引用本文： 馮玉霞, 汪洋, 李琴, 馬東洋, 任利玲. 基于兔BMSCs預血管化細胞膜片的體外構建. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(10): 1278-1283. doi: 10.7507/1002-1892.20140277 復制
隨著組織工程技術的發展，如何使工程化組織獲得充足血供（即血管化）的問題已受到學者們的廣泛關注[1-3]。大量研究通過復合內皮細胞與支架材料或支架材料負載促血管生長因子來構建血管（毛細血管），但由于支架材料潛在的免疫原性、不匹配的降解速率及較低的細胞利用率等缺點[4]，所構建工程化組織仍存在血管化不足的問題。Ohashi等[5]報道的細胞膜片技術較傳統組織工程構建方法保留了細胞分泌的細胞外基質、細胞-細胞連接、細胞-基質連接及一些重要的細胞表面蛋白等結構，對維持細胞表型及功能具有重要意義。近來，Nagamori等[6]將人血管內皮細胞接種于成肌細胞膜片上，發現膜片中間部位有網狀結構形成。此外，細胞膜片技術還被成功應用于構建組織工程軟骨、角膜、心肌、牙周組織、血管等軟組織[7-8]。BMSCs由于取材簡便、來源豐富、具有多向分化潛能，成為組織工程重要種子細胞來源。研究表明BMSCs可作為血管周細胞，按一定比例與內皮細胞混合接種后，有助于工程化骨組織建立成熟的血管系統[9-10]，并可作為周圍細胞支持內皮樣管狀結構的穩定性[11]。近年研究表明[12-14]BMSCs在合適的誘導條件下可向內皮細胞轉化。
基于上述研究，我們設想完全應用源于自體干細胞的種子細胞也能構建預血管化的膜片。因此，本研究中我們首先分離培養兔BMSCs，并誘導其分化為血管內皮樣細胞（endothelial like cells，ECs），將誘導分化后的細胞接種于未分化的BMSCs膜片上，體外構建預血管化的組織工程膜片。本研究旨在考察特定誘導條件下BMSCs向ECs分化的能力及所形成ECs的成血管能力，從而解決組織工程技術中內皮細胞源問題，為構建預血管化組織工程組織提供新的思路和方法。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
3周齡日本大耳白兔5只，雌雄不限，體重1.0～1.5 kg，由中國農業科學院蘭州獸醫研究所提供。
肝素鈉、DMEM培養基（GIBCO公司，美國）；L-谷氨酰胺、地塞米松、β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸、胰蛋白酶（Sigma公司，美國）；FBS（杭州四季青生物材料有限公司）；VEGF、bFGF（Peprotech公司，美國）；兔抗兔血管性假血友病因子（von Willebrand factor，vWF）一抗（北京博奧森生物技術有限公司）；人抗兔CD31一抗（Abcam公司，英國）；FITC標記的山羊抗兔二抗、PE標記的山羊抗人二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司）。
SW-CJ-2G超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；BB15 CO2恒溫培養箱（Heraeus公司，德國）；CKX31倒置顯微鏡、CKX31/41倒置相差熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）；RM2016輪換切片機（Leica公司，德國）。
1.2 兔BMSCs分離、培養及鑒定
取3周齡日本大耳白兔，穿刺抽取股骨骨髓，采用全骨髓培養法分離培養BMSCs并傳代，倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況。對培養細胞行成骨、成軟骨及成脂誘導分化鑒定，證實獲得細胞為可向骨、軟骨及脂肪等方向分化的BMSCs[15]。取第2代細胞用于以下實驗。
1.3 兔BMSCs向ECs誘導分化及免疫熒光染色觀察
將第2代BMSCs以1 × 104個/cm2密度接種至6孔培養板中，L-DMEM培養基繼續培養2 d后，實驗組更換為ECs培養基（含10%FBS、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素、0.29 g/L L-谷氨酰胺、10 μg/L VEGF、10 μg/L bFGF的L-DMEM培養基）；對照組不加誘導劑繼續培養。每2～3天換液1次，倒置顯微鏡下觀察誘導后3、7、14 d實驗組細胞形態變化。
培養7、14 d將兩組細胞以1 × 104個/cm2密度爬片，待細胞生長融合至40%～50%時，PBS洗3次，5 min/次；4%冷多聚甲醛固定20 min，PBS洗3次、5 min/次；山羊血清室溫封閉30 min，PBS洗3次、5 min/次，分別加入一抗（兔抗兔vWF、人抗兔CD31）4℃濕盒內過夜；第2天PBS洗3次、5 min/次，加入相應二抗（FITC標記的山羊抗兔、PE標記的山羊抗人）室溫避光孵育2 h，PBS洗3次、5 min/次；加入0.5 μg/ mL DAPI染色5 min，PBS洗3次，去除多余DAPI，抗熒光淬滅劑封片，倒置相差熒光顯微鏡下觀察。
1.4 預血管化細胞膜片相關檢測
1.4.1 預血管化細胞膜片構建及接種ECs后形態學觀察
將第2代BMSCs以9 × 104個/cm2密度接種至直徑10 cm培養皿，加入未分化細胞膜片培養基（含50 mg/L抗壞血酸、10%FBS、100 U/mL青霉素、100 U/ mL鏈霉素、0.29 g/L L-谷氨酰胺的GG-DMEM培養基）培養，每隔2 d換液1次。經14 d連續培養，在培養皿底壁形成一層透明狀未分化的BMSCs膜片。實驗分為3組：A組將BMSCs誘導14 d后獲得的ECs用0.25%胰蛋白酶消化，以5 × 104個/cm2密度均勻接種至未分化的BMSCs膜片上，更換為條件培養基（未分化細胞膜片培養基與ECs培養基按1∶1比例混合）繼續培養；B組為單純未分化的BMSCs膜片；C組為BMSCs誘導14 d后獲得的ECs在ECs培養基中單獨培養。倒置顯微鏡觀察各組細胞及膜片形態。
1.4.2 免疫熒光染色檢測
取培養3、7、14 d A、B組細胞膜片及C組誘導分化的ECs，用4%冷多聚甲醛固定15 min，PBS洗3次、5 min/次。同1.3方法行CD31免疫熒光染色檢測。
1.4.3 組織學觀察
取培養3、7、14 d A、B組細胞膜片制作冰凍切片，片厚5 μm，常規行HE染色觀察。
2 結果
2.1 BMSCs向ECs誘導分化及免疫熒光染色鑒定
倒置顯微鏡觀察可見原代分離培養的BMSCs呈長梭形（圖 1a）。實驗組誘導3 d，細胞質收縮、細胞核變大（圖 1b）；7 d，細胞呈卵圓形，形態變化明顯（圖 1c）；14 d，細胞呈“鋪路石”樣結構，漩渦狀生長（圖 1d）。免疫熒光染色示，實驗組vWF、CD31均呈陽性表達，而對照組均呈陰性（圖 2）。
圖1
BMSCs形態學觀察（倒置顯微鏡× 100）???原代BMSCs???向ECs誘導培養3 d???向ECs誘導培養7 d???向ECs誘導培養14 d ?圖 2免疫熒光染色鑒定ECs（倒置相差熒光顯微鏡× 200）???對照組vWF???對照組CD31???實驗組vWF???實驗組CD31 ?圖 3各組各時間點細胞及膜片形態觀察???A組細胞接種3 d（倒置顯微鏡× 400）???A組細胞接種7 d（倒置顯微鏡× 400）???A組細胞接種14 d（倒置顯微鏡× 400）???B組培養14 d的BMSCs膜片???B組培養14 d的BMSCs膜片（倒置顯微鏡× 100）???C組ECs培養14 d（倒置顯微鏡× 100）
Figure1.
Morphology observation of BMSCs (Inverted microscope × 100)???Primary BMSCs???ECs differentiated from BMSCs after 3 days???ECs differentiated from BMSCs after 7 days???ECs differentiated from BMSCs after 14 days ?Fig.2 The immunofluorescent identification of ECs (Inverted contrast fluorescence microscope × 200)???vWF of control group???CD31 of control group???vWF of experimental group???CD31 of experimental group ?Fig.3 Morphology observations of cells and sheet in each group at different time points???Cells inoculated for 3 days in group A (Inverted microscope × 400)???Cells inoculated for 7 days in group A (Inverted microscope × 400)???Cells inoculated for 14 days in group A (Inverted microscope × 400)???BMSCs sheet cultured for 14 days in group B???BMSCs sheet cultured for 14 days in group B (Inverted microscope × 100)???ECs cultured for 14 days in group C (Inverted microscope × 100)
2.2 預血管化細胞膜片相關檢測
2.2.1 ECs接種至BMSCs膜片后形態觀察
A組：細胞接種至BMSCs膜片上3 d后，細胞重排，形成空泡（圖 3a）；7 d，鏡下可見網狀結構（圖 3b）；14 d，網狀結構更加明顯（圖 3c）。B組：BMSCs在培養皿底壁迅速生長融合，連續培養14 d后形成致密的細胞膜片（圖 3d），鏡下可見具有多層細胞的細胞膜片形成，細胞呈長梭形，致密排列（圖 3e）。C組：BMSCs誘導分化14 d的ECs單純連續培養14 d，在培養皿底未見明顯透明膜狀物形成，細胞緊密連接，呈“鋪路石”樣結構（圖 3f）。
2.2.2 免疫熒光染色檢測
CD31免疫熒光染色示：A組細胞接種至BMSCs膜片上3 d，細胞發生遷移、融合，形成空泡（圖 4a）；7 d，空泡發生聚集（圖 4b）；14 d，可見微血管管腔形成（圖 4c）。B組BMSCs膜片CD31表達陰性（圖 4d）；而C組ECs培養14 d時CD31表達陽性且呈點狀表達，但無管網狀結構形成（圖 4e）。
圖4
各組免疫熒光染色檢測（倒置相差熒光顯微鏡× 200）???A組細胞接種3 d???A組細胞接種7 d ???A組細胞接種14 d ??B組培養14 d的BMSCs膜片??C組ECs培養14 d ?圖 5 ?各組HE染色觀察??A組細胞接種3 d（× 100）??A組細胞接種7 d（× 200）??A組細胞接種14 d（× 200）??B組培養14 d的BMSCs膜片（× 50）
Figure4.
Immunofluorescence staining observations of BMSCs in each group (Inverted contrast fluorescence microscope × 200) ??Cells inoculated for 3 days in group A ??Cells inoculated for 7 days in group A ??Cells inoculated for 14 days in group A BMSCs sheet cultured for 14 days in group B ??ECs cultured for 14 days in group C ?Fig.5 ?HE staining observation of each group ??Cells inoculated for 3 days in group A (× 100) ??Cells inoculated for 7 days in group A (× 200) ??Cells inoculated for 14 days in group A (× 200) ??BMSCs sheet cultured for 14 days in group B (× 50)
2.2.3 組織學觀察
A組細胞接種至BMSCs膜片上3 d，細胞相互連接（圖 5a）；7、14 d后細胞融合，逐漸形成微血管空腔（圖 5b 、圖 5c）。B組BMSCs膜片無網狀結構形成（圖 5d d）。
3 討論
ECs在構建組織工程血管化組織過程中具有重要作用，但既往通過直接分離法獲取血管或微血管的終末分化細胞方法由于供區來源有限，取材時常會對機體造成新的損傷而限制了其應用；且進一步研究發現，源于血管或微血管的終末分化內皮細胞增殖能力較弱，在體外擴增過程中易老化，存在失去功能及生物活性不強等問題[16]。因此，尋求更好的獲取ECs種子細胞的方法，成為目前血管化研究的熱點。有研究表明[17]，BMSCs可誘導分化形成ECs，且誘導分化的ECs和終末分化的ECs相比，具有更強的分化能力。故本研究采用VEGF和bFGF誘導兔BMSCs分化形成ECs，結果顯示，誘導3 d后細胞形態發生變化，細胞質收縮，細胞核變大；誘導7、14 d后細胞由長梭形變為“鋪路石”樣；免疫熒光染色顯示誘導后細胞vWF、CD31表達均呈陽性；提示誘導所得細胞具有ECs的特征。然后將誘導分化獲得的ECs接種至BMSCs膜片上，嘗試完全應用源于自體BMSCs構建預血管化細胞膜片的可行性。結果顯示，其接種至BMSCs膜片上可形成具有血管網絡結構的細胞膜片，提示通過誘導獲得的ECs在體外能形成毛細血管網，有效解決了作為血管化種子細胞取材相對不便的問題。同時作為多能干細胞的BMSCs可分泌多種生長因子，如VEGF、bFGF等[10]，有利于促進血管形成。
構建組織工程血管化組織過程中除需要血管化種子細胞外，合理的構建策略也至關重要。本研究將兔BMSCs誘導分化獲得的ECs以一定濃度接種至BMSCs膜片上，細胞融合并相互連接，逐漸形成了毛細血管網狀結構和類似微血管管腔樣結構。而單純BMSCs膜片細胞形態無明顯改變、未見管網狀結構形成；單獨培養的ECs CD31表達陽性且呈點狀表達，同樣未見管網狀結構形成。結果表明微血管管腔樣結構的形成可能與細胞間相互作用以及BMSCs膜片分泌的細胞外基質對細胞的作用有關。一方面，當誘導分化的ECs接種至未分化細胞膜片上，ECs發生遷移、聚集，與BMSCs相互作用，促進毛細血管網狀結構形成；另一方面，BMSCs分泌的細胞外基質為ECs的增殖、遷移和聚集提供了一定環境。但本實驗體外獲得的毛細血管網是否能在體內長期穩定存在并形成功能性血管（即血管化），仍需進一步實驗探索。
血管化是組織工程移植物在宿主體內能夠長期存活和維持功能的關鍵。構建血管化（即預血管化）的方法主要有以下幾種[2-4]：①利用生長因子促進新生血管形成；②細胞共培養與支架形成復合物植入體內促進血管形成；③顯微外科技術與組織工程技術結合促進血管形成；④聯合基因工程技術促進血管形成。目前研究者們更多關注的是通過共培養方法獲得預血管化的網絡結構。Tsigkou等[9]將ECs和血管周細胞混合后加入工程化骨組織構建物中，形成穩定持久的微血管，并與宿主血管系統吻合。Staton等[11]在體外將兔ECs與BMSCs或10T1/2胚胎成纖維細胞共培養，與支架材料復合形成了管網狀結構。但是，這些通過細胞共培養構建血管網的方法一般會受到支架材料生物相容性不良、降解速率控制不佳等問題影響。本研究采用原代獲取的BMSCs并將其誘導分化為ECs，然后將誘導形成的ECs與BMSCs膜片共培養獲得預血管化網絡結構，細胞膜片中保留的細胞自分泌的細胞外基質維持了細胞表型及其功能，為ECs的遷移、聚集提供了良好環境，提高了細胞利用率；同時，僅提取BMSCs并由其分化獲得ECs，省去了分離培養ECs的步驟。本研究獲取細胞膜片的方法簡便易行，已在國內外多個實驗室應用，且獲得的細胞膜片具有一定厚度和賦形能力[18-20]，可考慮與其他類型膜片復合構建工程化組織，避免了免疫排斥反應和生物支架材料組織相容性不良等缺點，為構建三維預血管化工程化組織提供了新的思路和方法。
隨著組織工程技術的發展，如何使工程化組織獲得充足血供（即血管化）的問題已受到學者們的廣泛關注[1-3]。大量研究通過復合內皮細胞與支架材料或支架材料負載促血管生長因子來構建血管（毛細血管），但由于支架材料潛在的免疫原性、不匹配的降解速率及較低的細胞利用率等缺點[4]，所構建工程化組織仍存在血管化不足的問題。Ohashi等[5]報道的細胞膜片技術較傳統組織工程構建方法保留了細胞分泌的細胞外基質、細胞-細胞連接、細胞-基質連接及一些重要的細胞表面蛋白等結構，對維持細胞表型及功能具有重要意義。近來，Nagamori等[6]將人血管內皮細胞接種于成肌細胞膜片上，發現膜片中間部位有網狀結構形成。此外，細胞膜片技術還被成功應用于構建組織工程軟骨、角膜、心肌、牙周組織、血管等軟組織[7-8]。BMSCs由于取材簡便、來源豐富、具有多向分化潛能，成為組織工程重要種子細胞來源。研究表明BMSCs可作為血管周細胞，按一定比例與內皮細胞混合接種后，有助于工程化骨組織建立成熟的血管系統[9-10]，并可作為周圍細胞支持內皮樣管狀結構的穩定性[11]。近年研究表明[12-14]BMSCs在合適的誘導條件下可向內皮細胞轉化。
基于上述研究，我們設想完全應用源于自體干細胞的種子細胞也能構建預血管化的膜片。因此，本研究中我們首先分離培養兔BMSCs，并誘導其分化為血管內皮樣細胞（endothelial like cells，ECs），將誘導分化后的細胞接種于未分化的BMSCs膜片上，體外構建預血管化的組織工程膜片。本研究旨在考察特定誘導條件下BMSCs向ECs分化的能力及所形成ECs的成血管能力，從而解決組織工程技術中內皮細胞源問題，為構建預血管化組織工程組織提供新的思路和方法。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
3周齡日本大耳白兔5只，雌雄不限，體重1.0～1.5 kg，由中國農業科學院蘭州獸醫研究所提供。
肝素鈉、DMEM培養基（GIBCO公司，美國）；L-谷氨酰胺、地塞米松、β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸、胰蛋白酶（Sigma公司，美國）；FBS（杭州四季青生物材料有限公司）；VEGF、bFGF（Peprotech公司，美國）；兔抗兔血管性假血友病因子（von Willebrand factor，vWF）一抗（北京博奧森生物技術有限公司）；人抗兔CD31一抗（Abcam公司，英國）；FITC標記的山羊抗兔二抗、PE標記的山羊抗人二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司）。
SW-CJ-2G超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；BB15 CO2恒溫培養箱（Heraeus公司，德國）；CKX31倒置顯微鏡、CKX31/41倒置相差熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）；RM2016輪換切片機（Leica公司，德國）。
1.2 兔BMSCs分離、培養及鑒定
取3周齡日本大耳白兔，穿刺抽取股骨骨髓，采用全骨髓培養法分離培養BMSCs并傳代，倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況。對培養細胞行成骨、成軟骨及成脂誘導分化鑒定，證實獲得細胞為可向骨、軟骨及脂肪等方向分化的BMSCs[15]。取第2代細胞用于以下實驗。
1.3 兔BMSCs向ECs誘導分化及免疫熒光染色觀察
將第2代BMSCs以1 × 104個/cm2密度接種至6孔培養板中，L-DMEM培養基繼續培養2 d后，實驗組更換為ECs培養基（含10%FBS、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素、0.29 g/L L-谷氨酰胺、10 μg/L VEGF、10 μg/L bFGF的L-DMEM培養基）；對照組不加誘導劑繼續培養。每2～3天換液1次，倒置顯微鏡下觀察誘導后3、7、14 d實驗組細胞形態變化。
培養7、14 d將兩組細胞以1 × 104個/cm2密度爬片，待細胞生長融合至40%～50%時，PBS洗3次，5 min/次；4%冷多聚甲醛固定20 min，PBS洗3次、5 min/次；山羊血清室溫封閉30 min，PBS洗3次、5 min/次，分別加入一抗（兔抗兔vWF、人抗兔CD31）4℃濕盒內過夜；第2天PBS洗3次、5 min/次，加入相應二抗（FITC標記的山羊抗兔、PE標記的山羊抗人）室溫避光孵育2 h，PBS洗3次、5 min/次；加入0.5 μg/ mL DAPI染色5 min，PBS洗3次，去除多余DAPI，抗熒光淬滅劑封片，倒置相差熒光顯微鏡下觀察。
1.4 預血管化細胞膜片相關檢測
1.4.1 預血管化細胞膜片構建及接種ECs后形態學觀察
將第2代BMSCs以9 × 104個/cm2密度接種至直徑10 cm培養皿，加入未分化細胞膜片培養基（含50 mg/L抗壞血酸、10%FBS、100 U/mL青霉素、100 U/ mL鏈霉素、0.29 g/L L-谷氨酰胺的GG-DMEM培養基）培養，每隔2 d換液1次。經14 d連續培養，在培養皿底壁形成一層透明狀未分化的BMSCs膜片。實驗分為3組：A組將BMSCs誘導14 d后獲得的ECs用0.25%胰蛋白酶消化，以5 × 104個/cm2密度均勻接種至未分化的BMSCs膜片上，更換為條件培養基（未分化細胞膜片培養基與ECs培養基按1∶1比例混合）繼續培養；B組為單純未分化的BMSCs膜片；C組為BMSCs誘導14 d后獲得的ECs在ECs培養基中單獨培養。倒置顯微鏡觀察各組細胞及膜片形態。
1.4.2 免疫熒光染色檢測
取培養3、7、14 d A、B組細胞膜片及C組誘導分化的ECs，用4%冷多聚甲醛固定15 min，PBS洗3次、5 min/次。同1.3方法行CD31免疫熒光染色檢測。
1.4.3 組織學觀察
取培養3、7、14 d A、B組細胞膜片制作冰凍切片，片厚5 μm，常規行HE染色觀察。
2 結果
2.1 BMSCs向ECs誘導分化及免疫熒光染色鑒定
倒置顯微鏡觀察可見原代分離培養的BMSCs呈長梭形（圖 1a）。實驗組誘導3 d，細胞質收縮、細胞核變大（圖 1b）；7 d，細胞呈卵圓形，形態變化明顯（圖 1c）；14 d，細胞呈“鋪路石”樣結構，漩渦狀生長（圖 1d）。免疫熒光染色示，實驗組vWF、CD31均呈陽性表達，而對照組均呈陰性（圖 2）。
圖1
BMSCs形態學觀察（倒置顯微鏡× 100）???原代BMSCs???向ECs誘導培養3 d???向ECs誘導培養7 d???向ECs誘導培養14 d ?圖 2免疫熒光染色鑒定ECs（倒置相差熒光顯微鏡× 200）???對照組vWF???對照組CD31???實驗組vWF???實驗組CD31 ?圖 3各組各時間點細胞及膜片形態觀察???A組細胞接種3 d（倒置顯微鏡× 400）???A組細胞接種7 d（倒置顯微鏡× 400）???A組細胞接種14 d（倒置顯微鏡× 400）???B組培養14 d的BMSCs膜片???B組培養14 d的BMSCs膜片（倒置顯微鏡× 100）???C組ECs培養14 d（倒置顯微鏡× 100）
Figure1.
Morphology observation of BMSCs (Inverted microscope × 100)???Primary BMSCs???ECs differentiated from BMSCs after 3 days???ECs differentiated from BMSCs after 7 days???ECs differentiated from BMSCs after 14 days ?Fig.2 The immunofluorescent identification of ECs (Inverted contrast fluorescence microscope × 200)???vWF of control group???CD31 of control group???vWF of experimental group???CD31 of experimental group ?Fig.3 Morphology observations of cells and sheet in each group at different time points???Cells inoculated for 3 days in group A (Inverted microscope × 400)???Cells inoculated for 7 days in group A (Inverted microscope × 400)???Cells inoculated for 14 days in group A (Inverted microscope × 400)???BMSCs sheet cultured for 14 days in group B???BMSCs sheet cultured for 14 days in group B (Inverted microscope × 100)???ECs cultured for 14 days in group C (Inverted microscope × 100)
2.2 預血管化細胞膜片相關檢測
2.2.1 ECs接種至BMSCs膜片后形態觀察
A組：細胞接種至BMSCs膜片上3 d后，細胞重排，形成空泡（圖 3a）；7 d，鏡下可見網狀結構（圖 3b）；14 d，網狀結構更加明顯（圖 3c）。B組：BMSCs在培養皿底壁迅速生長融合，連續培養14 d后形成致密的細胞膜片（圖 3d），鏡下可見具有多層細胞的細胞膜片形成，細胞呈長梭形，致密排列（圖 3e）。C組：BMSCs誘導分化14 d的ECs單純連續培養14 d，在培養皿底未見明顯透明膜狀物形成，細胞緊密連接，呈“鋪路石”樣結構（圖 3f）。
2.2.2 免疫熒光染色檢測
CD31免疫熒光染色示：A組細胞接種至BMSCs膜片上3 d，細胞發生遷移、融合，形成空泡（圖 4a）；7 d，空泡發生聚集（圖 4b）；14 d，可見微血管管腔形成（圖 4c）。B組BMSCs膜片CD31表達陰性（圖 4d）；而C組ECs培養14 d時CD31表達陽性且呈點狀表達，但無管網狀結構形成（圖 4e）。
圖4
各組免疫熒光染色檢測（倒置相差熒光顯微鏡× 200）???A組細胞接種3 d???A組細胞接種7 d ???A組細胞接種14 d ??B組培養14 d的BMSCs膜片??C組ECs培養14 d ?圖 5 ?各組HE染色觀察??A組細胞接種3 d（× 100）??A組細胞接種7 d（× 200）??A組細胞接種14 d（× 200）??B組培養14 d的BMSCs膜片（× 50）
Figure4.
Immunofluorescence staining observations of BMSCs in each group (Inverted contrast fluorescence microscope × 200) ??Cells inoculated for 3 days in group A ??Cells inoculated for 7 days in group A ??Cells inoculated for 14 days in group A BMSCs sheet cultured for 14 days in group B ??ECs cultured for 14 days in group C ?Fig.5 ?HE staining observation of each group ??Cells inoculated for 3 days in group A (× 100) ??Cells inoculated for 7 days in group A (× 200) ??Cells inoculated for 14 days in group A (× 200) ??BMSCs sheet cultured for 14 days in group B (× 50)
2.2.3 組織學觀察
A組細胞接種至BMSCs膜片上3 d，細胞相互連接（圖 5a）；7、14 d后細胞融合，逐漸形成微血管空腔（圖 5b 、圖 5c）。B組BMSCs膜片無網狀結構形成（圖 5d d）。
3 討論
ECs在構建組織工程血管化組織過程中具有重要作用，但既往通過直接分離法獲取血管或微血管的終末分化細胞方法由于供區來源有限，取材時常會對機體造成新的損傷而限制了其應用；且進一步研究發現，源于血管或微血管的終末分化內皮細胞增殖能力較弱，在體外擴增過程中易老化，存在失去功能及生物活性不強等問題[16]。因此，尋求更好的獲取ECs種子細胞的方法，成為目前血管化研究的熱點。有研究表明[17]，BMSCs可誘導分化形成ECs，且誘導分化的ECs和終末分化的ECs相比，具有更強的分化能力。故本研究采用VEGF和bFGF誘導兔BMSCs分化形成ECs，結果顯示，誘導3 d后細胞形態發生變化，細胞質收縮，細胞核變大；誘導7、14 d后細胞由長梭形變為“鋪路石”樣；免疫熒光染色顯示誘導后細胞vWF、CD31表達均呈陽性；提示誘導所得細胞具有ECs的特征。然后將誘導分化獲得的ECs接種至BMSCs膜片上，嘗試完全應用源于自體BMSCs構建預血管化細胞膜片的可行性。結果顯示，其接種至BMSCs膜片上可形成具有血管網絡結構的細胞膜片，提示通過誘導獲得的ECs在體外能形成毛細血管網，有效解決了作為血管化種子細胞取材相對不便的問題。同時作為多能干細胞的BMSCs可分泌多種生長因子，如VEGF、bFGF等[10]，有利于促進血管形成。
構建組織工程血管化組織過程中除需要血管化種子細胞外，合理的構建策略也至關重要。本研究將兔BMSCs誘導分化獲得的ECs以一定濃度接種至BMSCs膜片上，細胞融合并相互連接，逐漸形成了毛細血管網狀結構和類似微血管管腔樣結構。而單純BMSCs膜片細胞形態無明顯改變、未見管網狀結構形成；單獨培養的ECs CD31表達陽性且呈點狀表達，同樣未見管網狀結構形成。結果表明微血管管腔樣結構的形成可能與細胞間相互作用以及BMSCs膜片分泌的細胞外基質對細胞的作用有關。一方面，當誘導分化的ECs接種至未分化細胞膜片上，ECs發生遷移、聚集，與BMSCs相互作用，促進毛細血管網狀結構形成；另一方面，BMSCs分泌的細胞外基質為ECs的增殖、遷移和聚集提供了一定環境。但本實驗體外獲得的毛細血管網是否能在體內長期穩定存在并形成功能性血管（即血管化），仍需進一步實驗探索。
血管化是組織工程移植物在宿主體內能夠長期存活和維持功能的關鍵。構建血管化（即預血管化）的方法主要有以下幾種[2-4]：①利用生長因子促進新生血管形成；②細胞共培養與支架形成復合物植入體內促進血管形成；③顯微外科技術與組織工程技術結合促進血管形成；④聯合基因工程技術促進血管形成。目前研究者們更多關注的是通過共培養方法獲得預血管化的網絡結構。Tsigkou等[9]將ECs和血管周細胞混合后加入工程化骨組織構建物中，形成穩定持久的微血管，并與宿主血管系統吻合。Staton等[11]在體外將兔ECs與BMSCs或10T1/2胚胎成纖維細胞共培養，與支架材料復合形成了管網狀結構。但是，這些通過細胞共培養構建血管網的方法一般會受到支架材料生物相容性不良、降解速率控制不佳等問題影響。本研究采用原代獲取的BMSCs并將其誘導分化為ECs，然后將誘導形成的ECs與BMSCs膜片共培養獲得預血管化網絡結構，細胞膜片中保留的細胞自分泌的細胞外基質維持了細胞表型及其功能，為ECs的遷移、聚集提供了良好環境，提高了細胞利用率；同時，僅提取BMSCs并由其分化獲得ECs，省去了分離培養ECs的步驟。本研究獲取細胞膜片的方法簡便易行，已在國內外多個實驗室應用，且獲得的細胞膜片具有一定厚度和賦形能力[18-20]，可考慮與其他類型膜片復合構建工程化組織，避免了免疫排斥反應和生物支架材料組織相容性不良等缺點，為構建三維預血管化工程化組織提供了新的思路和方法。
