引用本文： 王健, 王曉東, 唐冠杰, 趙佳. pEGFP-N3-TFPI-2真核表達載體的構建和鑒定. 中國普外基礎與臨床雜志, 2014, 21(3): 300-304. doi: 10.7507/1007-9424.20140072 復制
組織因子途徑抑制物-2（tissue factor pathway inhibitor-2，TFPI-2）又稱為胎盤蛋白-5（placental pro-tein-5，PP-5）或視網膜色素上皮細胞-1（retinal pig-ment epithelium-1，RPE-1），屬于絲氨酸蛋白酶抑制物的一種[1-2]。研究[3-5]表明，TFPI-2蛋白在維持細胞外基質（ECM）結構的完整性、調控惡性腫瘤的內外擴張和遷移中均起著重要的作用。TFPI-2基因在人體正常組織中高表達，而在腫瘤組織中則表現為低表達，甚至不表達[6-8]。將外源性TFPI-2基因克隆于腫瘤細胞的DNA中可上調其表達，但隨著腫瘤細胞的復制，常出現TFPI-2基因缺失。真核細胞表達載體如pEGFP-N3質粒強大復制能力的發現，為克服上述方法的不足提供了可能。本實驗將外源性TFPI-2基因克隆于pEGFP-N3載體中，成功構建了pEGFP-N3-TFPI-2真核表達載體，旨在為惡性腫瘤的基因治療提供實驗基礎。
1 材料與方法
1.1 主要材料和設備
主要材料：人胎盤組織，胎牛血清（中國杭州四季青生物工程材料有限公司），pEGFP-N3質粒（中國北京斯百匯生物科技有限公司），Top10化學感受態細胞（大腸桿菌Top10菌株）轉染試劑盒和質粒小抽試劑盒（日本TaKaRa公司），1%瓊脂糖凝膠回收試劑盒（中國百奧邁科生物技術公司），DNA聚合酶和T4連接酶緩沖液（中國上海生工生物工程有限公司），24%聚乙二醇6000（PEG6000，加拿大Fermentas公司），限制性內切酶XhoⅠ和KpnⅠ（美國NEB公司），1 kb plus DNA ladder（北京天根公司）），逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）試劑盒和Trizol試劑（美國Roche公司），DNA凝膠回收試劑盒（西安華舜公司）。設備：Western blot用電泳儀、電泳槽及轉膜儀（美國Bio-Rad公司），酶標儀（上海安泰分析儀器有限公司），紫外分析儀和分光光度計（韓國Mecasys公司）。
1.2 引物的設計與合成
設計擴增TFPI-2基因cDNA的引物時，上、下游引物分別選用XhoⅠ（CTCGAG序列）和KpnⅠ（GGTACC序列）兩個酶切位點。引物序列由沈陽寶信生物科技有限公司合成。TFPI-2基因：上游引物序列為5′-CCAATCTCGAGATGGACCCCGCTCGC-CCCCTGGGGCTG-3′，下游引物序列為5′-CCAAT-GGTACCGTAAATTGCTTCTTCCGAATTTTCCG-3′（擴增產物長度為368 bp）；β-actin：上游引物序列為5′-CTCCTTAAGCTCGGGACCTTCCCAGAATT-CGGCTAAAC-3′，下游引物序列為5′-GACCTAGC-ACCCTTAGGAATTTCCGACGGGTACGACG-3′（擴增產物長度為520 bp）。
1.3 TFPI-2基因cDNA的獲取
取新鮮人胎盤組織40 mg，于液氮中研磨成粉；加入500μL Trizol試劑反復吹打，使細胞完全裂解，室溫靜置5 min；加入200μL氯仿，劇烈震蕩12 s，室溫靜置2 min；4℃離心（1 200 r/min，r=13.5 cm，15 min）；去上清液，加入1 mL 75%乙醇溶液洗滌沉淀，4℃離心（7 500 r/min，r=13.5 cm，5 min）；吸去乙醇，室溫沉淀10 min，加入焦炭酸二乙酯水（DEPC-H2O）溶解RNA。以紫外分析儀檢測總RNA的純度，判斷符合RT-PCR的反應要求后，經逆轉錄合成cDNA的第1鏈（操作按試劑盒說明書進行），然后采用PCR技術擴增cDNA（在試管中加入模板DNA 1μL，PCR引物（oligo 6）1μL，4種核苷酸共1μL及Mgcl2溶液4μL）。PCR的反應條件：95℃、5 min條件下激活和熱啟動Taq DNA聚合酶，95℃30 s（變性），56℃30 s（退火），72℃1 min（延伸），共25個循環。以擴增后的cDNA為模板，以引物T重復寡核苷酸（oligo dT）引導進行PCR擴增（操作按試劑盒說明書進行），從而獲取TFPI-2基因的全長cDNA。
1.4 pEGFP-N3-TFPI-2真核表達載體的構建和擴增
將pEGFP-N3質粒和TFPI-2 cDNA分別行XhoⅠ和KpnⅠ酶切后，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的條帶，再予以連接：加入T4連接酶緩沖液2μL、酶切后回收的pEGFR-N3質粒片段4μL，酶切后回收的TFPI-2 cDNA片段1μL，加滅菌水至10μL，16℃條件下反應4 h。從-80℃冰箱中取出Top10化學感受態細胞50μL，加入10μL連接產物，冰上孵育35 min；在42℃水浴鍋中熱擊90 s，將熱擊后的感受態細胞迅速轉移至冰上靜置3 min；加入600μL LB卡那霉素抗性液體培養基（0.03μg/L），37℃搖床培養1 h（220 r/min，振幅32 mm，后同）；將培養基加入EP管中，離心（3 000 r/min，r=13.5 cm，5 min）；在超凈工作臺中倒掉上清，用加樣移液器吹吸使菌體重懸；吸取適量菌液（200μL）涂布LB卡那霉素培養基平板，37℃倒置過夜培養（12～16 h）。等待長出單克隆菌落后，挑取菌斑加于48孔深孔板中（含有LB卡那霉素抗性液體培養基），37℃搖床擴大培養16 h。按照質粒小抽試劑盒的操作說明書提取pEGFR-N3-TFPI-2重組質粒。將pEGFP-N3-TFPI-2重組質粒行XhoⅠ和KpnⅠ雙酶切，再行1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察擴增條帶的長度是否與理論值一致。同時將含陽性重組質粒的細菌送寶生物工程（大連）有限公司行DNA序列測定，測序結果與GenBank的檢測結果完全一致。經測序驗證構建正確后，將載體命名為pEGFP-N3-TFPI-2重組質粒。
1.5 pEGFP-N3-TFPI-2重組質粒的轉染
在24孔培養板上，以無血清無雙抗的1640培養基培養Top10感受態細胞4 h后，采用Lipofecta-mineTM 2000轉染，轉染步驟按試劑盒說明書進行。Top10感受態細胞的鋪板密度為2×104個/孔，pEGFP-N3-TFPI-2重組質粒用量為0.5μg，脂質體用量為4μL；逐一優化轉染條件后轉染（轉染組），轉染4 h后更換為完全培養基。空白對照組僅轉染pEGFP-N3質粒，轉染步驟同轉染組，未轉染組不做轉染處理。轉染24 h后檢測3組細胞中TFPI-2蛋白的表達情況。
1.6 Western blot法檢測TFPI-2蛋白的表達
蛋白樣品的制備：轉染組、未轉染組和空白對照組分別收集細胞1×107個，再用PBS沖洗3遍；加入裂解液400μL，置于冰上裂解30 min。將細胞碎片和裂解液移至EP管中，4℃離心（12 000 r/min，r=13.5 cm，5 min），取上清（即為總蛋白）。蛋白含量的測定：配制適量的二喹啉甲酸（BCA）工作液，與蛋白標準品充分混勻，使其完全溶解；將標準品按0、1、2、4、8、12、16及20μL加到96孔細胞培養板的標準品孔中，加無菌生理鹽水補足到20μL。加5μL蛋白樣品到樣品孔中，加生理鹽水補足到20μL；各孔加入BCA工作液200μL，37℃放置30 min。以酶標儀測定光密度值（A值），繪制標準曲線，計算蛋白濃度，濃度符合要求后進行后續操作。電泳：灌膠，用微量移液器加樣20μL，加入電泳緩沖液，接好電極，觀察Marker的移動情況，適時終止電泳。將電泳后的凝膠取出浸入buffer中，置于搖床上30 min；截取聚偏二氯乙烯膜（PVDF膜）浸入buffer中10 min；將1張厚濾紙浸濕鋪于半干轉印儀底層電極板上，將PVDF膜鋪在厚濾紙上，再用另一張浸濕的厚濾紙放于PVDF膜上，蓋上頂層電極板，轉印1 h。取出PVDF膜，浸入含5%脫脂牛奶的TBST封閉液中，搖床搖1 h，倒掉封閉液，加入TFPI-2一抗（兔抗人TFPI-2單克隆抗體，1∶1 000），過夜孵育，再加抗兔二抗（1∶2 000），按顯色試劑盒說明書進行顯色分析。
1.7 統計學方法
采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析。計量數據以均數±標準差（
2 結果
總RNA經分光光度法測定：A260 /A280=1.926，表明所獲得的總RNA的純度符合RT-PCR的要求。
2.1 pEGFP-N3-TFPI-2重組質粒的鑒定結果
將pEGFP-N3-TFPI-2重組質粒分別行XhoⅠ和KpnⅠ雙酶切后，行1%瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示，分別在708 bp和4 700 bp處有特異擴增條帶（圖 1），長度與理論值一致；pEGFP-N3-TFPI-2重組質粒對應的條帶長度與其理論值一致，表明目的基因已成功轉入pEGFP-N3載體中。同時，pEGFP-N3-TFPI-2重組質粒的DNA測序結果表明載體構建正確。
圖1
pEGFP-N3-TFPI-2重組質粒的酶切結果。1：pEGFP-N3-TFPI-2重組質粒（未被酶切）；2：pEGFP-N3-TFPI-2重組質粒行XhoⅠ和KpnⅠ雙酶切；3：DNA Marker
Figure1.
Results of enzyme digestion of recombinant plasmid of pEGFP-N3-TFPI-2. 1:Recombinant plasmid of pEGFP-N3-TFPI-2 by no digestion; 2:Recombinant plasmid of pEGFP-N3-TFPI-2 by double digestion with XhoⅠand KpnⅠ; 3:DNA Marker
2.2 3組細胞中TFPI-2蛋白的表達情況
Western blot法檢測結果（圖 2）顯示，TFPI-2蛋白的表達量轉染組為0.657 3±0.032 5，空白對照組為0.301 7±0.028 7，未轉染組為0.314 3±0.026 6，轉染組TFPI-2蛋白的表達量高于空白對照組和未轉染組（P＜0.01），而對照組和未轉染組TFPI-2蛋白表達水平的差異無統計學意義（P＞0.05）。表明真核表達載體已整合入Top10化學感受態細胞中，促使抑癌因子TFPI-2蛋白的表達明顯上調。
圖2
示3組細胞中TFPI-2蛋白的表達結果。1：未轉染組；2：空白對照組；3：轉染組
Figure2.
Expression results of TFPI-2 protein in 3 groups. 1:Untrans-fection group; 2:Blank control group; 3:Transfection group
3 討論
惡性腫瘤是一類侵襲能力強、早期易發生轉移，且目前缺乏有效治療方法的一類疾病，其發病率呈逐年上升趨勢。現認為，惡性腫瘤侵襲和轉移的基礎為ECM降解，因而維持ECM的完整性是減少惡性腫瘤侵襲和轉移的關鍵[9-12]。TFPI-2基因定位于人類7號染色體長臂2區2帶（7q22），全長約7 kb。TFPI-2基因廣泛分布于人類肝臟、胰腺、胃、前列腺、骨骼肌等正常組織中，其編碼產物為絲氨酸蛋白酶抑制物——TFPI-2蛋白。TFPI-2蛋白在ECM的重塑與動態平衡中起到關鍵作用。ECM為上皮細胞提供了一個支架，參與細胞凋亡、增殖、黏附、遷移及分化，是腫瘤發展過程中必不可少的一部分。ECM的降解和重塑是血管生成、腫瘤細胞侵襲和轉移等生理、病理過程的基本步驟[13]。在正常人體組織中，TFPI-2蛋白抑制纖溶酶和多種基質金屬蛋白酶（MMPs）的活性，進而維持了ECM結構的完整性，抑制了血管的重塑[14]，這是抑制腫瘤侵襲和轉移的重要機理[2, 15]。在乳腺癌[2, 16]、胃癌[6, 17-18]、非小細胞肺癌[19-20]、胰腺癌[21-22]、肝細胞癌[23]、宮頸癌[24]等多種惡性腫瘤組織中，TFPI-2蛋白的表達下調。研究[2]表明，表達失調的TFPI-2蛋白可能與腫瘤的進展相關。通過對喉鱗狀細胞癌的研究[25]表明，TFPI-2蛋白通過抑制ECM的降解，可以使其癌細胞的侵襲和轉移能力下降。
本實驗從人胎盤組織中提取了TFPI-2基因，將其克隆在pEGFP-N3載體上，并通過雙酶切法和DNA序列測定驗證了所構建的pEGFP-N3-TFPI-2真核表達載體的正確性。Western blot法檢測結果顯示，穩定轉染的細胞中TFPI-2蛋白的表達量明顯高于空白對照組和未轉染組，表明真核表達載體已成功整合入轉染細胞。所選用的pEGFP-N3載體具有便于目的基因插入的多克隆位點，因而操作簡便易行。本實驗為進一步研究TFPI-2基因對腫瘤細胞的抑制作用提供了實驗基礎。
組織因子途徑抑制物-2（tissue factor pathway inhibitor-2，TFPI-2）又稱為胎盤蛋白-5（placental pro-tein-5，PP-5）或視網膜色素上皮細胞-1（retinal pig-ment epithelium-1，RPE-1），屬于絲氨酸蛋白酶抑制物的一種[1-2]。研究[3-5]表明，TFPI-2蛋白在維持細胞外基質（ECM）結構的完整性、調控惡性腫瘤的內外擴張和遷移中均起著重要的作用。TFPI-2基因在人體正常組織中高表達，而在腫瘤組織中則表現為低表達，甚至不表達[6-8]。將外源性TFPI-2基因克隆于腫瘤細胞的DNA中可上調其表達，但隨著腫瘤細胞的復制，常出現TFPI-2基因缺失。真核細胞表達載體如pEGFP-N3質粒強大復制能力的發現，為克服上述方法的不足提供了可能。本實驗將外源性TFPI-2基因克隆于pEGFP-N3載體中，成功構建了pEGFP-N3-TFPI-2真核表達載體，旨在為惡性腫瘤的基因治療提供實驗基礎。
1 材料與方法
1.1 主要材料和設備
主要材料：人胎盤組織，胎牛血清（中國杭州四季青生物工程材料有限公司），pEGFP-N3質粒（中國北京斯百匯生物科技有限公司），Top10化學感受態細胞（大腸桿菌Top10菌株）轉染試劑盒和質粒小抽試劑盒（日本TaKaRa公司），1%瓊脂糖凝膠回收試劑盒（中國百奧邁科生物技術公司），DNA聚合酶和T4連接酶緩沖液（中國上海生工生物工程有限公司），24%聚乙二醇6000（PEG6000，加拿大Fermentas公司），限制性內切酶XhoⅠ和KpnⅠ（美國NEB公司），1 kb plus DNA ladder（北京天根公司）），逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）試劑盒和Trizol試劑（美國Roche公司），DNA凝膠回收試劑盒（西安華舜公司）。設備：Western blot用電泳儀、電泳槽及轉膜儀（美國Bio-Rad公司），酶標儀（上海安泰分析儀器有限公司），紫外分析儀和分光光度計（韓國Mecasys公司）。
1.2 引物的設計與合成
設計擴增TFPI-2基因cDNA的引物時，上、下游引物分別選用XhoⅠ（CTCGAG序列）和KpnⅠ（GGTACC序列）兩個酶切位點。引物序列由沈陽寶信生物科技有限公司合成。TFPI-2基因：上游引物序列為5′-CCAATCTCGAGATGGACCCCGCTCGC-CCCCTGGGGCTG-3′，下游引物序列為5′-CCAAT-GGTACCGTAAATTGCTTCTTCCGAATTTTCCG-3′（擴增產物長度為368 bp）；β-actin：上游引物序列為5′-CTCCTTAAGCTCGGGACCTTCCCAGAATT-CGGCTAAAC-3′，下游引物序列為5′-GACCTAGC-ACCCTTAGGAATTTCCGACGGGTACGACG-3′（擴增產物長度為520 bp）。
1.3 TFPI-2基因cDNA的獲取
取新鮮人胎盤組織40 mg，于液氮中研磨成粉；加入500μL Trizol試劑反復吹打，使細胞完全裂解，室溫靜置5 min；加入200μL氯仿，劇烈震蕩12 s，室溫靜置2 min；4℃離心（1 200 r/min，r=13.5 cm，15 min）；去上清液，加入1 mL 75%乙醇溶液洗滌沉淀，4℃離心（7 500 r/min，r=13.5 cm，5 min）；吸去乙醇，室溫沉淀10 min，加入焦炭酸二乙酯水（DEPC-H2O）溶解RNA。以紫外分析儀檢測總RNA的純度，判斷符合RT-PCR的反應要求后，經逆轉錄合成cDNA的第1鏈（操作按試劑盒說明書進行），然后采用PCR技術擴增cDNA（在試管中加入模板DNA 1μL，PCR引物（oligo 6）1μL，4種核苷酸共1μL及Mgcl2溶液4μL）。PCR的反應條件：95℃、5 min條件下激活和熱啟動Taq DNA聚合酶，95℃30 s（變性），56℃30 s（退火），72℃1 min（延伸），共25個循環。以擴增后的cDNA為模板，以引物T重復寡核苷酸（oligo dT）引導進行PCR擴增（操作按試劑盒說明書進行），從而獲取TFPI-2基因的全長cDNA。
1.4 pEGFP-N3-TFPI-2真核表達載體的構建和擴增
將pEGFP-N3質粒和TFPI-2 cDNA分別行XhoⅠ和KpnⅠ酶切后，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的條帶，再予以連接：加入T4連接酶緩沖液2μL、酶切后回收的pEGFR-N3質粒片段4μL，酶切后回收的TFPI-2 cDNA片段1μL，加滅菌水至10μL，16℃條件下反應4 h。從-80℃冰箱中取出Top10化學感受態細胞50μL，加入10μL連接產物，冰上孵育35 min；在42℃水浴鍋中熱擊90 s，將熱擊后的感受態細胞迅速轉移至冰上靜置3 min；加入600μL LB卡那霉素抗性液體培養基（0.03μg/L），37℃搖床培養1 h（220 r/min，振幅32 mm，后同）；將培養基加入EP管中，離心（3 000 r/min，r=13.5 cm，5 min）；在超凈工作臺中倒掉上清，用加樣移液器吹吸使菌體重懸；吸取適量菌液（200μL）涂布LB卡那霉素培養基平板，37℃倒置過夜培養（12～16 h）。等待長出單克隆菌落后，挑取菌斑加于48孔深孔板中（含有LB卡那霉素抗性液體培養基），37℃搖床擴大培養16 h。按照質粒小抽試劑盒的操作說明書提取pEGFR-N3-TFPI-2重組質粒。將pEGFP-N3-TFPI-2重組質粒行XhoⅠ和KpnⅠ雙酶切，再行1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察擴增條帶的長度是否與理論值一致。同時將含陽性重組質粒的細菌送寶生物工程（大連）有限公司行DNA序列測定，測序結果與GenBank的檢測結果完全一致。經測序驗證構建正確后，將載體命名為pEGFP-N3-TFPI-2重組質粒。
1.5 pEGFP-N3-TFPI-2重組質粒的轉染
在24孔培養板上，以無血清無雙抗的1640培養基培養Top10感受態細胞4 h后，采用Lipofecta-mineTM 2000轉染，轉染步驟按試劑盒說明書進行。Top10感受態細胞的鋪板密度為2×104個/孔，pEGFP-N3-TFPI-2重組質粒用量為0.5μg，脂質體用量為4μL；逐一優化轉染條件后轉染（轉染組），轉染4 h后更換為完全培養基。空白對照組僅轉染pEGFP-N3質粒，轉染步驟同轉染組，未轉染組不做轉染處理。轉染24 h后檢測3組細胞中TFPI-2蛋白的表達情況。
1.6 Western blot法檢測TFPI-2蛋白的表達
蛋白樣品的制備：轉染組、未轉染組和空白對照組分別收集細胞1×107個，再用PBS沖洗3遍；加入裂解液400μL，置于冰上裂解30 min。將細胞碎片和裂解液移至EP管中，4℃離心（12 000 r/min，r=13.5 cm，5 min），取上清（即為總蛋白）。蛋白含量的測定：配制適量的二喹啉甲酸（BCA）工作液，與蛋白標準品充分混勻，使其完全溶解；將標準品按0、1、2、4、8、12、16及20μL加到96孔細胞培養板的標準品孔中，加無菌生理鹽水補足到20μL。加5μL蛋白樣品到樣品孔中，加生理鹽水補足到20μL；各孔加入BCA工作液200μL，37℃放置30 min。以酶標儀測定光密度值（A值），繪制標準曲線，計算蛋白濃度，濃度符合要求后進行后續操作。電泳：灌膠，用微量移液器加樣20μL，加入電泳緩沖液，接好電極，觀察Marker的移動情況，適時終止電泳。將電泳后的凝膠取出浸入buffer中，置于搖床上30 min；截取聚偏二氯乙烯膜（PVDF膜）浸入buffer中10 min；將1張厚濾紙浸濕鋪于半干轉印儀底層電極板上，將PVDF膜鋪在厚濾紙上，再用另一張浸濕的厚濾紙放于PVDF膜上，蓋上頂層電極板，轉印1 h。取出PVDF膜，浸入含5%脫脂牛奶的TBST封閉液中，搖床搖1 h，倒掉封閉液，加入TFPI-2一抗（兔抗人TFPI-2單克隆抗體，1∶1 000），過夜孵育，再加抗兔二抗（1∶2 000），按顯色試劑盒說明書進行顯色分析。
1.7 統計學方法
采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析。計量數據以均數±標準差（
2 結果
總RNA經分光光度法測定：A260 /A280=1.926，表明所獲得的總RNA的純度符合RT-PCR的要求。
2.1 pEGFP-N3-TFPI-2重組質粒的鑒定結果
將pEGFP-N3-TFPI-2重組質粒分別行XhoⅠ和KpnⅠ雙酶切后，行1%瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示，分別在708 bp和4 700 bp處有特異擴增條帶（圖 1），長度與理論值一致；pEGFP-N3-TFPI-2重組質粒對應的條帶長度與其理論值一致，表明目的基因已成功轉入pEGFP-N3載體中。同時，pEGFP-N3-TFPI-2重組質粒的DNA測序結果表明載體構建正確。
圖1
pEGFP-N3-TFPI-2重組質粒的酶切結果。1：pEGFP-N3-TFPI-2重組質粒（未被酶切）；2：pEGFP-N3-TFPI-2重組質粒行XhoⅠ和KpnⅠ雙酶切；3：DNA Marker
Figure1.
Results of enzyme digestion of recombinant plasmid of pEGFP-N3-TFPI-2. 1:Recombinant plasmid of pEGFP-N3-TFPI-2 by no digestion; 2:Recombinant plasmid of pEGFP-N3-TFPI-2 by double digestion with XhoⅠand KpnⅠ; 3:DNA Marker
2.2 3組細胞中TFPI-2蛋白的表達情況
Western blot法檢測結果（圖 2）顯示，TFPI-2蛋白的表達量轉染組為0.657 3±0.032 5，空白對照組為0.301 7±0.028 7，未轉染組為0.314 3±0.026 6，轉染組TFPI-2蛋白的表達量高于空白對照組和未轉染組（P＜0.01），而對照組和未轉染組TFPI-2蛋白表達水平的差異無統計學意義（P＞0.05）。表明真核表達載體已整合入Top10化學感受態細胞中，促使抑癌因子TFPI-2蛋白的表達明顯上調。
圖2
示3組細胞中TFPI-2蛋白的表達結果。1：未轉染組；2：空白對照組；3：轉染組
Figure2.
Expression results of TFPI-2 protein in 3 groups. 1:Untrans-fection group; 2:Blank control group; 3:Transfection group
3 討論
惡性腫瘤是一類侵襲能力強、早期易發生轉移，且目前缺乏有效治療方法的一類疾病，其發病率呈逐年上升趨勢。現認為，惡性腫瘤侵襲和轉移的基礎為ECM降解，因而維持ECM的完整性是減少惡性腫瘤侵襲和轉移的關鍵[9-12]。TFPI-2基因定位于人類7號染色體長臂2區2帶（7q22），全長約7 kb。TFPI-2基因廣泛分布于人類肝臟、胰腺、胃、前列腺、骨骼肌等正常組織中，其編碼產物為絲氨酸蛋白酶抑制物——TFPI-2蛋白。TFPI-2蛋白在ECM的重塑與動態平衡中起到關鍵作用。ECM為上皮細胞提供了一個支架，參與細胞凋亡、增殖、黏附、遷移及分化，是腫瘤發展過程中必不可少的一部分。ECM的降解和重塑是血管生成、腫瘤細胞侵襲和轉移等生理、病理過程的基本步驟[13]。在正常人體組織中，TFPI-2蛋白抑制纖溶酶和多種基質金屬蛋白酶（MMPs）的活性，進而維持了ECM結構的完整性，抑制了血管的重塑[14]，這是抑制腫瘤侵襲和轉移的重要機理[2, 15]。在乳腺癌[2, 16]、胃癌[6, 17-18]、非小細胞肺癌[19-20]、胰腺癌[21-22]、肝細胞癌[23]、宮頸癌[24]等多種惡性腫瘤組織中，TFPI-2蛋白的表達下調。研究[2]表明，表達失調的TFPI-2蛋白可能與腫瘤的進展相關。通過對喉鱗狀細胞癌的研究[25]表明，TFPI-2蛋白通過抑制ECM的降解，可以使其癌細胞的侵襲和轉移能力下降。
本實驗從人胎盤組織中提取了TFPI-2基因，將其克隆在pEGFP-N3載體上，并通過雙酶切法和DNA序列測定驗證了所構建的pEGFP-N3-TFPI-2真核表達載體的正確性。Western blot法檢測結果顯示，穩定轉染的細胞中TFPI-2蛋白的表達量明顯高于空白對照組和未轉染組，表明真核表達載體已成功整合入轉染細胞。所選用的pEGFP-N3載體具有便于目的基因插入的多克隆位點，因而操作簡便易行。本實驗為進一步研究TFPI-2基因對腫瘤細胞的抑制作用提供了實驗基礎。
