引用本文： 周勇, 鄒昌, 閔理, 石銳, 張聞力, 羅翼, 彭靜, 段宏, 屠重棋, 張暉. 腺病毒介導Wnt10b基因調控人BMSCs成骨成脂分化的體外實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(10): 1284-1291. doi: 10.7507/1002-1892.20140278 復制
MSCs是成骨細胞和脂肪細胞共同的前體細胞[1]。體外研究發現，誘導MSCs成骨分化的因素會抑制其成脂分化[2]，這與病理學及流行病學發現的老齡化、骨丟失和骨質疏松伴隨骨髓內脂肪組織增加一致[3-4]。目前體內外實驗均支持“細胞系競爭”的學說，即骨內以犧牲成骨為代價的脂肪細胞增多，是導致骨質疏松癥等骨丟失性疾病骨量減少的重要原因之一[5-7]。但是MSCs成骨-成脂反向分化的具體細胞學機制還不清楚。
隨著對骨代謝機制研究的深入，Wnt信號通路所起關鍵作用引起廣泛關注，特別是經典Wnt信號通路[8-11]。研究發現，Wnt10b基因在調控MSCs成骨成脂分化中起關鍵作用，Wnt10b有可能成為治療骨丟失和/或肥胖相關疾病的新手段[12-14]。目前通過轉基因鼠對Wnt10b的研究較為集中，最早Longo等[13]發現脂肪型脂肪酸結合蛋白4（adipocyte fatty acid binding protein 4，FABP4）啟動子調控下的Wnt10b過表達轉基因鼠（FABP4-Wnt10b鼠）出現骨量和骨強度的增加，并且阻止因年齡和激素導致的骨量丟失[15]；而敲除Wnt10b基因鼠（Wnt10b-/-鼠）因骨小梁數量減少和間隔增大，導致骨體積和骨密度降低了30%。敲除低密度脂蛋白受體相關蛋白5基因鼠（LRP5-/-鼠）也出現了類似表現，原因可能是內源性Wnt10b信號的減少[16-17]。骨鈣素（osteocalcin，OST）啟動子調控的Wnt10b基因過表達鼠（OST-Wnt10b鼠）骨量增加約75%，并且與野生鼠相比成骨細胞數量明顯增加，但破骨細胞無明顯改變[18]。雜合子Wnt10b鼠（Wnt10b+/-鼠）6個月時出現骨小梁明顯減少，成骨細胞功能減退和數量減少，但破骨細胞未受到明顯影響。更重要的是Wnt10b還具有維持MSCs自我更新及MSCs數量的能力，Wnt10b可以決定MSCs的命運[19]，進一步說明Wnt10b在調控MSCs成骨成脂分化中起關鍵作用。但體外細胞實驗研究相對較少，目前尚未見采用人BMSCs（human BMSCs，hBMSCs）進行的相關實驗研究。本研究旨在進一步探索Wnt10b基因調控hBMSCs成骨成脂分化的分子機制以及Wnt10b基因是否對hBMSCs也具有類似作用，為探索Wnt10b調控hBMSCs成骨成脂分化提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 Wnt10b基因表達腺病毒載體構建與轉染效率檢測
1.1.1 Wnt10b基因表達腺病毒載體的構建
采用PCR擴增Wnt10b基因CDS區，并在上游引入BamHⅠ酶切點，下游引入EcoRⅠ酶切點。引物序列：Wnt10b上游5'-CGGGATCCGCCACCATGCTGGAGG-AGCCCCGG-3'，下游5'-GGAATTCTCACTTACACAC-ATTCACCCACTCT-3'。產物純化后雙酶切基因片段，再將酶切后的Wnt10b基因片段和pYr-adshuttle-1載體帶進行連接，連接產物予以轉化大腸桿菌感受態細胞進行重組質粒的擴增和提取。
1.1.2 Wnt10b基因沉默（Wnt10b-shRNA）腺病毒載體的構建
根據shRNA靶點的選擇原則，從TRC shRNA數據庫中擇優選取3條Wnt10b-shRNA序列作為待篩靶序列，設計并合成Wnt10b-shRNA引物：Wnt10b-shRNA-83上游5'-CACCCGGGCTCTAAGCAATGAG-ATTCTCGAGAATCTCATTGCTTAGAGCCCGTTT-TTTG-3'，下游5'-AGCTCAAAAAACGGGCTCTAAG-CAATGAGATTCTCGAGAATCTCATTGCTTAGAG-CCCG-3'；Wnt10b-shRNA-84上游5'-CACCCTTTGAG-AAGTCTCCTGACTTCTCGAGAAGTCAGGAGACT-TCTCAAAGTTTTTTG-3'，下游5'-AGCTCAAAAAAC-TTTGAGAAGTCTCCTGACTTCTCGAGAAGTCA-GGAGACTTCTCAAAG-3'；Wnt10b-shRNA-87上游5'-
CACCCGGTTTCCGAGAAAGTGCTTTCTCGA-GAAAGCACTTTCTCGGAAACCGTT-TTTTG-3'，下游5'-AGCTCAAAAAACGGTTTCCGAGAAAGTGCTTTCTCGAGAAAGCACTTTCTCGGAA-ACCG-3'。將合成引物分別與BsaⅠ（NEB）酶切后的pYr-1.1連接，連接產物轉化大腸桿菌感受態細胞進行重組質粒的擴增和提取。
1.1.3 所構建病毒載體轉染效率檢測
選取HEK293細胞作為轉染對象，以未行任何處理的HEK293細胞為空白對照（NC組），以pYr-1.1-HK質粒（空質粒）轉染的HEK293細胞為陰性對照組（HK組），以pYr-adshuttle-1-Wnt10b質粒轉染的HEK293細胞為陽性對照組（Wnt10b組），以pYr-1.1-hWnt10b-shRNA-83、pYr-1.1-hWnt10b-shRNA-84、pYr-1.1-hWnt10b-shRNA-87 3個質粒轉染的HEK293細胞為實驗組（分別為83干擾組、84干擾組和87干擾組），分別予以相應處理后行RT-PCR檢測，引物對：Wnt10b-F196：5'-CACTGTCCCGAGGCAAGAG-3'，Wnt10b-R196：5'-TTGTGGATTCGCATTCGTG-3'，GAPDH-F452：5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，GAPDH-R452：5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。
1.1.4 病毒包裝
通過LR體外同源重組將穿梭載體pYr-adshuttle-1-Wnt10b和干擾效果最好的質粒表達框構建至pAd/PL-DEST腺病毒表達載體上，PacⅠ酶切重組腺病毒質粒并轉染HEK293細胞，進行重組腺病毒的擴增，半數組織培養感染劑量法檢測重組腺病毒感染性滴度。
1.2 hBMSCs分離培養
骨髓樣本來源于四川大學華西醫院骨科4例住院患者，研究通過醫院倫理委員會批準，患者均知情同意。其中男3例，女1例；年齡20～40歲。均為因創傷需行取髂骨植骨手術者，術前檢查證實無造血系統及腫瘤等疾患；全麻下手術，取髂骨時使用無菌注射器收集溢出的骨髓液，采用密度梯度離心法獲取hBMSCs，置于完全培養基（含10%FBS的DMEM培養基）中，于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱內培養并傳代，取第4代細胞進行實驗。
1.3 實驗分組及檢測指標
取第4代hBMSCs，以5 × 106個/mL濃度接種于含完全培養基的T-75培養瓶中，當生長達80%融合后，將培養瓶中一部分hBMSCs消化轉移至含載玻片的6孔培養板，行ALP、茜素紅染色和油紅O染色；另一部分細胞行實時熒光定量PCR和Western blot檢測。實驗分為4組，A、B、C組分別加入Wnt10b基因表達腺病毒載體、Wnt10b-shRNA腺病毒載體和空病毒轉染細胞，D組細胞不進行轉染作為空白對照組。
1.3.1 成骨相關檢測
①ALP和茜素紅染色：取各組細胞，加入成骨誘導培養基（含10%FBS、0.1 μmol/L地塞米松、50 μmol/L抗壞血酸、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉的DMEM培養基）培養，7 d后行ALP染色觀察，14 d后行茜素紅染色觀察，并與各組未誘導細胞進行比較。
②實時熒光定量PCR檢測：取成骨誘導后10 d各組細胞，采用實時熒光定量PCR檢測成骨相關基因Runx2、OST、ALP及Ⅰ型膠原的相對表達量，并與未誘導細胞進行比較。RNA提取后，采用隨機引物利用逆轉錄酶逆轉錄成cDNA，采用Revert AidTM Frist Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas公司，加拿大）進行擴增。引物由成都立康科技有限公司提供；反應體系：10 × buffer（Mg2+ free）3 μL、MgCl2（25 mmol/ L）3 μL、dNTP（25 mmol/L）0.36 μL、上游引物（10 μmol/ L）1 μL、下游引物（10 μmol/L）1 μL、Taq酶（5 U/μL）0.3 μL、ddH2O 15.34 μL、cDNA模板5 μL。擴增條件：94℃、2 min；94℃、20 s，56℃、30 s，60℃、40 s，30個循環；72℃延伸5 min。分析繪制擴增動力學曲線，根據動力學曲線確定每個樣品管中熒光強度增加到某一特定閾值時的擴增循環數（Ct值），通過2-ΔΔCt公式計算相對表達量。
③Western blot檢測：取成骨誘導后10 d各組細胞，采用Western blot法檢測成骨相關蛋白ALP、OST表達，并與未誘導細胞進行比較。于冰上裂解提取細胞總蛋白，配置SDS-PAGE膠，將蛋白質轉印至聚偏氟乙烯膜表面，用含10%脫脂奶粉的TBS緩沖液于37℃封閉60 min，加入一抗（1∶500），脫色搖床搖1 h；TBS緩沖液沖洗4次，加入二抗（1∶1 000），脫色搖床搖1 h；TBS緩沖液沖洗4次，用ECL試劑盒進行化學發光檢測，ECL A、B液等體積混合滴于膜上，5 min后暗室壓片、曝光、顯影和定影，并行定量檢測。
1.3.2 成脂相關檢測
①油紅O染色：取各組細胞，加入成脂誘導培養基（含10%FBS、1 μmol/L地塞米松、10 μmol/L胰島素、0.5 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、200 μmol/L吲哚美辛的DMEM培養基）培養，14 d后行油紅O染色，并與各組未誘導細胞進行比較。
②實時熒光定量PCR檢測：取成脂誘導后10 d各組細胞，同1.3.1方法采用實時熒光定量PCR檢測成脂相關基因過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator activated receptor γ，PPARγ）、CCAAT增強子結合蛋白α（CCAAT enhancer binding protein α，C/EBPα）、C/EBPβ、FABP4的相對表達量，并與未誘導細胞進行比較。
③Western blot檢測：取成脂誘導后10 d各組細胞，同1.3.1方法采用Western blot法檢測成脂相關蛋白PPARγ和FABP4表達，并與未誘導細胞進行比較。
1.4 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 病毒載體轉染效率檢測
結果顯示Wnt10b組Wnt10b基因顯著表達，84干擾組和87干擾組Wnt10b基因的表達明顯受到干擾，其中87干擾組即pYr-1.1-hWnt10b-shRNA-87干擾效果最好。見圖 1。所構建病毒滴度為5 × 109 PFU/mL。
圖1
RT-PCR檢測病毒載體轉染效率1：NC組2：HK組3：Wnt10b組4：83干擾組5：84干擾組6：87干擾組
Figure1.
Transfection efficiency of virus vector by RT-PCR detection 1: NC group 2: HK group 3: Wnt10b group 4: 83 interference group 5: 84 interference group 6: 87 interference group
2.2 成骨相關檢測
2.2.1 ALP染色
成骨誘導培養7 d，4組ALP染色均為陽性，其中A組呈強陽性，B組染色最弱（圖 2）；無誘導培養7 d，A組ALP染色呈弱陽性，其余3組均為陰性（圖 3）。
圖2
各組成骨誘導7 d ALP染色（× 200）??A組??B組??C組??D組?圖 3 ?各組無成骨誘導7 d ALP染色（× 200）??A組??B組??C組??D組?圖 4 ?各組成骨誘導14 d茜素紅染色（× 200）??A組??B組??C組??D組?圖 5 ?各組無成骨誘導14 d茜素紅染色（× 200）??A組??B組??C組??D組
Figure2.
ALP staining observation at 7 days after osteogenic induced culture (× 200) ??Group A ??Group B ??Group C ??Group D ?Fig.3 ?ALP staining observation at 7 days after non-induced culture (× 200)??Group A ??Group B ??Group C ??Group DFig.4 ?Alizarin red staining observation at 14 days after osteogenic induced culture (× 200)??Group A ??Group B ??Group C ??Group DFig.5 ?Alizarin red staining observation at 14 days after non-induced culture (× 200)??Group A ??Group B ??Group C ??Group D
2.2.2 茜素紅染色
成骨誘導培養14 d，A組出現大量片狀融合褐色礦化結節，B組見少許點狀褐色礦化結節，C、D組出現大量點狀褐色礦化結節（圖 4）；無誘導培養14 d，A組可見大量點狀褐色礦化結節，C、D組偶見不典型礦化結節，B組幾乎未見礦化結節（圖 5）。
2.2.3 實時熒光定量PCR檢測
成骨誘導培養10 d，A組Runx2、OST、ALP及Ⅰ型膠原mRNA相對表達量均顯著高于B、C、D組，差異有統計學意義（P＜0.05）；除Runx2外，B組OST、ALP及Ⅰ型膠原mRNA相對表達量均顯著低于C、D組，差異有統計學意義（P＜0.05）；C、D組間差異無統計學意義（P＞0.05）。除B組OST、ALP及Ⅰ型膠原相對表達量無誘導培養與成骨誘導培養比較差異無統計學意義（P＞0.05）外，其余各組基因相對表達量成骨誘導培養均高于無誘導培養（P＜0.05）。見圖 6。
圖6
各組成骨誘導及無誘導10 d實時熒光定量PCR檢測各基因表達??Runx2 ??OST ??ALP ??Ⅰ型膠原圖 7 ?各組成骨誘導及無誘導10 d Western blot檢測各蛋白表達1：A組2：B組3：C組4：D組??成骨誘導??無誘導圖 8 ?各組成骨誘導及無誘導10 d Western blot檢測各蛋白表達量??ALP ??OST
Figure6.
Real-time fluorescent quantitative PCR detection for osteoblast genes expressions after osteogenic induced or non-induced culture for 10 days ??Runx2 ??OST ??ALP ??Collagen type I Fig.7 ?Western blot detection for osteoblast proteins expressions after osteogenic induced or non-induced culture for 10 days 1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D ??Osteogenic induced culture ??Non-induced culture Fig.8 ?Western blot detection for osteoblast proteins expressions after osteogenic induced or non-induced culture for 10 days ??ALP ??OST
2.2.4 Western blot檢測
成骨誘導培養10 d，A組ALP和OST蛋白表達量明顯高于其余3組，C、D組高于B組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；C、D組間差異無統計學意義（P＞0.05）。無誘導培養10 d，A組ALP蛋白表達量明顯高于其余3組，C、D組高于B組，差異均有統計學意義（P＜0.05），C、D組間差異無統計學意義（P＞0.05）；A組OST蛋白表達量高于其余3組，C組高于B組，差異均有統計學意義（P＜0.05），B、D組間及C、D組間差異無統計學意義（P＞0.05）。成骨誘導各組ALP和OST蛋白表達量均顯著高于無誘導培養各組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖 7、8。
2.3 成脂相關檢測
2.3.1 油紅O染色
成脂誘導培養14 d，B、C、D組見大量深染紅色區域，呈強陽性表現，其中B組最強；A組散在小團狀著色區，數量較其他組明顯減少（圖 9）。無誘導培養示，B組見較少典型紅色團塊狀著色區，C組見極少小團狀著色區，A、D組呈陰性（圖 10）。
圖9
各組成脂誘導14 d油紅O染色（× 200）??A組??B組??C組??D組圖 10各組無成脂誘導14 d油紅O染色（× 200）??A組??B組??C組??D組
Figure9.
Oil red O staining observation after adipogenic induced culture for 14 days (× 200) ??Group A ??Group B ??Group C ??Group D Fig.10 Oil red O staining observation after non-induced culture for 14 days (× 200) ??Group A ??Group B ??Group C ??Group D
2.3.2 實時熒光定量PCR檢測
成脂誘導培養10 d，A組C/EBPβ、PPARγ、C/EBPα和FABP4 mRNA相對表達量均低于B、C、D組，差異有統計學意義（P＜0.05）；除C/EBPβ外，B組PPARγ、C/EBPα、FABP4 mRNA相對表達量均高于C、D組，差異有統計學意義（P＜0.05）；除FABP4外，C、D組C/EBPβ、PPARγ、C/EBPα mRNA相對表達量比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。無誘導培養10 d，B組PPARγ mRNA相對表達量高于A、C、D組，C、D組高于A組，差異有統計學意義（P＜0.05），C、D組間差異無統計學意義（P＞0.05）；FABP4、C/EBPβ和C/EBPα mRNA相對表達量各組間差異無統計學意義（P＞0.05）。成脂誘導培養各組PPARγ mRNA相對表達量均高于無誘導培養（P＜0.05）；除A組外，B、C、D組FABP4、C/EBPβ和C/EBPα mRNA相對表達量均高于無誘導培養（P＜0.05）。見圖 11。
圖11
各組成脂誘導及無誘導10 d實時熒光定量PCR檢測各基因表達??PPARγ ??C/EBPα ??FABP4 ??C/EBPβ 圖 12 ?各組成脂誘導及無誘導10 d Western blot檢測各蛋白表達1：A組2：B組3：C組4：D組??成脂誘導??無誘導圖 13各組成脂誘導及無誘導10 d Western blot檢測各蛋白表達量??PPARγ ??FABP4
Figure11.
Real-time fluorescent quantitative PCR detection for adipocyte genes expressions after adipogenic induced or non-induced culture for 10 days ??PPARγ ??C/EBPα ??FABP4 ??C/EBPβ Fig.12 Western blot detection for adipocyte proteins expressions after adipogenic induced or non-induced culture for 10 days 1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D ??Adipogenic induced culture ??Non-induced culture Fig.13 Western blot detection for adipocyte proteins expressions after adipogenic induced or non-induced culture for 10 days ??PPARγ ??FABP4
2.3.3 Western blot檢測
成脂誘導培養10 d，B組PPARγ和FABP4蛋白表達量明顯高于其余3組，C、D組高于A組，差異均有統計學意義（P＜0.05），C、D組間差異無統計學意義（P＞0.05）。無誘導培養10 d，B組FABP4蛋白表達量明顯高于其余3組，C、D組高于A組，差異均有統計學意義（P＜0.05），C、D組間差異無統計學意義（P＞0.05）；各組間PPARγ蛋白表達量差異無統計學意義（P＞0.05）。除A組PPARγ外，各組PPARγ和FABP4蛋白表達量成脂誘導培養均高于無誘導培養（P＜0.05）。見圖 12、13。
3 討論
ALP是BMSCs早期成骨分化的重要標志，在細胞外基質礦化過程中有重要作用；茜素紅染色利用沉積的鈣與茜素紅發生顯色反應，呈現紅褐色的染色效果。這兩個檢測結果分別對成骨分化的早期和晚期具有重要意義。油紅O遇到脂滴顯現紅色，其他組織則很少顯色，通過油紅O可很好地判斷成脂分化情況。本實驗上述染色結果顯示：成骨誘導后A組茜素紅染色強陽性，B組則為弱陽性，成脂誘導后油紅O染色則相反。說明Wnt10b表達促進hBMSCs成骨分化，抑制其成脂分化；而Wnt10b表達被干擾，則促進hBMSCs成脂分化，抑制其成骨分化。
本實驗實時熒光定量PCR檢測結果示：成骨誘導培養的成骨轉錄因子Runx2、OST、ALP、Ⅰ型膠原和成脂誘導培養的成脂轉錄因子PPARγ、FABP4、C/EBPα的表達水平明顯高于無誘導培養；其中上述成骨轉錄因子A組表達水平高于D組，成脂轉錄因子表達水平低于D組，B組則與A組相反。說明hBMSCs成骨成脂分化時，相應轉錄因子表達升高，Wnt10b通過改變轉錄因子的表達水平對hBMSCs成骨成脂分化進行調控。這與Bennett等[16]對ST2細胞研究的結果相似，他們通過Wnt10b基因表達逆轉錄病毒轉染ST2細胞的實驗研究認為，Wnt10b基因通過調控多能干細胞自身表達的成骨成脂轉錄因子來決定其分化方向，包括上調成骨因子Twist、Runx2、Dlx5和OST，抑制成脂因子PPARγ、C/EBPα和FABP4。本實驗還發現成骨轉錄因子ALP和Ⅰ型膠原表達的變化也與上述轉錄因子一致。另外，本實驗結果顯示：成脂轉錄因子C/ EBPβ變化不明顯，原因可能是C/EBPβ為hBMSCs成骨成脂分化的早期調節因子[20]，本研究檢測時間相對較晚，其表達水平已下降，因而未出現統計學差異。
Western blot檢測結果示：成骨相關ALP、OST蛋白和成脂相關FABP4和PPARγ蛋白的表達水平檢測結果基本一致，即hBMSCs成骨誘導分化時，成骨相關蛋白的表達A組高于D組，B組低于D組；成脂分化時，成脂相關蛋白的表達則相反。說明hBMSCs成骨成脂分化時Wnt10b正向調控成骨相關ALP、OST蛋白的表達，負向調控成脂相關FABP4和PPARγ蛋白的表達。從而從蛋白水平進一步說明，Wnt10b通過調控成骨成脂轉錄因子和蛋白的表達來實現對hBMSCs成骨成脂分化的調控。
另外，本實驗結果示，在無誘導培養下，A組出現成骨檢測陽性，B組出現成脂檢測陽性，相應D組結果為陰性；并且實時熒光定量PCR和Western blot檢測結果示，無誘導培養下，A組成骨轉錄因子表達高于D組，成脂轉錄因子表達低于D組，B組則相反。提示單純Wnt10b基因表達水平的變化能夠使hBMSCs向成骨成脂方向分化，即Wnt10b高表達能夠始發hBMSCs成骨分化，表達抑制能夠始發hBMCSs成脂分化。但由于hBMSCs在成骨成脂誘導培養下，單純Wnt10b基因表達水平的改變未出現hBMSCs分化方向的逆轉，說明hBMSCs成骨成脂分化的調控還存在其他影響因素，這仍需進一步研究。
MSCs是成骨細胞和脂肪細胞共同的前體細胞[1]。體外研究發現，誘導MSCs成骨分化的因素會抑制其成脂分化[2]，這與病理學及流行病學發現的老齡化、骨丟失和骨質疏松伴隨骨髓內脂肪組織增加一致[3-4]。目前體內外實驗均支持“細胞系競爭”的學說，即骨內以犧牲成骨為代價的脂肪細胞增多，是導致骨質疏松癥等骨丟失性疾病骨量減少的重要原因之一[5-7]。但是MSCs成骨-成脂反向分化的具體細胞學機制還不清楚。
隨著對骨代謝機制研究的深入，Wnt信號通路所起關鍵作用引起廣泛關注，特別是經典Wnt信號通路[8-11]。研究發現，Wnt10b基因在調控MSCs成骨成脂分化中起關鍵作用，Wnt10b有可能成為治療骨丟失和/或肥胖相關疾病的新手段[12-14]。目前通過轉基因鼠對Wnt10b的研究較為集中，最早Longo等[13]發現脂肪型脂肪酸結合蛋白4（adipocyte fatty acid binding protein 4，FABP4）啟動子調控下的Wnt10b過表達轉基因鼠（FABP4-Wnt10b鼠）出現骨量和骨強度的增加，并且阻止因年齡和激素導致的骨量丟失[15]；而敲除Wnt10b基因鼠（Wnt10b-/-鼠）因骨小梁數量減少和間隔增大，導致骨體積和骨密度降低了30%。敲除低密度脂蛋白受體相關蛋白5基因鼠（LRP5-/-鼠）也出現了類似表現，原因可能是內源性Wnt10b信號的減少[16-17]。骨鈣素（osteocalcin，OST）啟動子調控的Wnt10b基因過表達鼠（OST-Wnt10b鼠）骨量增加約75%，并且與野生鼠相比成骨細胞數量明顯增加，但破骨細胞無明顯改變[18]。雜合子Wnt10b鼠（Wnt10b+/-鼠）6個月時出現骨小梁明顯減少，成骨細胞功能減退和數量減少，但破骨細胞未受到明顯影響。更重要的是Wnt10b還具有維持MSCs自我更新及MSCs數量的能力，Wnt10b可以決定MSCs的命運[19]，進一步說明Wnt10b在調控MSCs成骨成脂分化中起關鍵作用。但體外細胞實驗研究相對較少，目前尚未見采用人BMSCs（human BMSCs，hBMSCs）進行的相關實驗研究。本研究旨在進一步探索Wnt10b基因調控hBMSCs成骨成脂分化的分子機制以及Wnt10b基因是否對hBMSCs也具有類似作用，為探索Wnt10b調控hBMSCs成骨成脂分化提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 Wnt10b基因表達腺病毒載體構建與轉染效率檢測
1.1.1 Wnt10b基因表達腺病毒載體的構建
采用PCR擴增Wnt10b基因CDS區，并在上游引入BamHⅠ酶切點，下游引入EcoRⅠ酶切點。引物序列：Wnt10b上游5'-CGGGATCCGCCACCATGCTGGAGG-AGCCCCGG-3'，下游5'-GGAATTCTCACTTACACAC-ATTCACCCACTCT-3'。產物純化后雙酶切基因片段，再將酶切后的Wnt10b基因片段和pYr-adshuttle-1載體帶進行連接，連接產物予以轉化大腸桿菌感受態細胞進行重組質粒的擴增和提取。
1.1.2 Wnt10b基因沉默（Wnt10b-shRNA）腺病毒載體的構建
根據shRNA靶點的選擇原則，從TRC shRNA數據庫中擇優選取3條Wnt10b-shRNA序列作為待篩靶序列，設計并合成Wnt10b-shRNA引物：Wnt10b-shRNA-83上游5'-CACCCGGGCTCTAAGCAATGAG-ATTCTCGAGAATCTCATTGCTTAGAGCCCGTTT-TTTG-3'，下游5'-AGCTCAAAAAACGGGCTCTAAG-CAATGAGATTCTCGAGAATCTCATTGCTTAGAG-CCCG-3'；Wnt10b-shRNA-84上游5'-CACCCTTTGAG-AAGTCTCCTGACTTCTCGAGAAGTCAGGAGACT-TCTCAAAGTTTTTTG-3'，下游5'-AGCTCAAAAAAC-TTTGAGAAGTCTCCTGACTTCTCGAGAAGTCA-GGAGACTTCTCAAAG-3'；Wnt10b-shRNA-87上游5'-
CACCCGGTTTCCGAGAAAGTGCTTTCTCGA-GAAAGCACTTTCTCGGAAACCGTT-TTTTG-3'，下游5'-AGCTCAAAAAACGGTTTCCGAGAAAGTGCTTTCTCGAGAAAGCACTTTCTCGGAA-ACCG-3'。將合成引物分別與BsaⅠ（NEB）酶切后的pYr-1.1連接，連接產物轉化大腸桿菌感受態細胞進行重組質粒的擴增和提取。
1.1.3 所構建病毒載體轉染效率檢測
選取HEK293細胞作為轉染對象，以未行任何處理的HEK293細胞為空白對照（NC組），以pYr-1.1-HK質粒（空質粒）轉染的HEK293細胞為陰性對照組（HK組），以pYr-adshuttle-1-Wnt10b質粒轉染的HEK293細胞為陽性對照組（Wnt10b組），以pYr-1.1-hWnt10b-shRNA-83、pYr-1.1-hWnt10b-shRNA-84、pYr-1.1-hWnt10b-shRNA-87 3個質粒轉染的HEK293細胞為實驗組（分別為83干擾組、84干擾組和87干擾組），分別予以相應處理后行RT-PCR檢測，引物對：Wnt10b-F196：5'-CACTGTCCCGAGGCAAGAG-3'，Wnt10b-R196：5'-TTGTGGATTCGCATTCGTG-3'，GAPDH-F452：5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，GAPDH-R452：5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。
1.1.4 病毒包裝
通過LR體外同源重組將穿梭載體pYr-adshuttle-1-Wnt10b和干擾效果最好的質粒表達框構建至pAd/PL-DEST腺病毒表達載體上，PacⅠ酶切重組腺病毒質粒并轉染HEK293細胞，進行重組腺病毒的擴增，半數組織培養感染劑量法檢測重組腺病毒感染性滴度。
1.2 hBMSCs分離培養
骨髓樣本來源于四川大學華西醫院骨科4例住院患者，研究通過醫院倫理委員會批準，患者均知情同意。其中男3例，女1例；年齡20～40歲。均為因創傷需行取髂骨植骨手術者，術前檢查證實無造血系統及腫瘤等疾患；全麻下手術，取髂骨時使用無菌注射器收集溢出的骨髓液，采用密度梯度離心法獲取hBMSCs，置于完全培養基（含10%FBS的DMEM培養基）中，于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱內培養并傳代，取第4代細胞進行實驗。
1.3 實驗分組及檢測指標
取第4代hBMSCs，以5 × 106個/mL濃度接種于含完全培養基的T-75培養瓶中，當生長達80%融合后，將培養瓶中一部分hBMSCs消化轉移至含載玻片的6孔培養板，行ALP、茜素紅染色和油紅O染色；另一部分細胞行實時熒光定量PCR和Western blot檢測。實驗分為4組，A、B、C組分別加入Wnt10b基因表達腺病毒載體、Wnt10b-shRNA腺病毒載體和空病毒轉染細胞，D組細胞不進行轉染作為空白對照組。
1.3.1 成骨相關檢測
①ALP和茜素紅染色：取各組細胞，加入成骨誘導培養基（含10%FBS、0.1 μmol/L地塞米松、50 μmol/L抗壞血酸、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉的DMEM培養基）培養，7 d后行ALP染色觀察，14 d后行茜素紅染色觀察，并與各組未誘導細胞進行比較。
②實時熒光定量PCR檢測：取成骨誘導后10 d各組細胞，采用實時熒光定量PCR檢測成骨相關基因Runx2、OST、ALP及Ⅰ型膠原的相對表達量，并與未誘導細胞進行比較。RNA提取后，采用隨機引物利用逆轉錄酶逆轉錄成cDNA，采用Revert AidTM Frist Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas公司，加拿大）進行擴增。引物由成都立康科技有限公司提供；反應體系：10 × buffer（Mg2+ free）3 μL、MgCl2（25 mmol/ L）3 μL、dNTP（25 mmol/L）0.36 μL、上游引物（10 μmol/ L）1 μL、下游引物（10 μmol/L）1 μL、Taq酶（5 U/μL）0.3 μL、ddH2O 15.34 μL、cDNA模板5 μL。擴增條件：94℃、2 min；94℃、20 s，56℃、30 s，60℃、40 s，30個循環；72℃延伸5 min。分析繪制擴增動力學曲線，根據動力學曲線確定每個樣品管中熒光強度增加到某一特定閾值時的擴增循環數（Ct值），通過2-ΔΔCt公式計算相對表達量。
③Western blot檢測：取成骨誘導后10 d各組細胞，采用Western blot法檢測成骨相關蛋白ALP、OST表達，并與未誘導細胞進行比較。于冰上裂解提取細胞總蛋白，配置SDS-PAGE膠，將蛋白質轉印至聚偏氟乙烯膜表面，用含10%脫脂奶粉的TBS緩沖液于37℃封閉60 min，加入一抗（1∶500），脫色搖床搖1 h；TBS緩沖液沖洗4次，加入二抗（1∶1 000），脫色搖床搖1 h；TBS緩沖液沖洗4次，用ECL試劑盒進行化學發光檢測，ECL A、B液等體積混合滴于膜上，5 min后暗室壓片、曝光、顯影和定影，并行定量檢測。
1.3.2 成脂相關檢測
①油紅O染色：取各組細胞，加入成脂誘導培養基（含10%FBS、1 μmol/L地塞米松、10 μmol/L胰島素、0.5 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、200 μmol/L吲哚美辛的DMEM培養基）培養，14 d后行油紅O染色，并與各組未誘導細胞進行比較。
②實時熒光定量PCR檢測：取成脂誘導后10 d各組細胞，同1.3.1方法采用實時熒光定量PCR檢測成脂相關基因過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator activated receptor γ，PPARγ）、CCAAT增強子結合蛋白α（CCAAT enhancer binding protein α，C/EBPα）、C/EBPβ、FABP4的相對表達量，并與未誘導細胞進行比較。
③Western blot檢測：取成脂誘導后10 d各組細胞，同1.3.1方法采用Western blot法檢測成脂相關蛋白PPARγ和FABP4表達，并與未誘導細胞進行比較。
1.4 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 病毒載體轉染效率檢測
結果顯示Wnt10b組Wnt10b基因顯著表達，84干擾組和87干擾組Wnt10b基因的表達明顯受到干擾，其中87干擾組即pYr-1.1-hWnt10b-shRNA-87干擾效果最好。見圖 1。所構建病毒滴度為5 × 109 PFU/mL。
圖1
RT-PCR檢測病毒載體轉染效率1：NC組2：HK組3：Wnt10b組4：83干擾組5：84干擾組6：87干擾組
Figure1.
Transfection efficiency of virus vector by RT-PCR detection 1: NC group 2: HK group 3: Wnt10b group 4: 83 interference group 5: 84 interference group 6: 87 interference group
2.2 成骨相關檢測
2.2.1 ALP染色
成骨誘導培養7 d，4組ALP染色均為陽性，其中A組呈強陽性，B組染色最弱（圖 2）；無誘導培養7 d，A組ALP染色呈弱陽性，其余3組均為陰性（圖 3）。
圖2
各組成骨誘導7 d ALP染色（× 200）??A組??B組??C組??D組?圖 3 ?各組無成骨誘導7 d ALP染色（× 200）??A組??B組??C組??D組?圖 4 ?各組成骨誘導14 d茜素紅染色（× 200）??A組??B組??C組??D組?圖 5 ?各組無成骨誘導14 d茜素紅染色（× 200）??A組??B組??C組??D組
Figure2.
ALP staining observation at 7 days after osteogenic induced culture (× 200) ??Group A ??Group B ??Group C ??Group D ?Fig.3 ?ALP staining observation at 7 days after non-induced culture (× 200)??Group A ??Group B ??Group C ??Group DFig.4 ?Alizarin red staining observation at 14 days after osteogenic induced culture (× 200)??Group A ??Group B ??Group C ??Group DFig.5 ?Alizarin red staining observation at 14 days after non-induced culture (× 200)??Group A ??Group B ??Group C ??Group D
2.2.2 茜素紅染色
成骨誘導培養14 d，A組出現大量片狀融合褐色礦化結節，B組見少許點狀褐色礦化結節，C、D組出現大量點狀褐色礦化結節（圖 4）；無誘導培養14 d，A組可見大量點狀褐色礦化結節，C、D組偶見不典型礦化結節，B組幾乎未見礦化結節（圖 5）。
2.2.3 實時熒光定量PCR檢測
成骨誘導培養10 d，A組Runx2、OST、ALP及Ⅰ型膠原mRNA相對表達量均顯著高于B、C、D組，差異有統計學意義（P＜0.05）；除Runx2外，B組OST、ALP及Ⅰ型膠原mRNA相對表達量均顯著低于C、D組，差異有統計學意義（P＜0.05）；C、D組間差異無統計學意義（P＞0.05）。除B組OST、ALP及Ⅰ型膠原相對表達量無誘導培養與成骨誘導培養比較差異無統計學意義（P＞0.05）外，其余各組基因相對表達量成骨誘導培養均高于無誘導培養（P＜0.05）。見圖 6。
圖6
各組成骨誘導及無誘導10 d實時熒光定量PCR檢測各基因表達??Runx2 ??OST ??ALP ??Ⅰ型膠原圖 7 ?各組成骨誘導及無誘導10 d Western blot檢測各蛋白表達1：A組2：B組3：C組4：D組??成骨誘導??無誘導圖 8 ?各組成骨誘導及無誘導10 d Western blot檢測各蛋白表達量??ALP ??OST
Figure6.
Real-time fluorescent quantitative PCR detection for osteoblast genes expressions after osteogenic induced or non-induced culture for 10 days ??Runx2 ??OST ??ALP ??Collagen type I Fig.7 ?Western blot detection for osteoblast proteins expressions after osteogenic induced or non-induced culture for 10 days 1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D ??Osteogenic induced culture ??Non-induced culture Fig.8 ?Western blot detection for osteoblast proteins expressions after osteogenic induced or non-induced culture for 10 days ??ALP ??OST
2.2.4 Western blot檢測
成骨誘導培養10 d，A組ALP和OST蛋白表達量明顯高于其余3組，C、D組高于B組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；C、D組間差異無統計學意義（P＞0.05）。無誘導培養10 d，A組ALP蛋白表達量明顯高于其余3組，C、D組高于B組，差異均有統計學意義（P＜0.05），C、D組間差異無統計學意義（P＞0.05）；A組OST蛋白表達量高于其余3組，C組高于B組，差異均有統計學意義（P＜0.05），B、D組間及C、D組間差異無統計學意義（P＞0.05）。成骨誘導各組ALP和OST蛋白表達量均顯著高于無誘導培養各組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖 7、8。
2.3 成脂相關檢測
2.3.1 油紅O染色
成脂誘導培養14 d，B、C、D組見大量深染紅色區域，呈強陽性表現，其中B組最強；A組散在小團狀著色區，數量較其他組明顯減少（圖 9）。無誘導培養示，B組見較少典型紅色團塊狀著色區，C組見極少小團狀著色區，A、D組呈陰性（圖 10）。
圖9
各組成脂誘導14 d油紅O染色（× 200）??A組??B組??C組??D組圖 10各組無成脂誘導14 d油紅O染色（× 200）??A組??B組??C組??D組
Figure9.
Oil red O staining observation after adipogenic induced culture for 14 days (× 200) ??Group A ??Group B ??Group C ??Group D Fig.10 Oil red O staining observation after non-induced culture for 14 days (× 200) ??Group A ??Group B ??Group C ??Group D
2.3.2 實時熒光定量PCR檢測
成脂誘導培養10 d，A組C/EBPβ、PPARγ、C/EBPα和FABP4 mRNA相對表達量均低于B、C、D組，差異有統計學意義（P＜0.05）；除C/EBPβ外，B組PPARγ、C/EBPα、FABP4 mRNA相對表達量均高于C、D組，差異有統計學意義（P＜0.05）；除FABP4外，C、D組C/EBPβ、PPARγ、C/EBPα mRNA相對表達量比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。無誘導培養10 d，B組PPARγ mRNA相對表達量高于A、C、D組，C、D組高于A組，差異有統計學意義（P＜0.05），C、D組間差異無統計學意義（P＞0.05）；FABP4、C/EBPβ和C/EBPα mRNA相對表達量各組間差異無統計學意義（P＞0.05）。成脂誘導培養各組PPARγ mRNA相對表達量均高于無誘導培養（P＜0.05）；除A組外，B、C、D組FABP4、C/EBPβ和C/EBPα mRNA相對表達量均高于無誘導培養（P＜0.05）。見圖 11。
圖11
各組成脂誘導及無誘導10 d實時熒光定量PCR檢測各基因表達??PPARγ ??C/EBPα ??FABP4 ??C/EBPβ 圖 12 ?各組成脂誘導及無誘導10 d Western blot檢測各蛋白表達1：A組2：B組3：C組4：D組??成脂誘導??無誘導圖 13各組成脂誘導及無誘導10 d Western blot檢測各蛋白表達量??PPARγ ??FABP4
Figure11.
Real-time fluorescent quantitative PCR detection for adipocyte genes expressions after adipogenic induced or non-induced culture for 10 days ??PPARγ ??C/EBPα ??FABP4 ??C/EBPβ Fig.12 Western blot detection for adipocyte proteins expressions after adipogenic induced or non-induced culture for 10 days 1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D ??Adipogenic induced culture ??Non-induced culture Fig.13 Western blot detection for adipocyte proteins expressions after adipogenic induced or non-induced culture for 10 days ??PPARγ ??FABP4
2.3.3 Western blot檢測
成脂誘導培養10 d，B組PPARγ和FABP4蛋白表達量明顯高于其余3組，C、D組高于A組，差異均有統計學意義（P＜0.05），C、D組間差異無統計學意義（P＞0.05）。無誘導培養10 d，B組FABP4蛋白表達量明顯高于其余3組，C、D組高于A組，差異均有統計學意義（P＜0.05），C、D組間差異無統計學意義（P＞0.05）；各組間PPARγ蛋白表達量差異無統計學意義（P＞0.05）。除A組PPARγ外，各組PPARγ和FABP4蛋白表達量成脂誘導培養均高于無誘導培養（P＜0.05）。見圖 12、13。
3 討論
ALP是BMSCs早期成骨分化的重要標志，在細胞外基質礦化過程中有重要作用；茜素紅染色利用沉積的鈣與茜素紅發生顯色反應，呈現紅褐色的染色效果。這兩個檢測結果分別對成骨分化的早期和晚期具有重要意義。油紅O遇到脂滴顯現紅色，其他組織則很少顯色，通過油紅O可很好地判斷成脂分化情況。本實驗上述染色結果顯示：成骨誘導后A組茜素紅染色強陽性，B組則為弱陽性，成脂誘導后油紅O染色則相反。說明Wnt10b表達促進hBMSCs成骨分化，抑制其成脂分化；而Wnt10b表達被干擾，則促進hBMSCs成脂分化，抑制其成骨分化。
本實驗實時熒光定量PCR檢測結果示：成骨誘導培養的成骨轉錄因子Runx2、OST、ALP、Ⅰ型膠原和成脂誘導培養的成脂轉錄因子PPARγ、FABP4、C/EBPα的表達水平明顯高于無誘導培養；其中上述成骨轉錄因子A組表達水平高于D組，成脂轉錄因子表達水平低于D組，B組則與A組相反。說明hBMSCs成骨成脂分化時，相應轉錄因子表達升高，Wnt10b通過改變轉錄因子的表達水平對hBMSCs成骨成脂分化進行調控。這與Bennett等[16]對ST2細胞研究的結果相似，他們通過Wnt10b基因表達逆轉錄病毒轉染ST2細胞的實驗研究認為，Wnt10b基因通過調控多能干細胞自身表達的成骨成脂轉錄因子來決定其分化方向，包括上調成骨因子Twist、Runx2、Dlx5和OST，抑制成脂因子PPARγ、C/EBPα和FABP4。本實驗還發現成骨轉錄因子ALP和Ⅰ型膠原表達的變化也與上述轉錄因子一致。另外，本實驗結果顯示：成脂轉錄因子C/ EBPβ變化不明顯，原因可能是C/EBPβ為hBMSCs成骨成脂分化的早期調節因子[20]，本研究檢測時間相對較晚，其表達水平已下降，因而未出現統計學差異。
Western blot檢測結果示：成骨相關ALP、OST蛋白和成脂相關FABP4和PPARγ蛋白的表達水平檢測結果基本一致，即hBMSCs成骨誘導分化時，成骨相關蛋白的表達A組高于D組，B組低于D組；成脂分化時，成脂相關蛋白的表達則相反。說明hBMSCs成骨成脂分化時Wnt10b正向調控成骨相關ALP、OST蛋白的表達，負向調控成脂相關FABP4和PPARγ蛋白的表達。從而從蛋白水平進一步說明，Wnt10b通過調控成骨成脂轉錄因子和蛋白的表達來實現對hBMSCs成骨成脂分化的調控。
另外，本實驗結果示，在無誘導培養下，A組出現成骨檢測陽性，B組出現成脂檢測陽性，相應D組結果為陰性；并且實時熒光定量PCR和Western blot檢測結果示，無誘導培養下，A組成骨轉錄因子表達高于D組，成脂轉錄因子表達低于D組，B組則相反。提示單純Wnt10b基因表達水平的變化能夠使hBMSCs向成骨成脂方向分化，即Wnt10b高表達能夠始發hBMSCs成骨分化，表達抑制能夠始發hBMCSs成脂分化。但由于hBMSCs在成骨成脂誘導培養下，單純Wnt10b基因表達水平的改變未出現hBMSCs分化方向的逆轉，說明hBMSCs成骨成脂分化的調控還存在其他影響因素，這仍需進一步研究。
