引用本文： 劉滬喆, 沈皆亮, 周浩, 許圣茜, 胡偵明. 白藜蘆醇通過 Wnt/β-catenin 信號通路調控髓核細胞細胞外基質表達. 中國修復重建外科雜志, 2018, 32(4): 476-483. doi: 10.7507/1002-1892.201709097 復制
椎間盤退變被認為是多數脊柱疾患的始發因素，在當今人口老齡化社會，椎間盤退行性疾病（intervertebral disc degenerative disease，IVDD）因其高發病率和高致殘率，日益成為嚴重的公共健康問題[1]。一個正常的椎間盤組織包括上下軟骨終板、周圍纖維環以及包裹在中間的凍膠樣髓核組織。健康椎間盤的生物學意義在于緩沖脊柱的機械應力，為脊柱節段活動提供銜接。而髓核組織中的細胞外基質（extracellular matrix，ECM）是維持這一生物學功能的關鍵[2]。白藜蘆醇（resveratrol，RES）是一種細胞內沉默信息調節 2 同源物 1（SIRT1）的天然激動劑，本課題組前期研究表明 RES 可促進髓核細胞（nucleus pulposus cells，NPC）ECM 的表達，維持其細胞表型[3]，但具體作用機制并不清楚。
經典 Wnt/β-catenin 信號通路是細胞內信號傳導途徑的重要組成部分，參與調控增殖、分化、再生等多種細胞功能[4]。已有大量研究表明 Wnt/β-catenin 信號通路可以調控軟骨細胞 ECM 的表達，激活該通路會加速軟骨退變[5]。NPC 與軟骨細胞有著相似的細胞表型，因此近年來該信號通路在椎間盤生理病理中的作用越來越受到關注[6]。本研究擬以臨床摘取的髓核組織為研究對象，通過組織學和細胞學實驗，探討經典 Wnt/β-catenin 信號通路是否參與了 RES 對 NPC ECM 表達的調控，為 RES 進一步應用于臨床治療 IVDD 提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 標本來源及分組
椎間盤標本來源于重慶醫科大學附屬第一醫院骨科接受椎間盤摘除術的 10 例患者，其中 5 例術前診斷為脊柱爆裂骨折，年齡（33.2±7.6）歲，入院前無腰痛病史，設為對照組；余 5 例術前診斷為腰椎間盤突出癥，年齡（64.4±8.1）歲，設為退變組。椎間盤退變程度參照術前 MRI 的 Pfirrmann 分級[7]，其中對照組 1 級 1 例，2 級 4 例；退變組 3 級 1 例，4 級 3 例，5 級 1 例。將術中所取椎間盤組織放入無菌培養袋中，迅速帶回實驗室，在超凈臺用眼科剪和鑷，根據組織的大體形態仔細分離髓核組織，進行后續實驗。本研究方案獲重慶醫科大學倫理委員會批準，所有患者術前均簽署知情同意書。
1.2 主要試劑及儀器
免疫組織化學染色試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）；RIPA 裂解液、Bradford 法蛋白濃度檢測試劑盒、SDS-PAGE 配膠試劑盒、牛血清白蛋白、小鼠抗人 β-actin 多克隆抗體（上海碧云天生物技術有限公司）；聚偏氟乙烯膜（Millipore 公司，美國）；小鼠抗人 β-catenin 和 SIRT1 單克隆抗體（Abcam 公司，英國）；山羊抗小鼠 Dylight 488 熒光二抗（BD 公司，美國）；小干擾 RNA（small interfering RNA，siRNA）由上海吉凱基因生物技術有限公司合成；PepMute siRNA Transfection Reagent（SignaGen 公司，美國）；Trizol 裂解液（Invitrogen 公司，美國）；SYBR? Green Real-time PCR Master Mix（TOYOBO 公司，日本）；DMEM/F12 培養基（HyClone 公司，美國）；FBS（GIBCO 公司，美國）。光學顯微鏡（Nikon 公司，日本）；熒光顯微鏡（Leica 公司，德國）；分光光度計（HACH 公司，美國）；熒光定量 PCR 儀（ABI 公司，美國）；凝膠成像儀（Bio-Rad 公司，美國）。
1.3 正常和退變髓核組織 β-catenin 和 ECM 比較
1.3.1 β-catenin 免疫組織化學染色觀察
將兩組所分離髓核組織用 4% 多聚甲醛固定后，常規石蠟包埋，5 μm 厚組織切片；二甲苯、梯度乙醇脫蠟至水，3% 雙氧水 37℃ 孵育 10 min，滅活內源性過氧化物酶；PBS 緩沖液漂洗后，滴加 0.25% 胰蛋白酶 37℃ 孵育 30 min，行抗原修復；PBS 緩沖液漂洗后，山羊血清 37℃ 封閉 10 min，濾紙吸干后，滴加合適濃度 β-catenin 一抗（1∶200），4℃ 孵育過夜；第 2 天復溫后，PBS 緩沖液漂洗，滴加生物素標記山羊抗小鼠 IgG 二抗，37℃ 孵育 30 min；PBS 緩沖液漂洗后，DAB 染色，光鏡下控制染色程度，以觀察到棕黃色陽性反應出現再過染 5 s 左右為宜；自來水充分沖洗后，蘇木精復染，常規脫水、透明，中性樹脂封片后，光鏡下觀察髓核組織中 β-catenin 蛋白表達，并計算 β-catenin 陽性表達的細胞比例。
1.3.2 Western blot 檢測
收集兩組髓核組織，加入 RIPA 裂解液，冰上反應 30 min，4℃ 以離心半徑 10 cm、12 000 r/min 離心 5 min 提取總蛋白。Bradford 法檢測蛋白濃度后，以每個樣本 50 μg 蛋白質量進行 SDS-PAGE 凝膠電泳，再將蛋白電轉至聚偏氟乙烯膜上，50 g/L 牛血清白蛋白室溫封閉 1 h，滴加合適濃度的 β-catenin（1∶2 000）、Ⅱ型膠原（1∶500）、聚集蛋白聚糖（Aggrecan）（1∶500）、β-actin（1∶1 000）一抗，4℃ 孵育過夜；第 2 天復溫后，TBST 漂洗，加入對應辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠二抗，37℃ 孵育 1 h，TBST 漂洗后，ECL 顯影，凝膠成像儀拍照。定量檢測采用 Image J 軟件進行灰度統計。
1.4 RES 對 NPC ECM 表達的影響
1.4.1 NPC 分離培養
取退變組髓核組織，參考本課題組既往研究[8]，進行 NPC 培養。步驟如下：將分離后的髓核組織用 2.5 g/L 胰蛋白酶和 2 g/L Ⅱ型膠原酶在 37℃ 序貫消化 3～5 h，200 目細胞篩過濾后，以離心半徑 6.5 cm、800 r/min 離心 5 min 取得細胞沉淀。加入完全培養基（含 20%FBS 的 DMEM/F12 培養基）重懸細胞，調整細胞密度為 2×104個/mL 后種植于 25 cm2 培養瓶中，置于 37℃、5%CO2 培養箱中培養。細胞融合達 90% 左右時 2.5 g/L 胰蛋白酶消化傳代。取第 3 代細胞進行后續實驗。
1.4.2 細胞分組及 Western blot 檢測
將第 3 代 NPC 隨機分為 3 組：A 組為空白對照組，用完全培養基正常培養 24 h；B 組為 IL-1β 組，在培養基中加入 10 ng/mL IL-1β 處理 24 h；C 組為 RES+IL-1β 組，在培養基中分別加入 100 μmol/L RES 和 10 ng/mL IL-1β 處理 24 h。收集 3 組細胞，同 1.3.2 方法采用 Western blot 檢測各組 β-catenin、Ⅱ型膠原和 Aggrecan 蛋白表達。
1.5 siRNA 轉染靶向沉默 SIRT1 和 β-catenin 相關觀測
1.5.1 siRNA 轉染方法
取第 3 代 NPC，以 1×105個/孔密度種植于 6 孔板中，隨機分為 3 組：a 組為未轉染組；b 組為陰性對照組，采用無關序列 siRNA 轉染；c 組為轉染組，采用目標基因（β-catenin-siRNA 或 SIRT1-siRNA）轉染。各組細胞培養第 2 天待細胞融合率達 60%～70% 時，以 30 nmol/L 各 siRNA 混合 PepMute siRNA Transfection Reagent 進行轉染。siRNA 序列：β-catenin 正義 5'-CAGUUGUGGUUAAUCUCUA-3'，反義 5'-GCAACAGAAGCAGAGAGGU-3'；SIRT1 正義 5'-CCAAGCAGCUAAGAGUAAUTT-3'，反義 5'-AUUACUCUUAGCUGCUUGGTT-3'；無關序列 siRNA 正義 5'-CUCUUCGTUCGATUCTUCT-3'，反義 5'-AUUAGGCUUTCUATCGUTA-3'。各組轉染后于 37℃、5%CO2 細胞培養箱孵育 12 h 后，更換為完全培養基，繼續培養 36 h 進行后續檢測。
1.5.2 Western blot 檢測
收集 3 組細胞，同 1.3.2 方法采用 Western blot 檢測各組 β-catenin 和 SIRT1 蛋白表達，其中 SIRT1 一抗（1∶1 000）。
1.5.3 實時熒光定量 PCR 檢測
收集 3 組細胞，采用 Trizol 法提取總 RNA，采用分光光度計測定 RNA 濃度和純度后，行實時熒光定量 PCR 檢測 β-catenin 和 SIRT1 的 mRNA 表達。逆轉錄為 cDNA 后，采用 SYBR? Green Real-time PCR Master Mix 檢測，以 GAPDH 基因作為內參，標準化反應體系。各基因引物序列見表 1。反應條件：95℃ 預變性 3 min，95℃ 變性 20 s，60℃ 退火 30 s，72℃ 延伸 20 s，35 個循環。采用 2–ΔΔCt法計算各靶基因相對表達量。
表1
實時熒光定量 PCR 目的基因引物序列
Table1.
Primer sequences for target genes detected by real-time fluorescence quantitative PCR
1.6 RES 調控 ECM 表達的信號通路檢測
1.6.1 細胞免疫熒光染色檢測 β-catenin 核轉位情況
取狀態良好的第 3 代 NPC 以 1×105個/孔密度種植于 6 孔板中，行常規細胞爬片，第 2 天待細胞融合度達 50% 左右即棄去培養基。將 NPC 隨機分為 4 組，分別為：1 組（空白對照組），用完全培養基培養 24 h；2 組（IL-1β 組），在完全培養基中加入 10 ng/mL IL-1β 培養 24 h；3 組（RES 組），在完全培養基中分別加入 100 μmol/L RES 和 10 ng/mL IL-1β 培養 24 h；4 組（SIRT1-siRNA 組），SIRT1-siRNA 轉染后分別加入 100 μmol/L RES 和 10 ng/mL IL-1β 培養 24 h。PBS 緩沖液漂洗后加入 4% 多聚甲醛室溫下固定 10 min，PBS 漂洗后加入 5% 牛血清白蛋白封閉液 37℃ 孵育 30 min，濾紙吸干封閉液，加入 β-catenin 抗體，4℃ 孵育過夜。第 2 天復溫后，PBS 漂洗，加入山羊抗小鼠 Dylight 488 熒光二抗，37℃ 孵育 1 h，PBS 漂洗后加入 DAPI 室溫染核 1 min，滴加適量抗熒光淬滅封片液封片，熒光顯微鏡下觀察。
1.6.2 Western blot 檢測
將第 3 代 NPC 隨機分為 5 組，分別為：Ⅰ組（空白對照組），用完全培養基培養 24 h；Ⅱ組（IL-1β 組），在完全培養基中加入 10 ng/mL IL-1β 培養 24 h；Ⅲ組（IL-1β+β-catenin-siRNA 組），β-catenin-siRNA 轉染后再加入 10 ng/mL IL-1β 培養 24 h；Ⅳ組（IL-1β+RES 組），在完全培養基中分別加入 100 μmol/L RES 和 10 ng/mL IL-1β 培養 24 h；Ⅴ組（IL-1β+RES+SIRT1-siRNA 組），SIRT1-siRNA 轉染后分別加入 100 μmol/L RES 和 10 ng/mL IL-1β 培養 24 h。同 1.3.2 方法采用 Western blot 檢測各組Ⅱ型膠原和 Aggrecan 蛋白表達。
1.7 統計學方法
采用 SPSS19.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，用 Levene 法行方差齊性檢驗，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 Bonferroni 法；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 正常和退變髓核組織 β-catenin 和 ECM 比較
2.1.1 免疫組織化學染色觀察
對照組和退變組髓核組織中均能檢測到 β-catenin 蛋白，且表達部位為細胞內。但退變組髓核組織中 β-catenin 陽性表達的細胞比例為 33.7%±7.1%，明顯高于對照組的 11.3%±4.5%，差異有統計學意義（t=4.616，P=0.010）。見圖 1。
2.1.2 Western blot 檢測
與對照組比較，退變組 β-catenin 蛋白相對表達量顯著升高，Ⅱ型膠原和 Aggrecan 蛋白相對表達量顯著下降，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 2。
2.2 RES 對 NPC ECM 表達的影響
Western blot 檢測示，B 組 β-catenin 蛋白相對表達量顯著高于 A、C 組，Ⅱ型膠原和 Aggrecan 相對表達量顯著低于 A、C 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；A、C 組間比較各蛋白相對表達量差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 3。
2.3 siRNA 轉染靶向沉默 β-catenin 和 SIRT1 表達相關觀測
Western blot 檢測及實時熒光定量 PCR 檢測均顯示，c 組 β-catenin、SIRT1 蛋白及基因相對表達量均顯著低于 a、b 組，差異有統計學意義（P<0.05）；a、b 組間 β-catenin 和 SIRT1 蛋白及基因相對表達量比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 4、5。
2.4 RES 調控 ECM 表達的信號通路檢測
2.4.1 細胞免疫熒光染色檢測 β-catenin 核轉位情況
熒光顯微鏡觀察示，1 組 β-catenin 蛋白散在表達于細胞質內，細胞質呈現綠色熒光；2 組 NPC 在 IL-1β 刺激下，β-catenin 主要呈現細胞核內表達，細胞核表達綠色熒光，與 DAPI 染色的細胞核相互重合，提示核轉錄；3 組在 RES 作用下，IL-1β 所誘導的 β-catenin 明顯減弱，又散在表達于細胞質內；4 組 NPC 轉染 SIRT1-siRNA 后，RES 對 β-catenin 的核轉錄抑制作用被削弱，細胞核顯示綠色熒光。見圖 6。
2.4.2 Western blot 檢測
與Ⅰ組 NPC 相比，Ⅱ組細胞Ⅱ型膠原和 Aggrecan 蛋白表達明顯降低（P<0.05）；而Ⅲ組 NPC 轉染 β-catenin-siRNA 后，IL-1β 對 ECM 的降解作用被明顯抑制，與Ⅱ組相比Ⅱ型膠原和 Aggrecan 蛋白表達明顯升高（P<0.05）；進一步比較發現，當Ⅴ組 NPC 轉染 SIRT1-siRNA 后，抑制了 RES 對 ECM 降解的保護作用，與Ⅳ組相比Ⅱ型膠原和 Aggrecan 蛋白表達明顯降低（P<0.05）。見圖 7。
圖1
免疫組織化學染色檢測兩組髓核組織 β-catenin 蛋白表達（×200）
箭頭示 β-catenin 表達陽性細胞 a. 對照組；b. 退變組
Figure1. Protein expression of β-catenin in nucleus pulposus tissue by immunohistochemical staining (×200)Arrow indicated β-catenin positive cells a. Control group; b. Degeneration group
圖2
Western blot 檢測兩組髓核組織中 β-catenin、Ⅱ型膠原和 Aggrecan 蛋白表達
a. 電泳圖 1：對照組 2：退變組；b. 各蛋白相對表達量
Figure2. Protein expressions of β-catenin, collagen type Ⅱ, and Aggrecan in nucleus pulposus tissue by Western blota. Electrophoregram 1: Control group 2: Degeneration group; b. The relative expression of each protein
圖3
Western blot 檢測 3 組 NPC 中 β-catenin、Ⅱ型膠原和 Aggrecan 蛋白表達
a. 電泳圖 1：A 組 2：B 組 3：C 組；b. 各蛋白相對表達量
Figure3. Protein expressions of β-catenin, collagen type Ⅱ, and Aggrecan in NPC by Western blota. Electrophoregram 1: Group A 2: Group B 3: Group C; b. The relative expression of each protein
圖4
Western blot 檢測 siRNA 干擾實驗 3 組 NPC β-catenin、SIRT1 蛋白表達
a. 電泳圖 1：a 組 2：b 組 3：c 組；b. 各蛋白相對表達量
Figure4. Protein expressions of β-catenin and SIRT1 in NPC in siRNA interference experiment by Western blota. Electrophoregram 1: Group a 2: Group b 3: Group c; b. The relative expression of each protein
圖5
實時熒光定量 PCR 檢測 siRNA 干擾實驗 3 組 NPC β- catenin、SIRT1 基因相對表達量
Figure5.
The mRNA relative expressions of β-catenin and SIRT1 in NPC in siRNA interference experiment by real-time fluorescence quantitative PCR
圖6
細胞免疫熒光染色檢測各組 β-catenin 核轉位情況
從左至右依次為 β-catenin、DAPI、二者重疊 a. 1 組；b. 2 組；c. 3 組；d. 4 組
Figure6. Nuclear translocation of β-catenin detected by cell immunofluorescence stainingFrom left to right for β-catenin, DAPI, and merge a. Group 1; b. Group 2; c. Group 3; d. Group 4
圖7
Western blot 檢測 RES 通過 SIRT1 調控各組Ⅱ型膠原和 Aggrecan 蛋白表達
a. 電泳圖 1：Ⅰ組 2：Ⅱ組 3：Ⅲ組 4：Ⅳ組5：Ⅴ組；b. 各蛋白相對表達量
Figure7. Protein expressions of collagen type Ⅱ and Aggrecan regulated by RES through SIRT1 by Western blota. Electrophoregram 1: GroupⅠ 2: Group Ⅱ 3: Group Ⅲ 4: Group Ⅳ 5: Group Ⅴ; b. The relative expression of each protein
3 討論
髓核組織 ECM 代謝紊亂是椎間盤退變的重要特征，通過提高 ECM 合成從而恢復椎間盤的生物學特性，是治療 IVDD 的有效策略[8]。RES 是一種天然多酚類物質，富含于葡萄、虎杖、花生等植物中[9]，本課題組已發表的多項研究均提示 RES 可以抑制 NPC 凋亡，提高 ECM 表達[10-13]，但潛在機制目前還不清楚，限制了其進一步臨床推廣。本實驗中首先選用正常和退變的髓核組織進行原位比較發現，β-catenin 在退變組中的表達明顯增高，而 ECM 主要成分Ⅱ型膠原和 Aggrecan 的表達卻明顯下降。因此經典 Wnt/β-catenin 信號通路是否參與了 RES 對 NPC ECM 的調控，成為了本研究的興趣點。
在骨科領域，經典 Wnt/β-catenin 信號通路對成骨分化的作用研究最為廣泛，是抗骨質疏松治療中一個重要的調控靶點[14]。近年來越來越多證據表明，該信號通路同樣在軟骨的合成代謝中發揮著重要作用。Miyamoto 等[15]報道可以通過抑制 Wnt/β-catenin 通路來延緩軟骨退變。而 Buchtova 等[16]研究表明，激活 Wnt/β-catenin 通路可以抑制軟骨細胞分化。因為軟骨和 NPC 有著相似的表型[17]，且本課題組前期研究表明炎性因子 IL-1β 對 NPC 具有明顯的促分解代謝作用[18]；在椎間盤退變進程中，IL-1β 被認為是最重要的 ECM 促分解炎性因子[19]，本實驗中 IL-1β 被用于誘導 ECM 降解。因此，本實驗進一步探討了 RES 單獨或聯合 IL-1β 作用下，對 NPC 中 β-catenin 的影響。結果表明 IL-1β 可以提高 β-catenin 表達，同時降低Ⅱ型膠原和 Aggrecan 合成；而 RES 加入后則逆轉了這種趨勢，RES 組的 β-catenin 表達降低，而 ECM 表達增高。這一結果初步證明了在 NPC 中，RES 可以影響 Wnt/β-catenin 通路，并對 ECM 表達具有調控作用。
雖然 RES 一直被認為是 SIRT1 的天然激動劑，但其在細胞內的作用靶點十分廣泛[20]。為了進一步明確 Wnt/β-catenin 通路在 RES 調控 ECM 的表達是以 SIRT1 為靶點的，我們采用了 siRNA 靶向抑制 β-catenin 和 SIRT1 的表達。當 SIRT1 被 siRNA 沉默后，RES 對 ECM 的保護作用被減弱，同時 β-catenin 發生了更明顯的核轉移，提示 RES 是以 SIRT1 為靶點來調控下游 Wnt/β-catenin 通路的，從而調控了 ECM 表達。而當 β-catenin 表達抑制后，產生了與 RES 相似的 ECM 保護作用，IL-1β 所介導的Ⅱ型膠原和 Aggrecan 表達下降現象減弱。
綜上述，本研究首次證實了 RES 以 SIRT1 為靶點，通過經典 Wnt/β-catenin 信號通路可以減少炎性因子 IL-1β 所介導的 ECM 降解，維持 ECM 的合成穩定，從而維持椎間盤的正常生理功能，為 IVDD 的治療提供了理論依據。
椎間盤退變被認為是多數脊柱疾患的始發因素，在當今人口老齡化社會，椎間盤退行性疾病（intervertebral disc degenerative disease，IVDD）因其高發病率和高致殘率，日益成為嚴重的公共健康問題[1]。一個正常的椎間盤組織包括上下軟骨終板、周圍纖維環以及包裹在中間的凍膠樣髓核組織。健康椎間盤的生物學意義在于緩沖脊柱的機械應力，為脊柱節段活動提供銜接。而髓核組織中的細胞外基質（extracellular matrix，ECM）是維持這一生物學功能的關鍵[2]。白藜蘆醇（resveratrol，RES）是一種細胞內沉默信息調節 2 同源物 1（SIRT1）的天然激動劑，本課題組前期研究表明 RES 可促進髓核細胞（nucleus pulposus cells，NPC）ECM 的表達，維持其細胞表型[3]，但具體作用機制并不清楚。
經典 Wnt/β-catenin 信號通路是細胞內信號傳導途徑的重要組成部分，參與調控增殖、分化、再生等多種細胞功能[4]。已有大量研究表明 Wnt/β-catenin 信號通路可以調控軟骨細胞 ECM 的表達，激活該通路會加速軟骨退變[5]。NPC 與軟骨細胞有著相似的細胞表型，因此近年來該信號通路在椎間盤生理病理中的作用越來越受到關注[6]。本研究擬以臨床摘取的髓核組織為研究對象，通過組織學和細胞學實驗，探討經典 Wnt/β-catenin 信號通路是否參與了 RES 對 NPC ECM 表達的調控，為 RES 進一步應用于臨床治療 IVDD 提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 標本來源及分組
椎間盤標本來源于重慶醫科大學附屬第一醫院骨科接受椎間盤摘除術的 10 例患者，其中 5 例術前診斷為脊柱爆裂骨折，年齡（33.2±7.6）歲，入院前無腰痛病史，設為對照組；余 5 例術前診斷為腰椎間盤突出癥，年齡（64.4±8.1）歲，設為退變組。椎間盤退變程度參照術前 MRI 的 Pfirrmann 分級[7]，其中對照組 1 級 1 例，2 級 4 例；退變組 3 級 1 例，4 級 3 例，5 級 1 例。將術中所取椎間盤組織放入無菌培養袋中，迅速帶回實驗室，在超凈臺用眼科剪和鑷，根據組織的大體形態仔細分離髓核組織，進行后續實驗。本研究方案獲重慶醫科大學倫理委員會批準，所有患者術前均簽署知情同意書。
1.2 主要試劑及儀器
免疫組織化學染色試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）；RIPA 裂解液、Bradford 法蛋白濃度檢測試劑盒、SDS-PAGE 配膠試劑盒、牛血清白蛋白、小鼠抗人 β-actin 多克隆抗體（上海碧云天生物技術有限公司）；聚偏氟乙烯膜（Millipore 公司，美國）；小鼠抗人 β-catenin 和 SIRT1 單克隆抗體（Abcam 公司，英國）；山羊抗小鼠 Dylight 488 熒光二抗（BD 公司，美國）；小干擾 RNA（small interfering RNA，siRNA）由上海吉凱基因生物技術有限公司合成；PepMute siRNA Transfection Reagent（SignaGen 公司，美國）；Trizol 裂解液（Invitrogen 公司，美國）；SYBR? Green Real-time PCR Master Mix（TOYOBO 公司，日本）；DMEM/F12 培養基（HyClone 公司，美國）；FBS（GIBCO 公司，美國）。光學顯微鏡（Nikon 公司，日本）；熒光顯微鏡（Leica 公司，德國）；分光光度計（HACH 公司，美國）；熒光定量 PCR 儀（ABI 公司，美國）；凝膠成像儀（Bio-Rad 公司，美國）。
1.3 正常和退變髓核組織 β-catenin 和 ECM 比較
1.3.1 β-catenin 免疫組織化學染色觀察
將兩組所分離髓核組織用 4% 多聚甲醛固定后，常規石蠟包埋，5 μm 厚組織切片；二甲苯、梯度乙醇脫蠟至水，3% 雙氧水 37℃ 孵育 10 min，滅活內源性過氧化物酶；PBS 緩沖液漂洗后，滴加 0.25% 胰蛋白酶 37℃ 孵育 30 min，行抗原修復；PBS 緩沖液漂洗后，山羊血清 37℃ 封閉 10 min，濾紙吸干后，滴加合適濃度 β-catenin 一抗（1∶200），4℃ 孵育過夜；第 2 天復溫后，PBS 緩沖液漂洗，滴加生物素標記山羊抗小鼠 IgG 二抗，37℃ 孵育 30 min；PBS 緩沖液漂洗后，DAB 染色，光鏡下控制染色程度，以觀察到棕黃色陽性反應出現再過染 5 s 左右為宜；自來水充分沖洗后，蘇木精復染，常規脫水、透明，中性樹脂封片后，光鏡下觀察髓核組織中 β-catenin 蛋白表達，并計算 β-catenin 陽性表達的細胞比例。
1.3.2 Western blot 檢測
收集兩組髓核組織，加入 RIPA 裂解液，冰上反應 30 min，4℃ 以離心半徑 10 cm、12 000 r/min 離心 5 min 提取總蛋白。Bradford 法檢測蛋白濃度后，以每個樣本 50 μg 蛋白質量進行 SDS-PAGE 凝膠電泳，再將蛋白電轉至聚偏氟乙烯膜上，50 g/L 牛血清白蛋白室溫封閉 1 h，滴加合適濃度的 β-catenin（1∶2 000）、Ⅱ型膠原（1∶500）、聚集蛋白聚糖（Aggrecan）（1∶500）、β-actin（1∶1 000）一抗，4℃ 孵育過夜；第 2 天復溫后，TBST 漂洗，加入對應辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠二抗，37℃ 孵育 1 h，TBST 漂洗后，ECL 顯影，凝膠成像儀拍照。定量檢測采用 Image J 軟件進行灰度統計。
1.4 RES 對 NPC ECM 表達的影響
1.4.1 NPC 分離培養
取退變組髓核組織，參考本課題組既往研究[8]，進行 NPC 培養。步驟如下：將分離后的髓核組織用 2.5 g/L 胰蛋白酶和 2 g/L Ⅱ型膠原酶在 37℃ 序貫消化 3～5 h，200 目細胞篩過濾后，以離心半徑 6.5 cm、800 r/min 離心 5 min 取得細胞沉淀。加入完全培養基（含 20%FBS 的 DMEM/F12 培養基）重懸細胞，調整細胞密度為 2×104個/mL 后種植于 25 cm2 培養瓶中，置于 37℃、5%CO2 培養箱中培養。細胞融合達 90% 左右時 2.5 g/L 胰蛋白酶消化傳代。取第 3 代細胞進行后續實驗。
1.4.2 細胞分組及 Western blot 檢測
將第 3 代 NPC 隨機分為 3 組：A 組為空白對照組，用完全培養基正常培養 24 h；B 組為 IL-1β 組，在培養基中加入 10 ng/mL IL-1β 處理 24 h；C 組為 RES+IL-1β 組，在培養基中分別加入 100 μmol/L RES 和 10 ng/mL IL-1β 處理 24 h。收集 3 組細胞，同 1.3.2 方法采用 Western blot 檢測各組 β-catenin、Ⅱ型膠原和 Aggrecan 蛋白表達。
1.5 siRNA 轉染靶向沉默 SIRT1 和 β-catenin 相關觀測
1.5.1 siRNA 轉染方法
取第 3 代 NPC，以 1×105個/孔密度種植于 6 孔板中，隨機分為 3 組：a 組為未轉染組；b 組為陰性對照組，采用無關序列 siRNA 轉染；c 組為轉染組，采用目標基因（β-catenin-siRNA 或 SIRT1-siRNA）轉染。各組細胞培養第 2 天待細胞融合率達 60%～70% 時，以 30 nmol/L 各 siRNA 混合 PepMute siRNA Transfection Reagent 進行轉染。siRNA 序列：β-catenin 正義 5'-CAGUUGUGGUUAAUCUCUA-3'，反義 5'-GCAACAGAAGCAGAGAGGU-3'；SIRT1 正義 5'-CCAAGCAGCUAAGAGUAAUTT-3'，反義 5'-AUUACUCUUAGCUGCUUGGTT-3'；無關序列 siRNA 正義 5'-CUCUUCGTUCGATUCTUCT-3'，反義 5'-AUUAGGCUUTCUATCGUTA-3'。各組轉染后于 37℃、5%CO2 細胞培養箱孵育 12 h 后，更換為完全培養基，繼續培養 36 h 進行后續檢測。
1.5.2 Western blot 檢測
收集 3 組細胞，同 1.3.2 方法采用 Western blot 檢測各組 β-catenin 和 SIRT1 蛋白表達，其中 SIRT1 一抗（1∶1 000）。
1.5.3 實時熒光定量 PCR 檢測
收集 3 組細胞，采用 Trizol 法提取總 RNA，采用分光光度計測定 RNA 濃度和純度后，行實時熒光定量 PCR 檢測 β-catenin 和 SIRT1 的 mRNA 表達。逆轉錄為 cDNA 后，采用 SYBR? Green Real-time PCR Master Mix 檢測，以 GAPDH 基因作為內參，標準化反應體系。各基因引物序列見表 1。反應條件：95℃ 預變性 3 min，95℃ 變性 20 s，60℃ 退火 30 s，72℃ 延伸 20 s，35 個循環。采用 2–ΔΔCt法計算各靶基因相對表達量。
表1
實時熒光定量 PCR 目的基因引物序列
Table1.
Primer sequences for target genes detected by real-time fluorescence quantitative PCR
1.6 RES 調控 ECM 表達的信號通路檢測
1.6.1 細胞免疫熒光染色檢測 β-catenin 核轉位情況
取狀態良好的第 3 代 NPC 以 1×105個/孔密度種植于 6 孔板中，行常規細胞爬片，第 2 天待細胞融合度達 50% 左右即棄去培養基。將 NPC 隨機分為 4 組，分別為：1 組（空白對照組），用完全培養基培養 24 h；2 組（IL-1β 組），在完全培養基中加入 10 ng/mL IL-1β 培養 24 h；3 組（RES 組），在完全培養基中分別加入 100 μmol/L RES 和 10 ng/mL IL-1β 培養 24 h；4 組（SIRT1-siRNA 組），SIRT1-siRNA 轉染后分別加入 100 μmol/L RES 和 10 ng/mL IL-1β 培養 24 h。PBS 緩沖液漂洗后加入 4% 多聚甲醛室溫下固定 10 min，PBS 漂洗后加入 5% 牛血清白蛋白封閉液 37℃ 孵育 30 min，濾紙吸干封閉液，加入 β-catenin 抗體，4℃ 孵育過夜。第 2 天復溫后，PBS 漂洗，加入山羊抗小鼠 Dylight 488 熒光二抗，37℃ 孵育 1 h，PBS 漂洗后加入 DAPI 室溫染核 1 min，滴加適量抗熒光淬滅封片液封片，熒光顯微鏡下觀察。
1.6.2 Western blot 檢測
將第 3 代 NPC 隨機分為 5 組，分別為：Ⅰ組（空白對照組），用完全培養基培養 24 h；Ⅱ組（IL-1β 組），在完全培養基中加入 10 ng/mL IL-1β 培養 24 h；Ⅲ組（IL-1β+β-catenin-siRNA 組），β-catenin-siRNA 轉染后再加入 10 ng/mL IL-1β 培養 24 h；Ⅳ組（IL-1β+RES 組），在完全培養基中分別加入 100 μmol/L RES 和 10 ng/mL IL-1β 培養 24 h；Ⅴ組（IL-1β+RES+SIRT1-siRNA 組），SIRT1-siRNA 轉染后分別加入 100 μmol/L RES 和 10 ng/mL IL-1β 培養 24 h。同 1.3.2 方法采用 Western blot 檢測各組Ⅱ型膠原和 Aggrecan 蛋白表達。
1.7 統計學方法
采用 SPSS19.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，用 Levene 法行方差齊性檢驗，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 Bonferroni 法；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 正常和退變髓核組織 β-catenin 和 ECM 比較
2.1.1 免疫組織化學染色觀察
對照組和退變組髓核組織中均能檢測到 β-catenin 蛋白，且表達部位為細胞內。但退變組髓核組織中 β-catenin 陽性表達的細胞比例為 33.7%±7.1%，明顯高于對照組的 11.3%±4.5%，差異有統計學意義（t=4.616，P=0.010）。見圖 1。
2.1.2 Western blot 檢測
與對照組比較，退變組 β-catenin 蛋白相對表達量顯著升高，Ⅱ型膠原和 Aggrecan 蛋白相對表達量顯著下降，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 2。
2.2 RES 對 NPC ECM 表達的影響
Western blot 檢測示，B 組 β-catenin 蛋白相對表達量顯著高于 A、C 組，Ⅱ型膠原和 Aggrecan 相對表達量顯著低于 A、C 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；A、C 組間比較各蛋白相對表達量差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 3。
2.3 siRNA 轉染靶向沉默 β-catenin 和 SIRT1 表達相關觀測
Western blot 檢測及實時熒光定量 PCR 檢測均顯示，c 組 β-catenin、SIRT1 蛋白及基因相對表達量均顯著低于 a、b 組，差異有統計學意義（P<0.05）；a、b 組間 β-catenin 和 SIRT1 蛋白及基因相對表達量比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 4、5。
2.4 RES 調控 ECM 表達的信號通路檢測
2.4.1 細胞免疫熒光染色檢測 β-catenin 核轉位情況
熒光顯微鏡觀察示，1 組 β-catenin 蛋白散在表達于細胞質內，細胞質呈現綠色熒光；2 組 NPC 在 IL-1β 刺激下，β-catenin 主要呈現細胞核內表達，細胞核表達綠色熒光，與 DAPI 染色的細胞核相互重合，提示核轉錄；3 組在 RES 作用下，IL-1β 所誘導的 β-catenin 明顯減弱，又散在表達于細胞質內；4 組 NPC 轉染 SIRT1-siRNA 后，RES 對 β-catenin 的核轉錄抑制作用被削弱，細胞核顯示綠色熒光。見圖 6。
2.4.2 Western blot 檢測
與Ⅰ組 NPC 相比，Ⅱ組細胞Ⅱ型膠原和 Aggrecan 蛋白表達明顯降低（P<0.05）；而Ⅲ組 NPC 轉染 β-catenin-siRNA 后，IL-1β 對 ECM 的降解作用被明顯抑制，與Ⅱ組相比Ⅱ型膠原和 Aggrecan 蛋白表達明顯升高（P<0.05）；進一步比較發現，當Ⅴ組 NPC 轉染 SIRT1-siRNA 后，抑制了 RES 對 ECM 降解的保護作用，與Ⅳ組相比Ⅱ型膠原和 Aggrecan 蛋白表達明顯降低（P<0.05）。見圖 7。
圖1
免疫組織化學染色檢測兩組髓核組織 β-catenin 蛋白表達（×200）
箭頭示 β-catenin 表達陽性細胞 a. 對照組；b. 退變組
Figure1. Protein expression of β-catenin in nucleus pulposus tissue by immunohistochemical staining (×200)Arrow indicated β-catenin positive cells a. Control group; b. Degeneration group
圖2
Western blot 檢測兩組髓核組織中 β-catenin、Ⅱ型膠原和 Aggrecan 蛋白表達
a. 電泳圖 1：對照組 2：退變組；b. 各蛋白相對表達量
Figure2. Protein expressions of β-catenin, collagen type Ⅱ, and Aggrecan in nucleus pulposus tissue by Western blota. Electrophoregram 1: Control group 2: Degeneration group; b. The relative expression of each protein
圖3
Western blot 檢測 3 組 NPC 中 β-catenin、Ⅱ型膠原和 Aggrecan 蛋白表達
a. 電泳圖 1：A 組 2：B 組 3：C 組；b. 各蛋白相對表達量
Figure3. Protein expressions of β-catenin, collagen type Ⅱ, and Aggrecan in NPC by Western blota. Electrophoregram 1: Group A 2: Group B 3: Group C; b. The relative expression of each protein
圖4
Western blot 檢測 siRNA 干擾實驗 3 組 NPC β-catenin、SIRT1 蛋白表達
a. 電泳圖 1：a 組 2：b 組 3：c 組；b. 各蛋白相對表達量
Figure4. Protein expressions of β-catenin and SIRT1 in NPC in siRNA interference experiment by Western blota. Electrophoregram 1: Group a 2: Group b 3: Group c; b. The relative expression of each protein
圖5
實時熒光定量 PCR 檢測 siRNA 干擾實驗 3 組 NPC β- catenin、SIRT1 基因相對表達量
Figure5.
The mRNA relative expressions of β-catenin and SIRT1 in NPC in siRNA interference experiment by real-time fluorescence quantitative PCR
圖6
細胞免疫熒光染色檢測各組 β-catenin 核轉位情況
從左至右依次為 β-catenin、DAPI、二者重疊 a. 1 組；b. 2 組；c. 3 組；d. 4 組
Figure6. Nuclear translocation of β-catenin detected by cell immunofluorescence stainingFrom left to right for β-catenin, DAPI, and merge a. Group 1; b. Group 2; c. Group 3; d. Group 4
圖7
Western blot 檢測 RES 通過 SIRT1 調控各組Ⅱ型膠原和 Aggrecan 蛋白表達
a. 電泳圖 1：Ⅰ組 2：Ⅱ組 3：Ⅲ組 4：Ⅳ組5：Ⅴ組；b. 各蛋白相對表達量
Figure7. Protein expressions of collagen type Ⅱ and Aggrecan regulated by RES through SIRT1 by Western blota. Electrophoregram 1: GroupⅠ 2: Group Ⅱ 3: Group Ⅲ 4: Group Ⅳ 5: Group Ⅴ; b. The relative expression of each protein
3 討論
髓核組織 ECM 代謝紊亂是椎間盤退變的重要特征，通過提高 ECM 合成從而恢復椎間盤的生物學特性，是治療 IVDD 的有效策略[8]。RES 是一種天然多酚類物質，富含于葡萄、虎杖、花生等植物中[9]，本課題組已發表的多項研究均提示 RES 可以抑制 NPC 凋亡，提高 ECM 表達[10-13]，但潛在機制目前還不清楚，限制了其進一步臨床推廣。本實驗中首先選用正常和退變的髓核組織進行原位比較發現，β-catenin 在退變組中的表達明顯增高，而 ECM 主要成分Ⅱ型膠原和 Aggrecan 的表達卻明顯下降。因此經典 Wnt/β-catenin 信號通路是否參與了 RES 對 NPC ECM 的調控，成為了本研究的興趣點。
在骨科領域，經典 Wnt/β-catenin 信號通路對成骨分化的作用研究最為廣泛，是抗骨質疏松治療中一個重要的調控靶點[14]。近年來越來越多證據表明，該信號通路同樣在軟骨的合成代謝中發揮著重要作用。Miyamoto 等[15]報道可以通過抑制 Wnt/β-catenin 通路來延緩軟骨退變。而 Buchtova 等[16]研究表明，激活 Wnt/β-catenin 通路可以抑制軟骨細胞分化。因為軟骨和 NPC 有著相似的表型[17]，且本課題組前期研究表明炎性因子 IL-1β 對 NPC 具有明顯的促分解代謝作用[18]；在椎間盤退變進程中，IL-1β 被認為是最重要的 ECM 促分解炎性因子[19]，本實驗中 IL-1β 被用于誘導 ECM 降解。因此，本實驗進一步探討了 RES 單獨或聯合 IL-1β 作用下，對 NPC 中 β-catenin 的影響。結果表明 IL-1β 可以提高 β-catenin 表達，同時降低Ⅱ型膠原和 Aggrecan 合成；而 RES 加入后則逆轉了這種趨勢，RES 組的 β-catenin 表達降低，而 ECM 表達增高。這一結果初步證明了在 NPC 中，RES 可以影響 Wnt/β-catenin 通路，并對 ECM 表達具有調控作用。
雖然 RES 一直被認為是 SIRT1 的天然激動劑，但其在細胞內的作用靶點十分廣泛[20]。為了進一步明確 Wnt/β-catenin 通路在 RES 調控 ECM 的表達是以 SIRT1 為靶點的，我們采用了 siRNA 靶向抑制 β-catenin 和 SIRT1 的表達。當 SIRT1 被 siRNA 沉默后，RES 對 ECM 的保護作用被減弱，同時 β-catenin 發生了更明顯的核轉移，提示 RES 是以 SIRT1 為靶點來調控下游 Wnt/β-catenin 通路的，從而調控了 ECM 表達。而當 β-catenin 表達抑制后，產生了與 RES 相似的 ECM 保護作用，IL-1β 所介導的Ⅱ型膠原和 Aggrecan 表達下降現象減弱。
綜上述，本研究首次證實了 RES 以 SIRT1 為靶點，通過經典 Wnt/β-catenin 信號通路可以減少炎性因子 IL-1β 所介導的 ECM 降解，維持 ECM 的合成穩定，從而維持椎間盤的正常生理功能，為 IVDD 的治療提供了理論依據。
