目的探討腫瘤轉移相關基因-1（MTA1）和血管內皮生長因子-C（VEGF-C）在食管鱗癌（ESCC）中表達及其與淋巴管生成的關系。 方法收集2013年3月至2014年1月遂寧市中心醫院胸心外科107例ESCC手術切除病例及56例正常食管組織的石蠟包埋組織樣本，采用免疫組織化學方法分別檢測MTA1、VEGF-C在ESCC中的表達；應用D2-40標記腫瘤組織中的微淋巴管內皮細胞，并計數微淋巴管密度（LVD）；同時對其與臨床病理參數的關系進行統計學分析。 結果ESCC中MTA1蛋白高表達率為50.4%，VEGF-C蛋白高表達率為58.8%，均明顯高于正常食管組織，差異有統計學意義（P<0.05）。T3/T4期ESCC組中MTA1 蛋白、VEGF-C 蛋白的高表達率亦明顯高于T1/T2組，差異有統計學意義（P<0.05）；MTA1 蛋白、VEGF-C 蛋白的高表達率在ESCC不同TNM分期中，經Kruskal-Wallis Test 檢驗，差異均有統計學意義（P<0.05））；ESCC中MTA1 蛋白、VEGF-C蛋白表達強度存在正相關性（Spearman系數r=0.512，P=0.000），且MTA1 蛋白、VEGF-C蛋白高表達組中LVD與MTA1蛋白、VEGF-C蛋白低表達組差異有統計學意義（P<0.05）；淋巴結轉移組中MTA1 蛋白、VEGF-C蛋白的高表達率與無淋巴結轉移組差異有統計學意義（P<0.05）。 結論ESCC中MTA1 和VEGF-C的表達存在正相關性，其可能共同促進ESCC淋巴管生成及淋巴結轉移，兩者可能作為判斷ESCC預后的實驗室指標。
非小細胞肺癌對表皮生長因子受體-酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKIs）的耐藥問題已成為研究的熱點。最近研究發現EGFR和COX-2信號通路之間存在著復雜的相互聯系和作用，抑制COX-2信號通路能否提高EGFR-TKIs的治療效果成為目前的熱點。本文以此為基礎，全面介紹聯合抑制COX-2與EGFR信號通路在晚期非小細胞肺癌治療中應用的研究進展。
目的 系統評價表皮細胞因子（epidermal growth factor, EGF） 基因61A/G多態性與食管癌風險的相關性。方法 計算機檢索PubMed、EMbase、CJFD、CBM、CNKI、VIP及WanFang Data，檢索時限從建庫至2013年1月1日，收集關于EGF基因61A/G多態性與食管癌發病風險的病例-對照研究。由2位評價者按照納入和排除標準獨立選擇文獻、提取資料和評價質量后，采用RevMan 5.1和Stata 12.0軟件進行Meta分析。結果 共納入6個病例-對照研究，1 448例食管癌患者和1 728例健康對照人群。Meta分析結果顯示，EGF基因61A/G多態性與食管癌風險的相關性無統計學意義：顯性遺傳模型［AG+GG vs. AA：OR=1.22，95%CI（0.91，1.65）］；隱性遺傳模型［GG vs. AG+AA：OR=1.35，95%CI（0.94，1.94）；AG vs. AA：OR=1.12，95%CI（0.93，1.35）；GG vs. AA：OR=1.43，95%CI（0.83，2.47）］。基于人種的亞組分析顯示，EGF基因61A/G多態性可增加白種人罹患食管癌的風險：顯性遺傳模型［AG+GG vs. AA：OR=1.39，95%CI（1.14，1.71）］；隱性遺傳模型［GG vs. AG+AA：OR=1.75，95%CI（1.37，2.25）；GG vs. AA：OR=1.93，95%CI（1.47，2.55）］。但與亞洲人群食管癌風險無明顯相關。結論 基于目前研究結果，可以認為EGF基因61A/G多態性與食管癌易感性無明顯相關性，而EGF基因61A/G多態性可能增加白種人罹患食管癌風險。受納入研究的數量和質量限制，以上結論需要大樣本研究進行驗證。
目的 探討重組質粒pIRES-hBMP-2-hVEGF165 體外轉染對hBMSCs 成骨誘導分化的影響。 方 法 構建hBMP-2 和hVEGF165 真核共表達載體。取健康成人自愿捐獻的骨髓分離培養hBMSCs，采用陽離子脂質體將構建的質粒pIRES-hBMP-2-hVEGF165、pIRES-hBMP-2、pIRES-hVEGF165 和空質粒載體（pIRES-neo）轉染至hBMSCs，作為A、B、C、D 組；另取相同數量的未轉染細胞作為對照組（E 組）。培養4 周，采用RT-PCR 檢測hBMP-2、hVEGF165 以及骨鈣mRNA 表達，Western blot 檢測細胞 hBMP-2 和 hVEGF165 表達，定量檢測ALP 活性，免疫組織化學方法檢測Col Ⅰ表達。 結 果 與E 組比較，A 組hBMSCs 高表達hBMP-2、hVEGF165、Col Ⅰ及骨鈣素，B 組大量表達骨鈣素及Col Ⅰ，C組高表達hVEGF165，而B 組hVEGF165 及C 組hBMP-2 和Col Ⅰ的表達與D、E 組相似，呈陰性或僅有痕量表達。A、B、C、D 及E 組ALP 活性分別為0.91 ± 0.03、0.90 ± 0.02、0.64 ± 0.03、0.67 ± 0.01、0.66 ± 0.02，A、B 組與E 組比較差異有統計學意義（P lt; 0.05），C、D、E 組差異無統計學意義（P gt; 0.05）。 結論 重組質粒通過陽離子脂質體能成功轉染hBMSCs，外源性hBMP-2 和 hVEGF165 基因在轉染細胞中能持續表達，并能增強hBMSCs 的成骨能力。
【摘 要】 目的 通過引入內部核糖體進入位點序列（internal ribosome entry site，IRES），構建帶有hVEGF165 及hBMP-7 雙基因的重組腺相關病毒載體（adeno-associated virus，AAV），并對其進行鑒定。 方法 以AAV 腺相關病毒包裝系統（helper-free system）為基礎，將真核表達質粒pIRES 中的IRES 片段定向克隆至腺相關病毒骨架質粒pAAVMCS中，形成含有IRES 序列及上、下游多克隆位點的重組骨架質粒pAAV-MCS A-IRES-MCS B。PCR 擴增hVEGF165 和hBMP-7 基因，先后亞克隆入重組腺相關病毒骨架質粒IRES 序列上、下游的多克隆位點，獲得重組質粒pAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7。將其和包裝質粒pAAV-RC、輔助質粒pHelper 三質粒共轉染AAV-293 細胞，包裝重組腺相關病毒rAAVhVEGF165-IRES-hBMP-7，同時包裝含有綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）標記的重組病毒rAAV-IRES-GFP作平行對照。熒光顯微鏡下監測病毒包裝效率，收獲重組病毒后感染AAV-HT1080 細胞測定病毒滴度，并通過病毒基因組外源基因擴增鑒定重組病毒的包裝是否成功。 結果 重組腺相關病毒骨架質粒pAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7 經雙酶切鑒定正確。熒光顯微鏡下觀察三質粒共轉染AAV-293 細胞72 h 后，病毒包裝效率達95% ～ 100%，收獲的重組病毒具有較高濃度及活性，感染AAV-HT1080 效率達90%，熒光計數法測定病毒感染滴度達5.5 × 1011 vp/mL。提取重組病毒基因組成功擴增出外源目的基因hVEGF165 及hBMP-7 片段，重組病毒包裝成功。 結論 成功構建帶有hVEGF165 及hBMP-7 雙基因的重組腺相關病毒rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7，收獲的病毒具有較高滴度，為今后利用腺相關病毒載體進行hVEGF165 及hBMP-7 雙基因共表達影響骨修復的體外及體內研究提供實驗基礎。
【摘 要】 目的 建立兔Perthes 病模型并探討Perthes 病程中股骨頭局部VEGF 表達的變化及意義。 方 法 3 月齡新西蘭大白兔24 只，體重1.6 ～ 1.8 kg。取16 只兔作為實驗組，手術切斷左側圓韌帶和股骨頭支持帶血供，建立兔Perthes 病模型；剩余8 只作為對照組，按照上述程序左側股骨頭進行手術，但不打開關節囊，保持股骨頭正常血供。于術后1、2、4、8 周分別處死動物，取出股骨頭，行大體觀察、X 線片、組織學、VEGF 免疫組織化學染色和VEGF mRNA 原位雜交觀察。 結果 實驗組動物模型均制備成功，術后5 d 感染1 例，退出實驗。大體觀察：對照組各時間點股骨頭未見壞死改變；實驗組股骨頭隨時間延長逐漸粗糙、失去光澤，變小，可見塌陷。X 線片觀察：術后1、2 周，兩組股骨頭無明顯差異；4、8 周，實驗組股骨頭較對照組密度增高。對照組各時間點HE 染色均未見股骨頭壞死及修復改變；實驗組術后4、8 周可見血管及肉芽組織侵入，新骨形成，參與修復。免疫組織化學：對照組股骨頭骺軟骨中，肥大區表現出較高的VEGF免疫反應性（VEGF immunoreactivity，VEGF-IR），而增殖區VEGF-IR 卻表現較低水平。術后1 周，實驗組股骨頭增殖區VEGF 陽性細胞率開始高于對照組，實驗組股骨頭肥大區VEGF 陽性細胞率明顯減少。術后8 周，實驗組股骨頭整個骺軟骨區均表現VEGF-IR，增殖區VEGF 陽性細胞率較對照組明顯增加；壞死股骨頭軟骨內骨化中心修復重建，肥大區VEGF陽性細胞率較正常接近。術后1、2、4、8 周，實驗組骺軟骨增殖區VEGF 陽性細胞率與對照組比較均有統計學意義（P lt;0.01） ；術后1、2、4 周，實驗組骺軟骨肥大區VEGF 陽性細胞率與對照組比較均有統計學意義（P lt; 0.01）。原位雜交觀察結果與免疫組織化學染色觀察相似。缺血性壞死后，實驗組肥大區VEGF mRNA 表達喪失，增殖區VEGF mRNA 表達升高。軟骨內骨化中心修復重建后，實驗組可見新形成的肥大區重新表達VEGF mRNA。 結論 VEGF 在壞死股骨頭骺軟骨促進血管發生、軟骨內骨化中心的修復重建方面起關鍵的調節作用。
目的 研究BMSCs 移植對大鼠脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）后VEGF 受體胎肝激酶1（fetal liver kinase 1，Flk-1）基因和蛋白表達的影響，探討BMSCs 移植修復大鼠SCI 的機制。 方法 取4 周齡雄性Wistar 大鼠5 只，體重100 ～ 120 g，進行BMSCs 分離及培養。取81 只Wistar 雌性大鼠，體重220 ～ 250 g，采用改良Allen’s 打擊裝置制備SCI 模型，隨機分為3 組：假手術組（A 組，n=21），僅咬除T8 ～ 10 棘突和椎板；DMEM 組（B 組，n=30），SCI 區周圍注射DMEM；BMSCs 組（C 組，n=30），SCI 區周圍注射BMSCs。于移植術后1、3、5 d，采用RT-PCR 方法檢測各組大鼠SCI 區Flk-1 基因表達的變化；于移植術后3、7、14 d，免疫組織化學方法觀察脊髓內Flk-1 蛋白的表達。 結果 原代培養的BMSCs 細胞形態多樣，隨著傳代次數的增加，細胞形態逐漸趨于均一，多為扁平形和長梭形。RT-PCR 結果顯示，在移植術后1、3、5 d，C 組Flk-1 mRNA 表達水平與B 組比較差異無統計學意義（P gt; 0.05）；但B、C 組與A 組比較，Flk-1 mRNA表達于術后1 d 明顯增加并達峰值（P lt; 0.01），術后3 d 下降（P lt; 0.01），至術后5 d 表達仍高于A組（P lt; 0.05）。免疫組織化學結果顯示，移植術后3 、7 d，B 組Flk-1 蛋白表達較A 組顯著增加，差異有統計學意義（P lt; 0.01）；術后14 d，A、B 組Flk-1 蛋白表達差異無統計學意義（P gt; 0.05） ；移植術后3 d，B、C 組Flk-1 表達相似，差異無統計學意義（P gt; 0.05），移植術后7 、14 d，C 組Flk-1 表達明顯高于B 組（P lt; 0.01）。 結論 SCI 后BMSCs 移植對Flk-1 mRNA 的表達無調節作用，但上調Flk-1 蛋白的表達，是修復SCI 的機制之一。
目的 研究CoCl2 對體外培養的鼠下頜骨成骨細胞的作用，觀察缺氧條件對成骨細胞VEGF 及TGF-β1 表達的影響，為臨床牽張成骨技術的分子生物學機制研究提供理論依據。 方法 取新生24 h 內Wistar 大鼠下頜骨，改良酶消化法培養和純化成骨細胞，采用HE 染色、ALP 組織化學染色、Ⅰ型膠原免疫組織化學、鈣結節染色行細胞形態學及組織學鑒定，并繪制生長曲線。取第3 代最佳生長狀態的鼠下頜骨成骨細胞，用150 μmol/L CoCl2 處理（實驗組），設正常狀態下培養為對照組，分別于培養后0、3、6、9、12、24 h，采用免疫熒光技術檢測VEGF 及TGF-β1 表達。 結 果 HE染色示成骨細胞形態多樣，呈三角形、多角形、圓形及鱗片形等不規則形態，突起長短不一向外伸展，胞核清晰可見；胞漿豐富，呈粉紅色，胞核藍紫色，有時可見2 個細胞核，密集處細胞形態不明顯，分界模糊，僅見大圓核細胞。ALP 組織化學染色示細胞胞質呈黑色顆粒，細胞核輪廓不清，細胞密集區可見大量陽性細胞。Ⅰ型膠原免疫組織化學染色示實驗組陽性細胞均勻可見，胞漿呈棕黃色，胞核周圍尤為明顯，空白對照組細胞未見棕黃色顆粒。鈣結節染色示成骨細胞于蓋玻片上培養15 d 后，細胞聚集成不透明區域，呈結節樣；茜素紅染色后，有橙紅色著色。培養各時間點對照組細胞激光共聚焦顯微鏡下可見較弱的VEGF 表達熒光；實驗組細胞隨缺氧時間延長，VEGF 表達熒光強度值增加，于術后9 h 達高峰，隨后降至正常水平。培養各時間點激光共聚焦顯微鏡下可見兩組細胞均有TGF-β1 表達熒光，對照組各時間點熒光強度值均略高于VEGF 對照組；實驗組TGF-β1 表達在缺氧3 h 短期成倍增加，隨缺氧時間延長表達逐漸降低。 結論 經新生大鼠下頜骨培養的成骨細胞性狀穩定；適當缺氧可誘導成骨細胞VEGF 和TGF-β1表達增強。
目的 構建含有由抗腫瘤相關糖蛋白72(anti-TAG72)單鏈抗體片段(single chain variable fragment,scFv)及CD28胞內區及跨膜區的融合基因anti-TAG72 scFv-CD28的重組綠色熒光表達載體pEGFP-C3-anti-TAG72 scFv-CD28，并轉染獲得嵌合錨定T淋巴細胞。方法 將anti-TAG72單鏈抗體及CD28胞內區及跨膜區基因的嵌合錨定融合分子克隆入綠色熒光蛋白真核表達載體pEGFP-C3，獲得pEGFP-C3-anti-TAG72 scFv-CD28表達載體。用卡那霉素篩選陽性克隆，經酶切和測序鑒定。將上述重組質粒pEGFP-C3-anti-TAG72 scFv-CD28以脂質體法瞬時轉染外周血單核細胞(PBMC)，以獲得嵌合錨定T淋巴細胞，用熒光顯微鏡檢測嵌合分子anti-TAG72 scFv-CD28在PBMC中的表達，并檢驗嵌合錨定融合分子anti-TAG72 scFv-CD28的表達。結果 重組綠色熒光表達載體pEGFP-C3-anti-TAG72 scFv-CD28中anti-TAG72 scFv-CD28片段為1 002 bp，與已知的序列相符。酶切、測序結果表明，嵌合錨定融合分子基因片段anti-TAG72 scFv-CD28被正確插入pEGFP-C3載體； 轉染后anti-TAG72 scFv-CD28片段及綠色熒光物質表達于嵌合錨定T淋巴細胞胞膜表面及胞漿中，為綠色熒光顯色。結論 完成了綠色熒光表達載體pEGFP-C3-anti-TAG72 scFv-CD28的構建，并成功在PBMC瞬時表達。
目的構建pEGFP-N3-TFPI-2真核表達載體，為研究TFPI-2基因的功能做準備。 方法從胎盤組織中提取總RNA，逆轉錄合成cDNA，再以PCR法進行擴增。將擴增的TFPI-2基因片段克隆到pEGFP-N3真核表達載體上，經XhoⅠ和KpnⅠ雙酶切后，行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，同時測定其DNA序列。將pEGFP-N3-TFPI-2真核表達載體以脂質體LipofectamineTM 2000介導的方法轉染Top10感受態細胞（轉染組），同時設空白對照組（僅轉染pEGFP-N3質粒）和未轉染組（不予轉染）。采用Western blot法檢測3組細胞中TFPI-2蛋白的表達情況。 結果總RNA經分光光度法驗證，其純度符合PCR法擴增的要求。構建的pEGFP-N3-TFPI-2真核表達載體經XhoⅠ和KpnⅠ雙酶切后，行1%瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示，分別在708 bp處和4 700 bp處有特異擴增條帶，大小與理論值一致。DNA序列測定結果證實，pEFFP-N3-TFPI-2真核表達載體的序列完全正確。Western blot法結果顯示，TFPI-2蛋白的表達量轉染組為0.657 3±0.032 5，空白對照組為0.301 7±0.028 7，未轉染組為0.314 3±0.026 6，轉染組TFPI-2蛋白的表達量高于空白對照組和未轉染組，差異有統計學意義（P＜0.01）。 結論本實驗成功構建了pEGFP-N3-TFPI-2真核表達載體，為TFPI-2基因功能的研究奠定了基礎。