zigdon-Giladi 等[36]將大鼠 BMSCs 與骨髓來源內皮祖細胞按照 1∶1 細胞比例進行共培養后，接種于生物支架材料上，植入小鼠體內進行骨缺損修復，3 個月后發現共培養體系組的體內成骨能力遠遠高于單一 MSCs 組。此外，Liang 等[37]通過分離大鼠 BMSCs 與骨髓來源內皮祖細胞，按照 1∶1 細胞比例進行共培養以及成膜誘導，發現復合細胞膜片的成骨能力遠遠高于單一 MSCs 細胞膜片。本實驗利用兔來源的 PBMSC 與 PBEPC 構建復合細胞膜片，結果發現與單一 PBMSC 細胞膜片相比，復合細胞膜片具備更多的細胞層數以及細胞外基質，且具備更好的成骨分化能力。
綜上述，本研究結果顯示，利用 PBMSC 與 PBEPC 經共培養、成膜誘導等操作構建的復合細胞膜片，比傳統的單一 PBMSC 細胞膜片具備更多的細胞層數和細胞外基質，具有更好的成骨分化能力，為骨缺損修復提供了一種新方法。此外，本課題組將就復合細胞膜片促進組織修復的分子機制以及體內實驗作進一步研究探索。
作者貢獻：邢飛、段鑫、劉明負責實驗設計、實施及文章撰寫；陳家磊、龍成、陳然、孫嘉辰負責數據收集整理；孫嘉辰、吳雙、陳力負責統計分析；項舟負責對文章的知識性內容作批評性審閱。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。課題經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經四川大學華西醫院醫學/動物實驗倫理委員會批準。實驗動物生產許可證號：SCXK（川）2013-026，實驗動物使用許可證號：SYXK（川）2013-119。
