目的 探討血紅素氧合酶 1（heme oxygenase 1，HO-1）對 TNF-α 誘導的人退變椎間盤髓核細胞凋亡的作用及其可能的分子機制。 方法 取腰椎間盤突出癥患者自愿捐贈的椎間盤組織，體外培養人退變髓核細胞并傳代，取第 3 代細胞進行實驗。采用細胞計數試劑盒 8 測定不同濃度（10、20、50、100 和 200 ng/mL）TNF-α 對髓核細胞活性的影響，篩選最佳刺激濃度進行下一步實驗。將髓核細胞分成 4 組，分別采用單純基礎培養液（對照組）、TNF-α 刺激（TNF-α 組）、TNF-α 和 CoPP 10 μmol/L 刺激（CoPP 組）、TNF-α 和 ZnPP 15 μmol/L 刺激（ZnPP 組）培養，24 h 后采用 Hoechst 染色以及流式細胞儀檢測細胞凋亡；Western blot 檢測凋亡相關蛋白活化型 Caspase-3（cleaved Caspase-3）、上皮膜蛋白 1（epithelial membrane protein 1，EMP-1）以及 HO-1、p-P65 的表達。為進一步探討 HO-1 對髓核細胞凋亡的潛在分子機制，取髓核細胞分別采用 TNF-α 刺激（TNF-α 刺激組）以及 TNF-α 和吡咯烷二硫基甲酸（pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC）5 μmol/L 刺激（TNF-α+PDTC 刺激組）培養 24 h，采用流式細胞儀檢測髓核細胞凋亡率。 結果 經檢測確定 TNF-α 最佳抑制濃度為 100 ng/mL。Hoechst 染色示，對照組和 CoPP 組凋亡細胞較少；TNF-α 組和 ZnPP 組可見凋亡樣改變細胞核，其中 ZnPP 組最顯著。流式細胞儀檢測示，與對照組相比，TNF-α 組、CoPP 組及 ZnPP 組細胞凋亡率均顯著提高（P<0.05）；與 TNF-α 組相比，CoPP 組細胞凋亡率顯著降低（P<0.05），而 ZnPP 組顯著提高（P<0.05）。Western blot 檢測示，與對照組相比，TNF-α 組 HO-1 蛋白表達降低，cleaved Caspase-3、EMP-1 及 p-P65 蛋白表達升高（P<0.05）。與 TNF-α 組相比，CoPP 組 HO-1 蛋白表達明顯升高，cleaved Caspase-3、EMP-1、p-P65 蛋白表達明顯降低（P<0.05）；而 ZnPP 組 HO-1 蛋白表達明顯降低（P<0.05），cleaved Caspase-3、EMP-1 蛋白表達增高（P<0.05），p-P65 蛋白表達無明顯變化（P>0.05）。與 TNF-α 刺激組相比，TNF-α+PDTC 刺激組細胞凋亡率明顯降低（t=3.076，P=0.031）。 結論 HO-1 能夠抑制 TNF-α 誘導的人椎間盤髓核細胞凋亡，其機制可能是通過調控 NF-кB 通路得以實現。
目的研究體外單層培養與藻酸鹽微球立體培養對人正常髓核細胞分化的影響，并探討白藜蘆醇（resveratrol，RES）恢復藻酸鹽微球立體培養下去分化髓核細胞表型的調節機制。 方法取6例腰椎爆裂骨折患者自愿捐贈的正常髓核組織分離培養髓核細胞，并行細胞鑒定；取單層培養的第1、3、5、7代髓核細胞分別行形態學觀察、β-半乳糖苷酶（senescence-associated β-galactosidase，SA-β-gal）染色觀察細胞衰老情況及甲苯胺藍染色觀察蛋白多糖表達。分別取單層培養和藻酸鹽微球立體培養的第1代髓核細胞檢測細胞增殖情況。取立體培養1周的第7代髓核細胞隨機分為立體培養空白組（A組）、RES組（B組）、沉默交配型信息調節因子2同源蛋白1（silent mating type information regulation 2 homolog 1，SIRT1）-小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）+ RES組（C組）、陰性對照-siRNA+RES組（D組），另設置髓核細胞單層培養空白組（E組），行相應培養后采用Western blot檢測SIRT1、聚蛋白多糖（Aggrecan）和Ⅱ型膠原蛋白表達，實時熒光定量PCR檢測SIRT1 mRNA表達水平。 結果細胞鑒定提示培養細胞為髓核細胞。形態學觀察及SA-β-gal、甲苯胺藍染色示，在體外連續單層培養條件下，正常髓核細胞易發生去分化，且隨著傳代次數增加趨勢愈明顯。藻酸鹽微球立體培養48 h內髓核細胞增殖顯著低于單層培養（P lt; 0.05），但能顯著提高去分化髓核細胞SIRT1、Ⅱ型膠原與Aggrecan蛋白的表達，E組與A組比較差異有統計學意義（P lt; 0.05）；與A組相比，B組3種蛋白表達顯著提高（P lt; 0.05）。C組SIRT1 mRNA和蛋白表達均受明顯抑制，顯著低于B、D組（P lt; 0.05），Ⅱ型膠原與Aggrecan蛋白表達也顯著低于B、D組（P lt; 0.05）。 結論連續體外單層培養條件下，髓核細胞增殖速度較快，但在培養過程中易發生去分化現象；而在藻酸鹽微球立體培養條件下，RES可以恢復去分化髓核細胞表型，合成更多細胞外基質，這一機制與SIRT1的調節有關。
目的探討白藜蘆醇（resveratrol，RES）對退變髓核細胞（nucleus pulposus cells，NPC）細胞外基質（extracellular matrix，ECM）表達的調控作用及其相關分子機制。方法選取臨床上接受椎間盤摘除術的 10 例患者，其中 5 例為年輕脊柱爆裂骨折患者，作為對照組；余 5 例為老年腰椎間盤突出癥患者，作為退變組。取兩組患者髓核組織，免疫組織化學染色比較 β-catenin 的原位表達，Western blot 檢測 β-catenin、Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖（Aggrecan）蛋白表達。取退變組髓核組織分離、培養 NPC，分別用 IL-1β 單獨（B 組）或聯合 RES（C 組）刺激第 3 代 NPC，并設未刺激細胞作為空白對照組（A 組），Western blot 檢測Ⅱ型膠原和 Aggrecan 蛋白表達。進一步采用小干擾 RNA（small interfering RNA，siRNA）靶向沉默 SIRT1 和 β-catenin 后，采用 Western blot、實時熒光定量 PCR 檢測 β-catenin、SIRT1 蛋白和基因表達。用完全培養基（1 組）、IL-1β（2 組）、RES+IL-1β（3 組）、SIRT1-siRNA+RES+IL-1β（4 組）刺激第 3 代 NPC 培養 24 h 后，細胞免疫熒光染色檢測 β-catenin 核轉位情況；用完全培養基（Ⅰ組）、IL-1β（Ⅱ組）、IL-1β+β-catenin-siRNA（Ⅲ組）、IL-1β+RES（Ⅳ組）、IL-1β+RES+SIRT1-siRNA（Ⅴ組）刺激第 3 代 NPC 培養 24 h 后，采用 Western blot 檢測Ⅱ型膠原和 Aggrecan 蛋白表達。結果免疫組織化學染色及 Western blot 檢測示，與對照組比較，退變組髓核組織中 β-catenin 陽性表達的細胞比例顯著升高（t=4.616，P=0.010）；β-catenin 蛋白相對表達量顯著升高，Ⅱ型膠原和 Aggrecan 蛋白相對表達量顯著下降（P<0.05）。細胞學實驗發現，B 組 β-catenin 蛋白相對表達量顯著高于 A、C 組，Ⅱ型膠原和 Aggrecan 相對表達量顯著低于 A、C 組（P<0.05）。siRNA 轉染后，Western blot 檢測顯示 SIRT1、β-catenin 蛋白表達顯著降低（P<0.05）。細胞免疫熒光染色結果進一步提示與 3 組相比，4 組 SIRT1 被 siRNA 沉默后，RES 減弱的 β-catenin 核轉位現象加劇。Western blot 檢測示，Ⅱ組Ⅱ型膠原和 Aggrecan 蛋白表達較Ⅰ組明顯降低（P<0.05）；Ⅲ組 NPC 轉染 β-catenin-siRNA 后，IL-1β 對 ECM 的降解作用被明顯抑制，Ⅱ型膠原和 Aggrecan 蛋白表達較Ⅱ組明顯升高（P<0.05）；Ⅴ組 NPC 轉染 SIRT1-siRNA 后，抑制了 RES 對 ECM 降解的保護作用，Ⅱ型膠原和 Aggrecan 蛋白表達較Ⅳ組明顯降低（P<0.05）。結論RES 可以通過抑制 Wnt/β-catenin 信號通路維持 NPC ECM 的表達，為椎間盤退行性疾病的治療提供了新思路。
目的探討內質網應激對吸煙誘導的髓核細胞凋亡與炎性反應的影響。方法以 2016 年 10 月—2018 年 10 月 25 例接受椎間盤摘除術的頸椎間盤突出癥患者為研究對象，分為吸煙組（14 例）和非吸煙組（11 例）。兩組患者年齡、性別、突出節段、Pfirrmann 分級比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。將術中獲取的髓核組織，行 TUNEL 染色和 Western blot 檢測，觀察細胞凋亡情況。然后，采用酶序貫消化法分離培養髓核細胞并傳代，取第 3 代細胞行 ELISA 檢測炎性因子 IL-1β 和 TNF-α 含量，免疫熒光染色觀察細胞中 P65 核轉移情況，Western blot 檢測內質網應激相關蛋白 GRP78 和 CHOP 表達，透射電鏡觀察細胞內質網超微結構。最后，為驗證內質網調控作用，采用特異性抑制劑 4-PBA 處理吸煙組髓核細胞后，Western blot 檢測 GRP78、CHOP、IL-1β、TNF-α 及 P65 蛋白相對表達量，流式細胞術檢測細胞凋亡率；并以吸煙組未作處理的髓核細胞作對照。結果髓核組織觀測顯示，吸煙組細胞凋亡率及凋亡相關蛋白 Caspase-3 和 PARP 相對表達量均明顯高于非吸煙組（P<0.05）。髓核細胞觀測顯示，吸煙組髓核細胞分泌 IL-1β、TNF-α 水平以及 GRP78、CHOP 蛋白相對表達量均明顯高于非吸煙組（P<0.05）；免疫熒光染色示吸煙組細胞 P65 主要表達在細胞核，而非吸煙組在細胞質；透射電鏡觀察顯示，與非吸煙組相比，吸煙組內質網處于應激損傷狀態。吸煙組髓核細胞經 4-PBA 處理后，GRP78、CHOP、IL-1β、TNF-α 及 P65 蛋白相對表達量以及細胞凋亡率均較處理前明顯降低（P<0.05）。結論吸煙可通過內質網應激導致髓核細胞凋亡和炎性反應加劇，抑制內質網應激有望成為延緩吸煙導致椎間盤退變的新靶點。
目的 探討人退變髓核細胞（nucelus pulposus cells，NPCs）分泌的基質細胞衍生因子 1（stromal cell derived factorl，SDF-1）對血管內皮細胞（vascular endothelial cells，VECs）的增殖影響及其相關分子機制。 方法 將術中摘取的椎間盤組織分離、培養人退變 NPCs，取第 1 代轉染 SDF-1 過表達慢病毒。取第 2 代細胞，轉染或未轉染過表達 SDF-1 慢病毒后，種植于 alvetex? 三維培養支架上行三維培養，并與人 HMEC-1 細胞（即 VECs）共培養。共培養 72 h 掃描電鏡觀察 NPCs 在支架上的生長情況；細胞計數試劑盒 8（cell counting kit 8，CCK-8）法分別檢測 12、24、48、72 h 轉染組與非轉染組 HMEC-1 增殖情況，以及加入 Akt 特異性抑制劑 GSK690693 后 24 h HMEC-1 增殖情況；膜聯蛋白Ⅴ/碘化丙啶法分別檢測共培養 72 h 后轉染組和非轉染組中 VECs 凋亡率；ELISA 法分別檢測轉染組和非轉染組培養基中 VEGF 含量；Western blot 法檢測轉染組、未轉染組和抑制劑組磷酸化 Akt（p-Akt）和總 Akt 蛋白表達。 結果 掃描電鏡觀察示 NPCs 在三維支架中維持了細胞表型，分泌大量細胞外基質；慢病毒成功轉染后，Western blot 檢測示 SDF-1 在 NPCs 中表達明顯升高。在共培養體系中，NPCs 過表達 SDF-1 后可使 HMEC-1 增殖上升，凋亡率下降，并在細胞外培養基檢測中發現 VEGF 含量顯著上升；而在進一步分子機制檢測中發現，SDF-1 的過表達使 HMEC-1 中 p-Akt 水平升高，采用 GSK690693 特異性抑制 Akt 表達后，SDF-1 對 HMEC-1 促細胞增殖作用明顯降低。 結論 人退變 NPCs 高表達的 SDF-1 有利于 VECs 增殖，這一調控機制或許與 SDF-1-Akt 信號通路有關。