引用本文： 關云, 王琴梅, 陳盈, 滕偉, 黃洪章. 負載BMP-2質粒的脂多糖胺納米囊泡轉染大鼠BMSCs的研究. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(10): 1292-1297. doi: 10.7507/1002-1892.20140279 復制
基因治療是高效修復骨缺損的希望，而基因載體是實現其臨床應用的關鍵因素之一。非病毒載體易于制備及改性，免疫原性低，可結合較大的基因片段[1]，有較大發展前景；但其轉染效率低，一般為35%±10%[2]。為提高非病毒載體的轉染效率，本課題組設計了含聚乙烯亞胺2k（polyethylenimine 2k，PEI 2k；相對分子質量2 × 103）、海藻酸鈉及膽固醇3種成份的刷狀共聚物——脂多糖胺（lipopolysaccharide-amine，LPSA），它能在水中自組裝形成囊泡，克服轉染過程中的系列障礙，提高轉染效率。前期研究表明[3]，LPSA納米囊泡（LPSA nanopolymersomes，LNPs）具有高效胞液遞送能力；在無血清條件下，當LNPs中N元素與質粒DNA中P元素的摩爾比（N/P）為60、DNA濃度為2 μg/mL時，LNPs遞送增強型綠色熒光蛋白報告基因質粒（plasmid of enhanced green fluorescent protein，pEGFP）至大鼠BMSCs的轉染效率高達95%，可與病毒載體相媲美，并表現較低的細胞毒性。BMSCs的分化增殖在骨組織再生中具有重要作用[4]，其可通過自分泌和旁分泌產生各種細胞因子[5]，促進成骨相關細胞在骨缺損區域聚集，誘導成骨細胞的分化和成熟活躍，刺激血管生成。BMP-2蛋白是啟動成骨信號通路重要的調控蛋白，在骨缺損條件下可刺激成骨細胞和軟骨細胞形成骨再生的分化中心，具有促進骨再生潛能[6]。因此，保證骨缺損區域BMP-2蛋白濃度對促進骨再生具有重要意義[7-8]。本研究以BMSCs為靶細胞，以人源性BMP-2質粒（plasmid of BMP-2，pBMP-2）為目的基因，繼續研究LNPs結合、保護及介導pBMP-2轉染BMSCs的能力，并對其表達蛋白進行鑒定，探索該基因傳遞體系聯合干細胞應用于骨缺損修復的前景。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要材料、試劑、儀器
6周齡雄性SD大鼠10只，體重160～180 g，由中山大學實驗動物中心提供。實驗中對動物處置符合動物倫理學要求。
人源性pBMP-2（產品編號：EX-A0241-M61；Gene-Copoeia公司，美國）；LPSA由本實驗室制備[3]；PEI 25k（相對分子質量25 × 103；Sigma公司，美國）；人腎上皮293細胞（中山大學口腔醫學研究所王彥教授惠贈）。
快速濾過法無內毒素質粒大提試劑盒（OMEGA公司，美國）；DMEM/F-12 HEPES培養基、FBS（GIBCO公司，美國）；兔抗人抗BMP-2抗體（Abcam公司，美國）；山羊抗鼠抗肌動蛋白抗體（Cell Signaling公司，美國）；Western blot試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；鼠BMP-2 ELISA試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。倒置相差顯微鏡、熒光倒置顯微鏡（Zeiss公司，德國）；原子力顯微鏡（Park Systems公司，韓國）；透射電鏡（JEOL公司，日本）；紫外分光光度計（Thermo公司，美國）；動態光散射（dynamic light scattering，DLS）儀（Malvern公司，英國）；流式細胞儀（Backman公司，美國）；全自動酶標儀（Tecan公司，德國）。
1.2 質粒構建及提取
人源性pBMP-2是由美國GeneCopoeia公司構建的真核表達質粒，與綠色熒光蛋白基因非融合表達。按快速濾過法無內毒素質粒大提試劑盒說明書提取pBMP-2，并用無菌超純水將其稀釋至40 ng/μL后置于— 80℃儲存備用。
1.3 加載質粒的LNPs（plasmid-loaded LNPs，pLNPs）制備及相關檢測
1.3.1 pLNPs制備
將LPSA溶于無菌超純水中制成1.85 mg/mL溶液，置于4℃冰箱備用。轉染前，根據實驗所需N/P，用超純水將LPSA溶液稀釋成所需濃度，再將其與等體積pBMP-2（40 ng/μL）混合，渦旋3～5 s，室溫靜置30 min后立即使用。
1.3.2 pLNPs凝膠阻滯實驗
分別配制N/P為0（陽性對照）、0.3、0.9、1.5、3.0、4.5、6.0的pLNPs溶液，設置陰性對照PEI 25k/pBMP-2復合物（N/P為2）。配制0.9%瓊脂糖凝膠，110 V電泳0.5 h，通過凝膠電泳分析pLNPs阻滯pBMP-2能力。
1.3.3 pLNPs形貌觀察
配制1 mg/mL、N/P為60[3]的pLNPs溶液，分別用原子力顯微鏡及透射電鏡觀察pLNPs的形貌并測量直徑。原子力顯微鏡采用云母基底，實驗前將云母片浸泡于pLNPs溶液10 min、氮氣吹干后迅速用輕敲工作模式觀察；透射電鏡采用磷鎢酸負染法制樣[3]。
1.3.4 pLNPs粒徑及Zeta電位檢測
配制N/P為60的pLNPs溶液，25℃置于DLS儀下檢測其粒徑及Zeta電位。
1.3.5 pLNPs耐酶解能力實驗
配制N/P為60的pLNPs溶液10 μL，與等體積1 U的DNaseⅠ混合均勻，37℃分別放置1、2、4、6 h后，加入5 μL 100 mmol/ mL EDTA終止酶解反應，繼續水浴10 min，再分別加入10 μL 12 mg/mL肝素，25℃放置2 h置換pBMP-2后，取樣行凝膠電泳分析[9]。設置陽性對照為pLNPs未加DNaseⅠ孵育6 h，陰性對照為pBMP-2加DNaseⅠ孵育15 min。
1.4 pLNPs轉染BMSCs及相關檢測
1.4.1 pLNPs轉染BMSCs
取6周齡雄性SD大鼠，常規分離、培養大鼠BMSCs[10-11]。按1 × 105個/孔接種于24孔板，常規培養至其融合度達70%，小心吸去培養基，PBS洗3次，再按9∶1（v/v）比例分別加入無血清培養基及不同N/P的pLNPs溶液培養4 h。其中pBMP-2終濃度為2 μg/孔，每個N/P設6個復孔。4 h后，用完全培養基（含10%FBS、1%～2%青霉素-鏈霉素的DMEM/F12 HEPES培養基）更換轉染介質，繼續常規孵育44 h后，小心吸去培養基，PBS洗3次，將24孔板置于熒光倒置顯微鏡下觀察孔內是否可見綠色熒光。
1.4.2 pLNPs轉染BMSCs后細胞存活率檢測
用Alamar Blue法[12-13]測定不同N/P pLNPs對BMSCs的毒性。按1.4.1方法，采用N/P分別為35、45、60、75、90、105的pLNPs轉染BMSCs為各實驗組，以PEI 25k/pBMP-2復合物（N/P為10）為對照組。按以下公式計算細胞存活率（n=3）：實驗組存活BMSCs數/對照組存活BMSCs數× 100%；并根據ISO-10993-5標準進行毒性分級。
1.4.3 流式細胞儀檢測轉染效率
分別配制N/P為45、60、75、90的pLNPs，按1.4.1方法轉染BMSCs，胰蛋白酶消化30 s～1 min，4℃以195 × g離心5 min，收集細胞，4%多聚甲醛固定重懸，流式細胞儀檢測細胞表達綠色熒光陽性率（即轉染效率）。設置兩個陽性對照，分別為Lipofectamine 2000及PEI 25k按上述方法轉染并收集BMSCs[3]；以未轉染的BMSCs為陰性對照。
1.5 pLNPs轉染BMSCs表達BMP
1.5.1 BMP-2定性檢測
因BMSCs自身表達BMP-2，為確保BMP-2是由基因轉染而被細胞表達出來，選取人腎上皮293細胞作為轉染靶細胞。按1.4.1方法采用最佳N/P為60的pLNPs轉染人腎上皮293細胞。轉染44 h后收集細胞，置于冰上裂解，取上清液進行Western blot檢測。配制10%SDS-PAGE凝膠、濃縮膠及電泳液，取10 μg樣品及Marker加入上樣孔，80 V電泳30 min后，換110 V電泳1 h。200 mA恒流轉移至聚偏氟乙烯膜上。5%脫脂奶粉TBST緩沖液25℃封閉1 h，TBST洗膜3次，每次5 min；分別加入兔抗人抗BMP-2抗體（1∶250）和山羊抗鼠抗肌動蛋白抗體（1∶500），4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次5 min；分別加入熒光標記二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次5 min。暗室顯色并進行圖像掃描分析。以未轉染細胞作為空白對照。
1.5.2 BMP-2定量檢測
按1.4.1方法采用最佳N/P為60的pLNPs轉染BMSCs（4孔/組），轉染后連續培養4 d，每天取出150 μL培養基后換液。所取樣品置于— 80℃冰箱保存，集齊樣品后，迅速用鼠BMP-2 ELISA試劑盒測定培養液中BMP-2的蛋白含量。以未轉染細胞為陰性對照，PEI 25k和Lipofectamine 2000轉染的細胞為2個陽性對照。
1.6 統計學方法
采用SPSS20.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，方差齊性數據組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；方差不齊數據比較采用秩和檢驗；檢驗水準取雙側α=0.05。
2 結果
2.1 pLNPs相關檢測
2.1.1 pLNPs凝膠阻滯實驗
隨著N/P增加，瓊脂糖凝膠電泳條帶逐漸變弱；當N/P為1.5時，只在上樣孔中見到DNA熒光條帶（圖 1）。提示當N/P≥1.5時，pLNPs可完全阻滯pBMP-2形成pLNPs復合物，pLNPs能高效負載質粒DNA。
圖1
不同N/P條件下pLNPs對pBMP-2的凝膠阻滯實驗1：陽性對照2：陰性對照3：N/P 0.3 4：N/P 0.9 5：N/P 1.5 6：N/P 3.0 7：N/P 4.5 8：N/P 6.0 ?圖 2 ?pLNPs形貌觀察??原子力顯微鏡（× 6 400）??透射電鏡（× 73 k）?圖 3 ?pLNPs耐DNaseⅠ酶解能力檢測1：陽性對照組6 h 2：陰性對照組15 min 3：實驗組1 h 4：實驗組2 h 5：實驗組4 h 6：實驗組6 h 圖 4 ?pLNPs轉染BMSCs后熒光倒置顯微鏡觀察（× 100）??熒光圖片??明場圖片?圖 5 ?各組pLNPs轉染BMSCs后細胞存活率檢測A：對照組B：N/P 35實驗組C：N/P 45實驗組D：N/P 60實驗組E：N/P 75實驗組F：N/P 90實驗組G：N/P 105實驗組?圖 6 ?各組pLNPs轉染BMSCs后轉染效率檢測A：PEI 25k陽性對照組B：Lipofectamin 2000陽性對照組C：N/P 45實驗組D：N/P 60實驗組E：N/P 75實驗組F：N/P 90實驗組?圖 7 ?Western blot檢測BMP-2蛋白表達情況Mr：相對分子質量M：Marker 1：空白對照組2：實驗組
Figure1.
Retardation ability of pLNPs to pBMP-2 with different N/P 1: Positive control 2: Negative control 3: N/P 0.3 4: N/P 0.9 5: N/P 1.5 6: N/P 3.0 7: N/P 4.5 8: N/P 6.0 ?Fig.2 ?Morphology observation of pLNPs ??AFM (× 6 400) ??TEM (× 73 k) ?Fig.3 ?Resistance ability of pLNPs to DNase I 1: Positive control group at 6 hours 2: Negative control group at 15 minutes 3: Experimental group at 1 hour 4: Experimental group at 2 hours 5: Experimental group at 4 hours 6: Experimental group at 6 hours ?Fig.4 ?Inverted fluorescence microscope observation of transfected BMSCs by pLNPs (× 100) ??Fluorescence image ??Bright image ?Fig.5 ?Viability of BMSCs transfected by pLNPs A: Control group B: N/P 35 experimental group C: N/P 45 experimental group D: N/P 60 experimental group E: N/P 75 experimental group F: N/P 90 experimental group G: N/P 105 experimental group ?Fig.6 ?Transfection efficiency of BMSCs transfected by pLNPs A: Plolyethylenmine 25k positive control group B: Lipofectamine 2000 positive control group C: N/P 45 experimental group D: N/P 60 experimental group E: N/P 75 experimental group F: N/P 90 experimental group ?Fig.7 ?BMP-2 protein expression by Western blot detection Mr: Relative molecular mass M: Marker 1: Blank control group 2: Experimental group
2.1.2 pLNPs形貌觀察
原子力顯微鏡觀察示pLNPs顆粒較均勻，分散性良好。透射電鏡觀察示pLNPs呈典型的類球形空心囊泡狀，直徑為（72.07±11.03）nm。見圖 2。
2.1.3 pLNPs粒徑及Zeta電位檢測
DLS儀檢測示，pLNPs粒徑為（123±6）nm，Zeta電位為20 mV。
2.1.4 pLNPs耐酶解能力實驗
陽性對照組孵育6 h仍可見清晰條帶；陰性對照組孵育15 min可見泳道被DNaseⅠ降解的DNA片段泳出；實驗組4 h內電泳條帶亮度無明顯變化，6 h時電泳條帶亮度稍減弱。見圖 3。
2.2 pLNPs轉染BMSCs及相關檢測
2.2.1 熒光倒置顯微鏡觀察
pLNPs轉染BMSCs后，可見綠色熒光表達，呈長梭形細胞輪廓；轉染后的BMSCs輪廓清晰、形態飽滿、折光率高。見圖 4。
2.2.2 pLNPs轉染BMSCs后細胞存活率檢測
各實驗組的細胞存活率隨N/P增加呈先增加后降低趨勢，在N/P為45時達最大值；除N/P為105的實驗組外，其余各實驗組細胞存活率均高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖 5。當N/P≤90時，pLNPs轉染BMSCs存活率均高于85%，根據ISO-10993-5標準，細胞毒性分級為1級，可用于體內實驗。
2.2.3 流式細胞儀檢測轉染效率
各實驗組pLNPs轉染效率隨N/P增加而增大，當N/P≥60時，轉染效率進入平臺期，因此最佳N/P為60。各實驗組轉染效率均顯著高于2個陽性對照組，其中與PEI 25k陽性對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖 6。
2.3 pLNPs轉染BMSCs表達BMP-2實驗
2.3.1 BMP-2定性檢測
Western blot檢測示，空白對照組及實驗組在（42～43）× 103處均可見綠色β-actin內參條帶；實驗組在44 × 103及55 × 103處可見紅色BMP-2條帶，部分與內參條帶相重疊。見圖 7。
2.3.2 BMP-2定量檢測
ELISA檢測示，轉染后1 d實驗組即大量表達BMP-2，2 d達峰值，之后稍有下降，4 d內BMP-2表達量變化不大。轉染后各時間點實驗組BMP-2表達量顯著高于其余3組，其中與Lipofectamine 2000陽性對照組和陰性對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖 8。2 d時，實驗組、Lipofectamine 2000陽性對照組和PEI 25k陽性對照組BMP-2表達量分別為陰性對照組的4.70、1.25及1.21倍，實驗組BMP-2表達量為Lipofectamine 2000陽性對照組和PEI 25k陽性對照組的3.76倍和3.88倍。
圖8
ELISA檢測各組BMP-2蛋白表達
Figure8.
BMP-2 protein expression by ELISA detection
3 討論
為了獲得安全高效的基因載體，我們設計合成了新型陽離子聚合物——LPSA，它是一種雙親（親水性和親脂性）、雙性（酸堿兼性）的可降解刷狀共聚物，含有3種安全、能促進基因轉染效率的功能性成份：親水性帶負電荷的海藻酸鈉、帶正電荷的PEI 2k及疏水的膽固醇，其中可降解的海藻酸鈉為主鏈，膽固醇接枝的PEI為側鏈[3]。前期研究表明，該聚合物可直接在水中自組裝形成納米囊泡，囊泡的內外親水表面為帶正電荷的PEI，囊泡壁為疏水的膽固醇及由PEI和海藻酸鈉通過靜電相互作用形成的不溶于水的聚電解質間復合物。以LNPs作為基因載體遞送pEGFP至BMSCs時，能獲得高于95%的轉染效率[3]，遠高于其他非病毒載體的文獻報道值（最大74%）[14]，預示了LNPs作為基因載體的應用前景。基于此，本研究構建了以pBMP-2為靶基因、BMSCs為靶細胞、LNPs為載體的基因遞送系統，研究了LNPs結合、保護pBMP-2的能力，pLNPs的細胞毒性以及體外轉染情況。
首先，作為基因載體，LNPs必須能結合、壓縮和保護基因。由于LNPs外表面為PEI，它含有大量帶正電荷的氨基基團，可通過靜電作用與負電性的堿基結合。凝膠阻滯實驗表明，當N/P為1.5時，pLNPs可完全阻滯pBMP-2，說明pLNPs具有良好的壓縮復合質粒DNA的能力。理論上，樣本中pBMP-2的量一樣，被完全阻滯后，上樣孔中pBMP-2的亮度應一致。但本研究結果顯示，N/P≥1.5時，阻滯在上樣孔中的條帶亮度逐漸減弱，推測可能是因為N/P增加導致形成的pLNPs/pBMP-2復合物結構更致密，阻止了部分溴乙啶染料分子接近并鍵合至pBMP-2上。進一步提示pLNPs具有結合、保護pBMP-2的能力。pLNPs的Zeta電位為20 mV，其外表面帶正電荷，利于轉染時在帶負電荷的細胞表面黏附。原子力顯微鏡及透射電鏡觀察可見pLNPs能將pBMP-2壓縮形成粒徑為（72.07±11.03）nm的囊泡。值得注意的是，通過DLS儀測得的粒徑為（123±6）nm，大于透射電鏡測得粒徑，這是由于透射電鏡觀察必須在高真空、無水條件下進行，此時囊泡核心及表面的水分蒸發而導致囊泡塌陷和皺縮；而后者則是粒子在水溶液中的動力學直徑，因此后者更接近轉染時粒子的實際尺寸。在模擬體內轉染遞送目的基因的過程中，復合物將面臨體內各種水解酶的消化作用。通過耐酶解實驗表明，pLNPs在4 h內對pBMP-2具有良好的保護作用，6 h時這種保護作用稍下降，說明pLNPs能較好地保護pBMP-2耐核酸酶的降解，預示了其體內轉染的可行性。
基因載體的安全性是決定其能否應用于臨床的第一要素。本研究中，細胞毒性實驗結果顯示，N/P為35～105范圍內，經pLNPs轉染的BMSCs存活率均＞75%，符合生物材料體內應用的ISO標準。LNPs的低細胞毒性源于其可降解性、各嵌段良好的生物相容性及囊泡的形成。研究認為，陽離子聚合物和陰離子細胞膜之間的相互作用，及隨后在細胞膜表面形成的陽離子聚合物的簇狀聚集影響了細胞膜功能，進而導致了即刻細胞毒性[15-16]。生物相容性良好的天然陰離子多糖海藻酸鈉和天然細胞膜脂膽固醇的引入，提高了LNPs的生物相容性，降低了其陽離子密度，同時還能通過膽固醇受體介導的內吞途徑促進LNPs被快速胞吞[17-21]，避免了LNPs在細胞膜表面的聚集，因而降低了LNPs的細胞毒性。LNPs和負電性的pBMP-2形成復合物后，陽離子密度進一步降低，因此細胞毒性進一步減少。此外，囊泡的形成也可能提高載體的生物相容性。一方面囊泡類似于生物膜的結構可能使其和細胞具有天然相容性，另一方面囊泡的穩定性也避免了它在細胞膜表面形成簇狀聚集體。最后，pLNPs進入細胞后，由于LNPs可降解且降解產物可代謝[3]，從而避免了轉染后載體在細胞內、體內的滯留及聚集而導致的長期毒性。
作為基因載體，LNPs還必須具有遞送治療基因并使細胞高效表達目標蛋白的能力。本研究體外轉染實驗結果表明，轉染后的人腎上皮293細胞確實能表達BMP-2；經轉染（最佳N/P為60）處理后，約91.4%的BMSCs能表達目標蛋白，且BMP-2表達量為陰性對照組的4.70倍，為PEI 25k和Lipofectamin 2000陽性對照組的3.88倍和3.76倍，說明LNPs能高效遞送基因至BMSCs，并至少4 d內持續高效表達BMP-2蛋白，與流式細胞儀測定的轉染效率結果一致。LNPs的高轉染效率同樣源于三嵌段及囊泡的協同作用，它幫助載體克服了轉染過程中的系列障礙。首先囊泡外表面帶正電荷的PEI不僅使LNPs能高效負載基因，還能通過靜電相互作用迅速靶向至帶負電的細胞膜表面，再通過受體介導的膽固醇內吞路徑而迅速被細胞胞吞；隨后利用PEI的質子海綿效應、海藻酸鈉的質子緩沖能力（酸性條件下海藻酸鈉的羧基質子化）[17]及膽固醇的膜脂融合能力快速實現LNPs的內體逃逸；最后LNPs降解被代謝出細胞外，而基因則被釋放并入核表達[3]。
此外，研究基因載體轉染時，大部分研究選擇的靶細胞為腫瘤細胞或細胞株，較少關于干細胞轉染的研究。眾所周知，腫瘤細胞或細胞株較干細胞更易轉染，并且對不良環境具有更好的耐受性。考慮到BMSCs在骨組織再生中的重要作用，本實驗的干細胞毒性評價和基因轉染結果對LNPs將來的臨床應用具有重要指導意義。
基因治療是高效修復骨缺損的希望，而基因載體是實現其臨床應用的關鍵因素之一。非病毒載體易于制備及改性，免疫原性低，可結合較大的基因片段[1]，有較大發展前景；但其轉染效率低，一般為35%±10%[2]。為提高非病毒載體的轉染效率，本課題組設計了含聚乙烯亞胺2k（polyethylenimine 2k，PEI 2k；相對分子質量2 × 103）、海藻酸鈉及膽固醇3種成份的刷狀共聚物——脂多糖胺（lipopolysaccharide-amine，LPSA），它能在水中自組裝形成囊泡，克服轉染過程中的系列障礙，提高轉染效率。前期研究表明[3]，LPSA納米囊泡（LPSA nanopolymersomes，LNPs）具有高效胞液遞送能力；在無血清條件下，當LNPs中N元素與質粒DNA中P元素的摩爾比（N/P）為60、DNA濃度為2 μg/mL時，LNPs遞送增強型綠色熒光蛋白報告基因質粒（plasmid of enhanced green fluorescent protein，pEGFP）至大鼠BMSCs的轉染效率高達95%，可與病毒載體相媲美，并表現較低的細胞毒性。BMSCs的分化增殖在骨組織再生中具有重要作用[4]，其可通過自分泌和旁分泌產生各種細胞因子[5]，促進成骨相關細胞在骨缺損區域聚集，誘導成骨細胞的分化和成熟活躍，刺激血管生成。BMP-2蛋白是啟動成骨信號通路重要的調控蛋白，在骨缺損條件下可刺激成骨細胞和軟骨細胞形成骨再生的分化中心，具有促進骨再生潛能[6]。因此，保證骨缺損區域BMP-2蛋白濃度對促進骨再生具有重要意義[7-8]。本研究以BMSCs為靶細胞，以人源性BMP-2質粒（plasmid of BMP-2，pBMP-2）為目的基因，繼續研究LNPs結合、保護及介導pBMP-2轉染BMSCs的能力，并對其表達蛋白進行鑒定，探索該基因傳遞體系聯合干細胞應用于骨缺損修復的前景。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要材料、試劑、儀器
6周齡雄性SD大鼠10只，體重160～180 g，由中山大學實驗動物中心提供。實驗中對動物處置符合動物倫理學要求。
人源性pBMP-2（產品編號：EX-A0241-M61；Gene-Copoeia公司，美國）；LPSA由本實驗室制備[3]；PEI 25k（相對分子質量25 × 103；Sigma公司，美國）；人腎上皮293細胞（中山大學口腔醫學研究所王彥教授惠贈）。
快速濾過法無內毒素質粒大提試劑盒（OMEGA公司，美國）；DMEM/F-12 HEPES培養基、FBS（GIBCO公司，美國）；兔抗人抗BMP-2抗體（Abcam公司，美國）；山羊抗鼠抗肌動蛋白抗體（Cell Signaling公司，美國）；Western blot試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；鼠BMP-2 ELISA試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。倒置相差顯微鏡、熒光倒置顯微鏡（Zeiss公司，德國）；原子力顯微鏡（Park Systems公司，韓國）；透射電鏡（JEOL公司，日本）；紫外分光光度計（Thermo公司，美國）；動態光散射（dynamic light scattering，DLS）儀（Malvern公司，英國）；流式細胞儀（Backman公司，美國）；全自動酶標儀（Tecan公司，德國）。
1.2 質粒構建及提取
人源性pBMP-2是由美國GeneCopoeia公司構建的真核表達質粒，與綠色熒光蛋白基因非融合表達。按快速濾過法無內毒素質粒大提試劑盒說明書提取pBMP-2，并用無菌超純水將其稀釋至40 ng/μL后置于— 80℃儲存備用。
1.3 加載質粒的LNPs（plasmid-loaded LNPs，pLNPs）制備及相關檢測
1.3.1 pLNPs制備
將LPSA溶于無菌超純水中制成1.85 mg/mL溶液，置于4℃冰箱備用。轉染前，根據實驗所需N/P，用超純水將LPSA溶液稀釋成所需濃度，再將其與等體積pBMP-2（40 ng/μL）混合，渦旋3～5 s，室溫靜置30 min后立即使用。
1.3.2 pLNPs凝膠阻滯實驗
分別配制N/P為0（陽性對照）、0.3、0.9、1.5、3.0、4.5、6.0的pLNPs溶液，設置陰性對照PEI 25k/pBMP-2復合物（N/P為2）。配制0.9%瓊脂糖凝膠，110 V電泳0.5 h，通過凝膠電泳分析pLNPs阻滯pBMP-2能力。
1.3.3 pLNPs形貌觀察
配制1 mg/mL、N/P為60[3]的pLNPs溶液，分別用原子力顯微鏡及透射電鏡觀察pLNPs的形貌并測量直徑。原子力顯微鏡采用云母基底，實驗前將云母片浸泡于pLNPs溶液10 min、氮氣吹干后迅速用輕敲工作模式觀察；透射電鏡采用磷鎢酸負染法制樣[3]。
1.3.4 pLNPs粒徑及Zeta電位檢測
配制N/P為60的pLNPs溶液，25℃置于DLS儀下檢測其粒徑及Zeta電位。
1.3.5 pLNPs耐酶解能力實驗
配制N/P為60的pLNPs溶液10 μL，與等體積1 U的DNaseⅠ混合均勻，37℃分別放置1、2、4、6 h后，加入5 μL 100 mmol/ mL EDTA終止酶解反應，繼續水浴10 min，再分別加入10 μL 12 mg/mL肝素，25℃放置2 h置換pBMP-2后，取樣行凝膠電泳分析[9]。設置陽性對照為pLNPs未加DNaseⅠ孵育6 h，陰性對照為pBMP-2加DNaseⅠ孵育15 min。
1.4 pLNPs轉染BMSCs及相關檢測
1.4.1 pLNPs轉染BMSCs
取6周齡雄性SD大鼠，常規分離、培養大鼠BMSCs[10-11]。按1 × 105個/孔接種于24孔板，常規培養至其融合度達70%，小心吸去培養基，PBS洗3次，再按9∶1（v/v）比例分別加入無血清培養基及不同N/P的pLNPs溶液培養4 h。其中pBMP-2終濃度為2 μg/孔，每個N/P設6個復孔。4 h后，用完全培養基（含10%FBS、1%～2%青霉素-鏈霉素的DMEM/F12 HEPES培養基）更換轉染介質，繼續常規孵育44 h后，小心吸去培養基，PBS洗3次，將24孔板置于熒光倒置顯微鏡下觀察孔內是否可見綠色熒光。
1.4.2 pLNPs轉染BMSCs后細胞存活率檢測
用Alamar Blue法[12-13]測定不同N/P pLNPs對BMSCs的毒性。按1.4.1方法，采用N/P分別為35、45、60、75、90、105的pLNPs轉染BMSCs為各實驗組，以PEI 25k/pBMP-2復合物（N/P為10）為對照組。按以下公式計算細胞存活率（n=3）：實驗組存活BMSCs數/對照組存活BMSCs數× 100%；并根據ISO-10993-5標準進行毒性分級。
1.4.3 流式細胞儀檢測轉染效率
分別配制N/P為45、60、75、90的pLNPs，按1.4.1方法轉染BMSCs，胰蛋白酶消化30 s～1 min，4℃以195 × g離心5 min，收集細胞，4%多聚甲醛固定重懸，流式細胞儀檢測細胞表達綠色熒光陽性率（即轉染效率）。設置兩個陽性對照，分別為Lipofectamine 2000及PEI 25k按上述方法轉染并收集BMSCs[3]；以未轉染的BMSCs為陰性對照。
1.5 pLNPs轉染BMSCs表達BMP
1.5.1 BMP-2定性檢測
因BMSCs自身表達BMP-2，為確保BMP-2是由基因轉染而被細胞表達出來，選取人腎上皮293細胞作為轉染靶細胞。按1.4.1方法采用最佳N/P為60的pLNPs轉染人腎上皮293細胞。轉染44 h后收集細胞，置于冰上裂解，取上清液進行Western blot檢測。配制10%SDS-PAGE凝膠、濃縮膠及電泳液，取10 μg樣品及Marker加入上樣孔，80 V電泳30 min后，換110 V電泳1 h。200 mA恒流轉移至聚偏氟乙烯膜上。5%脫脂奶粉TBST緩沖液25℃封閉1 h，TBST洗膜3次，每次5 min；分別加入兔抗人抗BMP-2抗體（1∶250）和山羊抗鼠抗肌動蛋白抗體（1∶500），4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次5 min；分別加入熒光標記二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次5 min。暗室顯色并進行圖像掃描分析。以未轉染細胞作為空白對照。
1.5.2 BMP-2定量檢測
按1.4.1方法采用最佳N/P為60的pLNPs轉染BMSCs（4孔/組），轉染后連續培養4 d，每天取出150 μL培養基后換液。所取樣品置于— 80℃冰箱保存，集齊樣品后，迅速用鼠BMP-2 ELISA試劑盒測定培養液中BMP-2的蛋白含量。以未轉染細胞為陰性對照，PEI 25k和Lipofectamine 2000轉染的細胞為2個陽性對照。
1.6 統計學方法
采用SPSS20.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，方差齊性數據組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；方差不齊數據比較采用秩和檢驗；檢驗水準取雙側α=0.05。
2 結果
2.1 pLNPs相關檢測
2.1.1 pLNPs凝膠阻滯實驗
隨著N/P增加，瓊脂糖凝膠電泳條帶逐漸變弱；當N/P為1.5時，只在上樣孔中見到DNA熒光條帶（圖 1）。提示當N/P≥1.5時，pLNPs可完全阻滯pBMP-2形成pLNPs復合物，pLNPs能高效負載質粒DNA。
圖1
不同N/P條件下pLNPs對pBMP-2的凝膠阻滯實驗1：陽性對照2：陰性對照3：N/P 0.3 4：N/P 0.9 5：N/P 1.5 6：N/P 3.0 7：N/P 4.5 8：N/P 6.0 ?圖 2 ?pLNPs形貌觀察??原子力顯微鏡（× 6 400）??透射電鏡（× 73 k）?圖 3 ?pLNPs耐DNaseⅠ酶解能力檢測1：陽性對照組6 h 2：陰性對照組15 min 3：實驗組1 h 4：實驗組2 h 5：實驗組4 h 6：實驗組6 h 圖 4 ?pLNPs轉染BMSCs后熒光倒置顯微鏡觀察（× 100）??熒光圖片??明場圖片?圖 5 ?各組pLNPs轉染BMSCs后細胞存活率檢測A：對照組B：N/P 35實驗組C：N/P 45實驗組D：N/P 60實驗組E：N/P 75實驗組F：N/P 90實驗組G：N/P 105實驗組?圖 6 ?各組pLNPs轉染BMSCs后轉染效率檢測A：PEI 25k陽性對照組B：Lipofectamin 2000陽性對照組C：N/P 45實驗組D：N/P 60實驗組E：N/P 75實驗組F：N/P 90實驗組?圖 7 ?Western blot檢測BMP-2蛋白表達情況Mr：相對分子質量M：Marker 1：空白對照組2：實驗組
Figure1.
Retardation ability of pLNPs to pBMP-2 with different N/P 1: Positive control 2: Negative control 3: N/P 0.3 4: N/P 0.9 5: N/P 1.5 6: N/P 3.0 7: N/P 4.5 8: N/P 6.0 ?Fig.2 ?Morphology observation of pLNPs ??AFM (× 6 400) ??TEM (× 73 k) ?Fig.3 ?Resistance ability of pLNPs to DNase I 1: Positive control group at 6 hours 2: Negative control group at 15 minutes 3: Experimental group at 1 hour 4: Experimental group at 2 hours 5: Experimental group at 4 hours 6: Experimental group at 6 hours ?Fig.4 ?Inverted fluorescence microscope observation of transfected BMSCs by pLNPs (× 100) ??Fluorescence image ??Bright image ?Fig.5 ?Viability of BMSCs transfected by pLNPs A: Control group B: N/P 35 experimental group C: N/P 45 experimental group D: N/P 60 experimental group E: N/P 75 experimental group F: N/P 90 experimental group G: N/P 105 experimental group ?Fig.6 ?Transfection efficiency of BMSCs transfected by pLNPs A: Plolyethylenmine 25k positive control group B: Lipofectamine 2000 positive control group C: N/P 45 experimental group D: N/P 60 experimental group E: N/P 75 experimental group F: N/P 90 experimental group ?Fig.7 ?BMP-2 protein expression by Western blot detection Mr: Relative molecular mass M: Marker 1: Blank control group 2: Experimental group
2.1.2 pLNPs形貌觀察
原子力顯微鏡觀察示pLNPs顆粒較均勻，分散性良好。透射電鏡觀察示pLNPs呈典型的類球形空心囊泡狀，直徑為（72.07±11.03）nm。見圖 2。
2.1.3 pLNPs粒徑及Zeta電位檢測
DLS儀檢測示，pLNPs粒徑為（123±6）nm，Zeta電位為20 mV。
2.1.4 pLNPs耐酶解能力實驗
陽性對照組孵育6 h仍可見清晰條帶；陰性對照組孵育15 min可見泳道被DNaseⅠ降解的DNA片段泳出；實驗組4 h內電泳條帶亮度無明顯變化，6 h時電泳條帶亮度稍減弱。見圖 3。
2.2 pLNPs轉染BMSCs及相關檢測
2.2.1 熒光倒置顯微鏡觀察
pLNPs轉染BMSCs后，可見綠色熒光表達，呈長梭形細胞輪廓；轉染后的BMSCs輪廓清晰、形態飽滿、折光率高。見圖 4。
2.2.2 pLNPs轉染BMSCs后細胞存活率檢測
各實驗組的細胞存活率隨N/P增加呈先增加后降低趨勢，在N/P為45時達最大值；除N/P為105的實驗組外，其余各實驗組細胞存活率均高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖 5。當N/P≤90時，pLNPs轉染BMSCs存活率均高于85%，根據ISO-10993-5標準，細胞毒性分級為1級，可用于體內實驗。
2.2.3 流式細胞儀檢測轉染效率
各實驗組pLNPs轉染效率隨N/P增加而增大，當N/P≥60時，轉染效率進入平臺期，因此最佳N/P為60。各實驗組轉染效率均顯著高于2個陽性對照組，其中與PEI 25k陽性對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖 6。
2.3 pLNPs轉染BMSCs表達BMP-2實驗
2.3.1 BMP-2定性檢測
Western blot檢測示，空白對照組及實驗組在（42～43）× 103處均可見綠色β-actin內參條帶；實驗組在44 × 103及55 × 103處可見紅色BMP-2條帶，部分與內參條帶相重疊。見圖 7。
2.3.2 BMP-2定量檢測
ELISA檢測示，轉染后1 d實驗組即大量表達BMP-2，2 d達峰值，之后稍有下降，4 d內BMP-2表達量變化不大。轉染后各時間點實驗組BMP-2表達量顯著高于其余3組，其中與Lipofectamine 2000陽性對照組和陰性對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖 8。2 d時，實驗組、Lipofectamine 2000陽性對照組和PEI 25k陽性對照組BMP-2表達量分別為陰性對照組的4.70、1.25及1.21倍，實驗組BMP-2表達量為Lipofectamine 2000陽性對照組和PEI 25k陽性對照組的3.76倍和3.88倍。
圖8
ELISA檢測各組BMP-2蛋白表達
Figure8.
BMP-2 protein expression by ELISA detection
3 討論
為了獲得安全高效的基因載體，我們設計合成了新型陽離子聚合物——LPSA，它是一種雙親（親水性和親脂性）、雙性（酸堿兼性）的可降解刷狀共聚物，含有3種安全、能促進基因轉染效率的功能性成份：親水性帶負電荷的海藻酸鈉、帶正電荷的PEI 2k及疏水的膽固醇，其中可降解的海藻酸鈉為主鏈，膽固醇接枝的PEI為側鏈[3]。前期研究表明，該聚合物可直接在水中自組裝形成納米囊泡，囊泡的內外親水表面為帶正電荷的PEI，囊泡壁為疏水的膽固醇及由PEI和海藻酸鈉通過靜電相互作用形成的不溶于水的聚電解質間復合物。以LNPs作為基因載體遞送pEGFP至BMSCs時，能獲得高于95%的轉染效率[3]，遠高于其他非病毒載體的文獻報道值（最大74%）[14]，預示了LNPs作為基因載體的應用前景。基于此，本研究構建了以pBMP-2為靶基因、BMSCs為靶細胞、LNPs為載體的基因遞送系統，研究了LNPs結合、保護pBMP-2的能力，pLNPs的細胞毒性以及體外轉染情況。
首先，作為基因載體，LNPs必須能結合、壓縮和保護基因。由于LNPs外表面為PEI，它含有大量帶正電荷的氨基基團，可通過靜電作用與負電性的堿基結合。凝膠阻滯實驗表明，當N/P為1.5時，pLNPs可完全阻滯pBMP-2，說明pLNPs具有良好的壓縮復合質粒DNA的能力。理論上，樣本中pBMP-2的量一樣，被完全阻滯后，上樣孔中pBMP-2的亮度應一致。但本研究結果顯示，N/P≥1.5時，阻滯在上樣孔中的條帶亮度逐漸減弱，推測可能是因為N/P增加導致形成的pLNPs/pBMP-2復合物結構更致密，阻止了部分溴乙啶染料分子接近并鍵合至pBMP-2上。進一步提示pLNPs具有結合、保護pBMP-2的能力。pLNPs的Zeta電位為20 mV，其外表面帶正電荷，利于轉染時在帶負電荷的細胞表面黏附。原子力顯微鏡及透射電鏡觀察可見pLNPs能將pBMP-2壓縮形成粒徑為（72.07±11.03）nm的囊泡。值得注意的是，通過DLS儀測得的粒徑為（123±6）nm，大于透射電鏡測得粒徑，這是由于透射電鏡觀察必須在高真空、無水條件下進行，此時囊泡核心及表面的水分蒸發而導致囊泡塌陷和皺縮；而后者則是粒子在水溶液中的動力學直徑，因此后者更接近轉染時粒子的實際尺寸。在模擬體內轉染遞送目的基因的過程中，復合物將面臨體內各種水解酶的消化作用。通過耐酶解實驗表明，pLNPs在4 h內對pBMP-2具有良好的保護作用，6 h時這種保護作用稍下降，說明pLNPs能較好地保護pBMP-2耐核酸酶的降解，預示了其體內轉染的可行性。
基因載體的安全性是決定其能否應用于臨床的第一要素。本研究中，細胞毒性實驗結果顯示，N/P為35～105范圍內，經pLNPs轉染的BMSCs存活率均＞75%，符合生物材料體內應用的ISO標準。LNPs的低細胞毒性源于其可降解性、各嵌段良好的生物相容性及囊泡的形成。研究認為，陽離子聚合物和陰離子細胞膜之間的相互作用，及隨后在細胞膜表面形成的陽離子聚合物的簇狀聚集影響了細胞膜功能，進而導致了即刻細胞毒性[15-16]。生物相容性良好的天然陰離子多糖海藻酸鈉和天然細胞膜脂膽固醇的引入，提高了LNPs的生物相容性，降低了其陽離子密度，同時還能通過膽固醇受體介導的內吞途徑促進LNPs被快速胞吞[17-21]，避免了LNPs在細胞膜表面的聚集，因而降低了LNPs的細胞毒性。LNPs和負電性的pBMP-2形成復合物后，陽離子密度進一步降低，因此細胞毒性進一步減少。此外，囊泡的形成也可能提高載體的生物相容性。一方面囊泡類似于生物膜的結構可能使其和細胞具有天然相容性，另一方面囊泡的穩定性也避免了它在細胞膜表面形成簇狀聚集體。最后，pLNPs進入細胞后，由于LNPs可降解且降解產物可代謝[3]，從而避免了轉染后載體在細胞內、體內的滯留及聚集而導致的長期毒性。
作為基因載體，LNPs還必須具有遞送治療基因并使細胞高效表達目標蛋白的能力。本研究體外轉染實驗結果表明，轉染后的人腎上皮293細胞確實能表達BMP-2；經轉染（最佳N/P為60）處理后，約91.4%的BMSCs能表達目標蛋白，且BMP-2表達量為陰性對照組的4.70倍，為PEI 25k和Lipofectamin 2000陽性對照組的3.88倍和3.76倍，說明LNPs能高效遞送基因至BMSCs，并至少4 d內持續高效表達BMP-2蛋白，與流式細胞儀測定的轉染效率結果一致。LNPs的高轉染效率同樣源于三嵌段及囊泡的協同作用，它幫助載體克服了轉染過程中的系列障礙。首先囊泡外表面帶正電荷的PEI不僅使LNPs能高效負載基因，還能通過靜電相互作用迅速靶向至帶負電的細胞膜表面，再通過受體介導的膽固醇內吞路徑而迅速被細胞胞吞；隨后利用PEI的質子海綿效應、海藻酸鈉的質子緩沖能力（酸性條件下海藻酸鈉的羧基質子化）[17]及膽固醇的膜脂融合能力快速實現LNPs的內體逃逸；最后LNPs降解被代謝出細胞外，而基因則被釋放并入核表達[3]。
此外，研究基因載體轉染時，大部分研究選擇的靶細胞為腫瘤細胞或細胞株，較少關于干細胞轉染的研究。眾所周知，腫瘤細胞或細胞株較干細胞更易轉染，并且對不良環境具有更好的耐受性。考慮到BMSCs在骨組織再生中的重要作用，本實驗的干細胞毒性評價和基因轉染結果對LNPs將來的臨床應用具有重要指導意義。
