引用本文： 蔡潔云, 林博杰, 潘新元, 崔佳, PradhanRohan, 殷國前. 天然水蛭素聯合高壓氧治療對大鼠隨意皮瓣成活的影響研究. 中國修復重建外科雜志, 2018, 32(4): 484-490. doi: 10.7507/1002-1892.201711135 復制
皮瓣移植是整形外科修復各種組織缺損的一種重要手段。隨意皮瓣因其轉移靈活、術式簡單而被廣泛應用。但隨意皮瓣由于不含知名血管，皮瓣血液供應主要依靠蒂部皮膚及筋膜內的血管網，因而受皮瓣長寬比例的影響，若皮瓣發生血液循環障礙未得到及時糾正，會造成皮瓣部分或全部壞死[1]。因此，改善移植術后皮瓣的血液供應，減少炎性反應，對提高皮瓣的成活率至關重要。
近年來，高壓氧作為一種新的治療方法逐漸受到臨床重視。目前，學者們主要在提高腦和脊髓的缺血缺氧耐受[2]、抗凋亡[3-4]及抑制炎癥[5]等方面，對高壓氧的作用進行一系列研究。在整形外科領域，有報道將高壓氧用于組織缺損修復和移植術后的輔助治療[6-7]。有研究表明，高壓氧處理對移植皮瓣的成活具有一定促進作用[8-9] 。水蛭素是天然的凝血酶拮抗劑，其能與凝血酶受體特異性結合而具備抗凝效應，可起到預防血栓形成、改善皮瓣微循環、提高組織血流灌注量的作用。本課題組前期實驗也發現，天然水蛭素能通過促血管生成、抑制炎性反應等方面改善淤血皮瓣的微循環，從而促進移植后隨意皮瓣的成活[10-11]。目前，有關高壓氧和水蛭素兩者在皮瓣移植中的聯合應用鮮有報道。本研究通過探討高壓氧聯合水蛭素治療對移植術后皮瓣組織中微血管密度（microvessel density，MVD）、TNF-α 的影響及其與皮瓣成活的關系，旨在為兩者用于臨床促進移植術后皮瓣成活提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
健康 SD 大鼠 72 只，雌雄不限，體質量（275±15）g，購自廣西醫科大學實驗動物中心。天然水蛭素凍干粉（南寧凈雪皇生物工程有限公司）。兔抗大鼠 CD34 單克隆抗體、兔抗大鼠 TNF-α 多克隆抗體（Abcam 公司，英國）；免疫組織化學染色試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）。Olympus-BX50 顯微鏡（Olympus 公司，日本）；Image Pro-Plus 6.0 軟件（Media Cybernetics 公司，美國）。
1.2 實驗分組及方法
1.2.1 大鼠隨意皮瓣移植模型制備
取 72 只 SD 大鼠，腹腔注射 10% 水合氯醛（3 mL/kg）麻醉后，在其背部設計一個面積為 10.0 cm×2.5 cm 的超長隨意皮瓣。無菌條件下，按設計線切開皮膚至深筋膜層，分離并掀起皮瓣，如有軸型血管將其切斷，保證皮瓣不攜帶軸型血管，徹底止血后皮瓣原位縫合。
1.2.2 實驗分組及方法
將大鼠隨意皮瓣移植模型隨機分為對照組、高壓氧組、水蛭素組和聯合組（水蛭素+高壓氧治療），每組 18 只。對照組：術后即刻及之后 4 d 內每天皮下注射生理鹽水，皮瓣注射點選擇為距蒂部 7.5、5.0、2.5 cm 處，每處各 2 個點，每個點注射 0.1 mL。高壓氧組：同對照組方法注射生理鹽水，同時術后 4 d 內每天行高壓氧治療 2 次，每次間隔 6 h。水蛭素組：參照對照組方法皮下注射天然水蛭素，每個點注射 0.1 mL，含 10 ATU。聯合組：參照水蛭素組注射天然水蛭素，同時參照高壓氧組行高壓氧治療。
高壓氧治療方法參考 Liu 等[8]實驗方法和本課題組前期實驗經驗[12]。具體步驟：將大鼠置于大型空氣加壓艙內的自制實驗動物容器中，對艙內進行空氣加壓 20 min，使艙內壓力達到 2.0 ATA，穩壓 60 min，加壓開始時即對實驗動物容器通氧，連續監測容器中氧濃度，穩壓期間將氧濃度維持在 98% 以上，開始減壓時即停止通氧，減壓 20 min。
1.3 觀測指標
1.3.1 大體觀察
術后第 2、4、6 天觀察大鼠皮瓣色澤、質地、有無水腫、有無滲出、有無破潰以及成活情況。術后第 6 天各組取 6 只大鼠同上法麻醉后，數碼相機攝背部皮瓣照片，采用 Image Pro-Plus 6.0 軟件計算皮瓣成活率。皮瓣成活率=皮瓣成活面積/皮瓣面積×100%。
1.3.2 組織學觀察
術后第 2、4 天各組分別取 6 只大鼠，同上法麻醉后，切取皮瓣距尾端 3～4 cm 處組織，置于 10% 甲醛固定 24 h 后，脫水、包埋、切片，片厚 3μm，取部分切片行 HE 染色，顯微鏡下觀察皮瓣組織中微血管結構、炎性細胞數量及壞死情況。
1.3.3 免疫組織化學染色
術后第 2、4 天取 1.3.2 中制備的剩余切片，采用 SP 法分別行 CD34 及 TNF-α 免疫組織化學染色觀察，陽性染色呈棕黃色。CD34 染色切片置于低倍鏡下確定血管密度最高區域，再在高倍鏡下選取 3 個密度較多視野進行微血管計數，取均值作為 MVD。TNF-α 染色切片每張隨機取 3 個視野，使用 Image Pro-Plus 6.0 軟件測定吸光度（A）值，取均值，代表皮瓣組織中 TNF-α 蛋白表達量。
1.4 統計學方法
采用 SPSS20.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 大體觀察
術后第 2 天，各組大鼠皮瓣遠端存在不同程度水腫，色澤變暗。其中，對照組水腫程度最嚴重、范圍最大，水蛭素組與高壓氧組水腫情況相似且較對照組輕，聯合組皮瓣水腫程度最輕、色澤最淺。第 4 天，各組大鼠皮瓣遠端色澤加深，出現淤血征象，組織質地稍變硬。其中，對照組淤血范圍明顯大于其余各組。第 6 天，各組皮瓣遠端色澤進一步加深，呈灰黑色，組織質地變硬，部分皺縮，皮瓣出現明顯壞死分界。其中，聯合組皮瓣成活情況最佳；水蛭素組與高壓氧組皮瓣均存在部分壞死，成活情況相近；對照組存在較大面積皮瓣壞死。見圖 1。
圖1
術后各組皮瓣大體觀察
從左至右分別為對照組、高壓氧組、水蛭素組、聯合組 a. 術后第 2 天；b. 術后第 4 天；c. 術后第 6 天
Figure1. General observation of skin flap in each group after operationFrom left to right for control group, hyperbaric oxygen group, natural hirudin group, combined group, respectively a. At 2 days after operation; b. At 4 days after operation; c. At 6 days after operation
圖2
術后各組組織學觀察（HE×200）
從左至右分別為對照組、高壓氧組、水蛭素組、聯合組 a. 術后第 2 天；b. 術后第 4 天
Figure2. Histological observation of each group after operation (HE×200)From left to right for control group, hyperbaric oxygen group, natural hirudin group, and combined group, respectively a. At 2 days after operation; b. At 4 days after operation
圖3
術后各組 CD34 免疫組織化學染色觀察（×400）
從左至右分別為對照組、高壓氧組、水蛭素組、聯合組 a. 術后第 2 天；b. 術后第 4 天
Figure3. CD34 immunohistochemical staining observation of each group after operation (×400)From left to right for control group, hyperbaric oxygen group, natural hirudin group, and combined group, respectively a. At 2 days after operation; b. At 4 days after operation
圖4
術后各組 TNF-α 免疫組織化學染色觀察（×400）
從左至右分別為對照組、高壓氧組、水蛭素組、聯合組 a. 術后第 2 天；b. 術后第 4 天
Figure4. TNF-α immunohistochemical staining observation of each group after operation (×400)From left to right for control group, hyperbaric oxygen group, natural hirudin group, and combined group, respectively a. At 2 days after operation; b. At 4 days after operation
術后第 6 天對照組、高壓氧組、水蛭素組、聯合組皮瓣成活率分別為 69.53%±3.07%、85.03%±3.55%、87.29%±2.71%、91.51%±3.28%。高壓氧組、水蛭素組及聯合組皮瓣成活率明顯高于對照組，聯合組高于水蛭素組、高壓氧組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；水蛭素組與高壓氧組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。
2.2 組織學觀察
術后第 2 天，與對照組相比，水蛭素組、高壓氧組及聯合組中均可見微小血管形成，其中聯合組微血管結構最多；各組均可見大量炎性細胞浸潤，其中聯合組炎性浸潤情況最輕。第 4 天，與對照組相比，高壓氧組、水蛭素組及聯合組中仍可見較多微血管形成；對照組中則見大量炎性細胞浸潤，部分細胞甚至出現核固縮、核碎裂，而其余各組炎性細胞浸潤均較第 2 天時明顯減少，炎性反應均較對照組輕。見圖 2。
2.3 免疫組織化學染色
2.3.1 CD34 染色
術后第 2 天，聯合組陽性染色細胞多于高壓氧組及水蛭素組，視野內細胞形成微血管結構較多；對照組僅見稀疏陽性染色細胞，視野內微血管結構不明顯。第 4 天，對照組未見明顯陽性染色，聯合組及水蛭素組陽性染色細胞較高壓氧組多，視野內形成的微血管結構較多。見圖 3。
術后第 2 天，對照組、高壓氧組、水蛭素組、聯合組皮瓣 MVD 分別為（10.78±2.94）、（15.06±1.61）、（18.61±2.50）、（17.94±3.43）個/視野；其中高壓氧組、水蛭素組及聯合組 MVD 均顯著高于對照組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；高壓氧組、水蛭素組及聯合組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。第 4 天，對照組、高壓氧組、水蛭素組、聯合組皮瓣 MVD 分別為（9.28±1.44）、（19.94±2.86）、（24.44±5.37）、（25.28±3.06）個/視野；其中高壓氧組、水蛭素組及聯合組 MVD 均顯著高于對照組，聯合組及水蛭素組高于高壓氧組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；聯合組及水蛭素組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。
2.3.2 TNF-α 染色
術后第 2 天，與對照組相比，高壓氧組與水蛭素組 TNF-α 表達水平較低，且兩者較相近，而聯合組最低；第 4 天，各組 TNF-α 陽性表達均較前增多，但聯合組 TNF-α 表達水平仍最低，高壓氧組和水蛭素組較高，而對照組 TNF-α 表達水平仍最高。見圖 4。
術后第 2 天，對照組、高壓氧組、水蛭素組、聯合組 TNF-α 蛋白表達量分別為 0.008 6±0.002 7、0.002 5±0.001 3、0.003 6±0.002 1、0.001 4±0.001 0；其中高壓氧組、水蛭素組及聯合組均顯著低于對照組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；高壓氧組、水蛭素組及聯合組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。第 4 天，對照組、高壓氧組、水蛭素組、聯合組 TNF-α 蛋白表達量分別為 0.010 7±0.002 0、0.003 9±0.001 8、0.005 5±0.001 7、0.001 8±0.001 0；其中高壓氧組、水蛭素組及聯合組表達水平仍顯著低于對照組，聯合組低于水蛭素組、高壓氧組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；水蛭素組及高壓氧組間比較，差異無統計學意義（P>0.05）。
3 討論
隨意皮瓣的血液供應主要依賴于真皮下血管網，而皮瓣基底和周邊長入的新生血管，也對皮瓣的血運發揮了一定作用[13]。MVD 即單位面積內微血管數，能反映組織的血管生成活性[14]。已有研究證實，高壓氧治療能促進移植皮瓣的新生血管形成[8, 15-16]，并能提高組織中 VEGF 的表達水平[17-18]。值得注意的是，由于皮瓣移植后的構建本質上是一個創傷修復的過程，因而當組織發生損傷時，損傷處及周邊組織會合成并釋放大量凝血酶，進而通過激活凝血酶受體誘導一系列病理生理反應，抑制血管生成[19]。我們前期研究[20]也發現，皮瓣移植術后第 6 天，組織中凝血酶水平明顯升高并呈持續高表達狀態，使抑制血管生成的因子表達增多，抑制了組織新生血管形成。而天然水蛭素作為凝血酶的特異性拮抗劑，通過拮抗凝血酶的相關信號通路，調節了血管生成因子（如 VEGF）與抗血管生成因子（如 TSP-1、內皮抑素）之間的平衡，從而對移植后的皮瓣起到促血管生成作用。
本實驗中，我們通過免疫組織化學染色檢測并計數各組皮瓣 MVD，以評估其新生血管情況。結果顯示皮瓣移植術后第 2 天，高壓氧組、水蛭素組及聯合組皮瓣 MVD 均明顯高于對照組。表明皮瓣移植術后，給予天然水蛭素和高壓氧治療對皮瓣新生血管形成均有明顯促進作用。通過早期干預形成較多的新生血管，改善了皮瓣的微循環灌注，使皮瓣的缺血、淤血情況得以明顯改善。至術后第 4 天時，聯合組大鼠皮瓣的 MVD 最高，明顯高于高壓氧組和水蛭素組；同時，術后第 6 天聯合組皮瓣成活率也最高，提示術后高壓氧聯合天然水蛭素治療具有協同作用，能促進術后早期皮瓣微循環的建立，明顯提高移植皮瓣成活率。
然而，移植后的皮瓣組織構建不僅依賴于血管生成，還取決于組織的炎性反應及損傷修復。TNF-α 是一種由活化的巨噬細胞及單核細胞分泌的細胞因子，作為啟動炎性反應的關鍵因子，可誘導 NF-κB 磷酸化，從而激活一系列聯級反應，進而促進多種細胞因子及炎性介質的釋放[21-22]，并能通過顯著增加細胞黏附分子的表達來增強內皮細胞與白細胞的相互作用，介導炎性反應的進一步發展[23]。此外，TNF-α 還可以誘導組織細胞發生凋亡[24]。因而，組織中 TNF-α 的含量可代表其炎性反應程度。
理論上，減輕組織損傷的炎性反應有利于創傷愈合[25]，促進移植皮瓣的成活。有研究表明，高壓氧治療能通過抑制 NF-κB 的活化來抑制大鼠外周血和組織中炎性因子的產生[26-27]，并能下調血清和組織中 IL-1β 和 TNF-α 的水平[28-29]，抑制炎性反應。我們前期研究顯示，局部應用天然水蛭素，能明顯降低皮瓣移植術后 TNF-α、IL-6 等炎性因子的表達水平[11]。本研究中，我們對皮瓣組織進行 TNF-α 免疫組織化學染色觀察，結果顯示術后第 2、4 天，高壓氧組、水蛭素組和聯合組的 TNF-α 蛋白表達量均顯著低于對照組，表明術后給予高壓氧處理及天然水蛭素治療均能明顯減輕皮瓣移植術后炎性反應。其中第 4 天時，聯合組中的 TNF-α 蛋白表達量最低，顯著低于高壓氧組及水蛭素組，表明天然水蛭素聯合高壓氧治療具有協同效應，能明顯抑制術后皮瓣組織的炎性應激反應。
綜上述，局部應用天然水蛭素和高壓氧治療均能促進移植皮瓣的新生血管形成、減輕皮瓣炎性反應，兩者聯合治療時能發揮協同效應，進一步提高移植皮瓣的成活率。但兩者聯合治療條件及其具體的交互作用機制尚需進一步研究和探討。
皮瓣移植是整形外科修復各種組織缺損的一種重要手段。隨意皮瓣因其轉移靈活、術式簡單而被廣泛應用。但隨意皮瓣由于不含知名血管，皮瓣血液供應主要依靠蒂部皮膚及筋膜內的血管網，因而受皮瓣長寬比例的影響，若皮瓣發生血液循環障礙未得到及時糾正，會造成皮瓣部分或全部壞死[1]。因此，改善移植術后皮瓣的血液供應，減少炎性反應，對提高皮瓣的成活率至關重要。
近年來，高壓氧作為一種新的治療方法逐漸受到臨床重視。目前，學者們主要在提高腦和脊髓的缺血缺氧耐受[2]、抗凋亡[3-4]及抑制炎癥[5]等方面，對高壓氧的作用進行一系列研究。在整形外科領域，有報道將高壓氧用于組織缺損修復和移植術后的輔助治療[6-7]。有研究表明，高壓氧處理對移植皮瓣的成活具有一定促進作用[8-9] 。水蛭素是天然的凝血酶拮抗劑，其能與凝血酶受體特異性結合而具備抗凝效應，可起到預防血栓形成、改善皮瓣微循環、提高組織血流灌注量的作用。本課題組前期實驗也發現，天然水蛭素能通過促血管生成、抑制炎性反應等方面改善淤血皮瓣的微循環，從而促進移植后隨意皮瓣的成活[10-11]。目前，有關高壓氧和水蛭素兩者在皮瓣移植中的聯合應用鮮有報道。本研究通過探討高壓氧聯合水蛭素治療對移植術后皮瓣組織中微血管密度（microvessel density，MVD）、TNF-α 的影響及其與皮瓣成活的關系，旨在為兩者用于臨床促進移植術后皮瓣成活提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
健康 SD 大鼠 72 只，雌雄不限，體質量（275±15）g，購自廣西醫科大學實驗動物中心。天然水蛭素凍干粉（南寧凈雪皇生物工程有限公司）。兔抗大鼠 CD34 單克隆抗體、兔抗大鼠 TNF-α 多克隆抗體（Abcam 公司，英國）；免疫組織化學染色試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）。Olympus-BX50 顯微鏡（Olympus 公司，日本）；Image Pro-Plus 6.0 軟件（Media Cybernetics 公司，美國）。
1.2 實驗分組及方法
1.2.1 大鼠隨意皮瓣移植模型制備
取 72 只 SD 大鼠，腹腔注射 10% 水合氯醛（3 mL/kg）麻醉后，在其背部設計一個面積為 10.0 cm×2.5 cm 的超長隨意皮瓣。無菌條件下，按設計線切開皮膚至深筋膜層，分離并掀起皮瓣，如有軸型血管將其切斷，保證皮瓣不攜帶軸型血管，徹底止血后皮瓣原位縫合。
1.2.2 實驗分組及方法
將大鼠隨意皮瓣移植模型隨機分為對照組、高壓氧組、水蛭素組和聯合組（水蛭素+高壓氧治療），每組 18 只。對照組：術后即刻及之后 4 d 內每天皮下注射生理鹽水，皮瓣注射點選擇為距蒂部 7.5、5.0、2.5 cm 處，每處各 2 個點，每個點注射 0.1 mL。高壓氧組：同對照組方法注射生理鹽水，同時術后 4 d 內每天行高壓氧治療 2 次，每次間隔 6 h。水蛭素組：參照對照組方法皮下注射天然水蛭素，每個點注射 0.1 mL，含 10 ATU。聯合組：參照水蛭素組注射天然水蛭素，同時參照高壓氧組行高壓氧治療。
高壓氧治療方法參考 Liu 等[8]實驗方法和本課題組前期實驗經驗[12]。具體步驟：將大鼠置于大型空氣加壓艙內的自制實驗動物容器中，對艙內進行空氣加壓 20 min，使艙內壓力達到 2.0 ATA，穩壓 60 min，加壓開始時即對實驗動物容器通氧，連續監測容器中氧濃度，穩壓期間將氧濃度維持在 98% 以上，開始減壓時即停止通氧，減壓 20 min。
1.3 觀測指標
1.3.1 大體觀察
術后第 2、4、6 天觀察大鼠皮瓣色澤、質地、有無水腫、有無滲出、有無破潰以及成活情況。術后第 6 天各組取 6 只大鼠同上法麻醉后，數碼相機攝背部皮瓣照片，采用 Image Pro-Plus 6.0 軟件計算皮瓣成活率。皮瓣成活率=皮瓣成活面積/皮瓣面積×100%。
1.3.2 組織學觀察
術后第 2、4 天各組分別取 6 只大鼠，同上法麻醉后，切取皮瓣距尾端 3～4 cm 處組織，置于 10% 甲醛固定 24 h 后，脫水、包埋、切片，片厚 3μm，取部分切片行 HE 染色，顯微鏡下觀察皮瓣組織中微血管結構、炎性細胞數量及壞死情況。
1.3.3 免疫組織化學染色
術后第 2、4 天取 1.3.2 中制備的剩余切片，采用 SP 法分別行 CD34 及 TNF-α 免疫組織化學染色觀察，陽性染色呈棕黃色。CD34 染色切片置于低倍鏡下確定血管密度最高區域，再在高倍鏡下選取 3 個密度較多視野進行微血管計數，取均值作為 MVD。TNF-α 染色切片每張隨機取 3 個視野，使用 Image Pro-Plus 6.0 軟件測定吸光度（A）值，取均值，代表皮瓣組織中 TNF-α 蛋白表達量。
1.4 統計學方法
采用 SPSS20.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 大體觀察
術后第 2 天，各組大鼠皮瓣遠端存在不同程度水腫，色澤變暗。其中，對照組水腫程度最嚴重、范圍最大，水蛭素組與高壓氧組水腫情況相似且較對照組輕，聯合組皮瓣水腫程度最輕、色澤最淺。第 4 天，各組大鼠皮瓣遠端色澤加深，出現淤血征象，組織質地稍變硬。其中，對照組淤血范圍明顯大于其余各組。第 6 天，各組皮瓣遠端色澤進一步加深，呈灰黑色，組織質地變硬，部分皺縮，皮瓣出現明顯壞死分界。其中，聯合組皮瓣成活情況最佳；水蛭素組與高壓氧組皮瓣均存在部分壞死，成活情況相近；對照組存在較大面積皮瓣壞死。見圖 1。
圖1
術后各組皮瓣大體觀察
從左至右分別為對照組、高壓氧組、水蛭素組、聯合組 a. 術后第 2 天；b. 術后第 4 天；c. 術后第 6 天
Figure1. General observation of skin flap in each group after operationFrom left to right for control group, hyperbaric oxygen group, natural hirudin group, combined group, respectively a. At 2 days after operation; b. At 4 days after operation; c. At 6 days after operation
圖2
術后各組組織學觀察（HE×200）
從左至右分別為對照組、高壓氧組、水蛭素組、聯合組 a. 術后第 2 天；b. 術后第 4 天
Figure2. Histological observation of each group after operation (HE×200)From left to right for control group, hyperbaric oxygen group, natural hirudin group, and combined group, respectively a. At 2 days after operation; b. At 4 days after operation
圖3
術后各組 CD34 免疫組織化學染色觀察（×400）
從左至右分別為對照組、高壓氧組、水蛭素組、聯合組 a. 術后第 2 天；b. 術后第 4 天
Figure3. CD34 immunohistochemical staining observation of each group after operation (×400)From left to right for control group, hyperbaric oxygen group, natural hirudin group, and combined group, respectively a. At 2 days after operation; b. At 4 days after operation
圖4
術后各組 TNF-α 免疫組織化學染色觀察（×400）
從左至右分別為對照組、高壓氧組、水蛭素組、聯合組 a. 術后第 2 天；b. 術后第 4 天
Figure4. TNF-α immunohistochemical staining observation of each group after operation (×400)From left to right for control group, hyperbaric oxygen group, natural hirudin group, and combined group, respectively a. At 2 days after operation; b. At 4 days after operation
術后第 6 天對照組、高壓氧組、水蛭素組、聯合組皮瓣成活率分別為 69.53%±3.07%、85.03%±3.55%、87.29%±2.71%、91.51%±3.28%。高壓氧組、水蛭素組及聯合組皮瓣成活率明顯高于對照組，聯合組高于水蛭素組、高壓氧組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；水蛭素組與高壓氧組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。
2.2 組織學觀察
術后第 2 天，與對照組相比，水蛭素組、高壓氧組及聯合組中均可見微小血管形成，其中聯合組微血管結構最多；各組均可見大量炎性細胞浸潤，其中聯合組炎性浸潤情況最輕。第 4 天，與對照組相比，高壓氧組、水蛭素組及聯合組中仍可見較多微血管形成；對照組中則見大量炎性細胞浸潤，部分細胞甚至出現核固縮、核碎裂，而其余各組炎性細胞浸潤均較第 2 天時明顯減少，炎性反應均較對照組輕。見圖 2。
2.3 免疫組織化學染色
2.3.1 CD34 染色
術后第 2 天，聯合組陽性染色細胞多于高壓氧組及水蛭素組，視野內細胞形成微血管結構較多；對照組僅見稀疏陽性染色細胞，視野內微血管結構不明顯。第 4 天，對照組未見明顯陽性染色，聯合組及水蛭素組陽性染色細胞較高壓氧組多，視野內形成的微血管結構較多。見圖 3。
術后第 2 天，對照組、高壓氧組、水蛭素組、聯合組皮瓣 MVD 分別為（10.78±2.94）、（15.06±1.61）、（18.61±2.50）、（17.94±3.43）個/視野；其中高壓氧組、水蛭素組及聯合組 MVD 均顯著高于對照組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；高壓氧組、水蛭素組及聯合組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。第 4 天，對照組、高壓氧組、水蛭素組、聯合組皮瓣 MVD 分別為（9.28±1.44）、（19.94±2.86）、（24.44±5.37）、（25.28±3.06）個/視野；其中高壓氧組、水蛭素組及聯合組 MVD 均顯著高于對照組，聯合組及水蛭素組高于高壓氧組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；聯合組及水蛭素組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。
2.3.2 TNF-α 染色
術后第 2 天，與對照組相比，高壓氧組與水蛭素組 TNF-α 表達水平較低，且兩者較相近，而聯合組最低；第 4 天，各組 TNF-α 陽性表達均較前增多，但聯合組 TNF-α 表達水平仍最低，高壓氧組和水蛭素組較高，而對照組 TNF-α 表達水平仍最高。見圖 4。
術后第 2 天，對照組、高壓氧組、水蛭素組、聯合組 TNF-α 蛋白表達量分別為 0.008 6±0.002 7、0.002 5±0.001 3、0.003 6±0.002 1、0.001 4±0.001 0；其中高壓氧組、水蛭素組及聯合組均顯著低于對照組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；高壓氧組、水蛭素組及聯合組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。第 4 天，對照組、高壓氧組、水蛭素組、聯合組 TNF-α 蛋白表達量分別為 0.010 7±0.002 0、0.003 9±0.001 8、0.005 5±0.001 7、0.001 8±0.001 0；其中高壓氧組、水蛭素組及聯合組表達水平仍顯著低于對照組，聯合組低于水蛭素組、高壓氧組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；水蛭素組及高壓氧組間比較，差異無統計學意義（P>0.05）。
3 討論
隨意皮瓣的血液供應主要依賴于真皮下血管網，而皮瓣基底和周邊長入的新生血管，也對皮瓣的血運發揮了一定作用[13]。MVD 即單位面積內微血管數，能反映組織的血管生成活性[14]。已有研究證實，高壓氧治療能促進移植皮瓣的新生血管形成[8, 15-16]，并能提高組織中 VEGF 的表達水平[17-18]。值得注意的是，由于皮瓣移植后的構建本質上是一個創傷修復的過程，因而當組織發生損傷時，損傷處及周邊組織會合成并釋放大量凝血酶，進而通過激活凝血酶受體誘導一系列病理生理反應，抑制血管生成[19]。我們前期研究[20]也發現，皮瓣移植術后第 6 天，組織中凝血酶水平明顯升高并呈持續高表達狀態，使抑制血管生成的因子表達增多，抑制了組織新生血管形成。而天然水蛭素作為凝血酶的特異性拮抗劑，通過拮抗凝血酶的相關信號通路，調節了血管生成因子（如 VEGF）與抗血管生成因子（如 TSP-1、內皮抑素）之間的平衡，從而對移植后的皮瓣起到促血管生成作用。
本實驗中，我們通過免疫組織化學染色檢測并計數各組皮瓣 MVD，以評估其新生血管情況。結果顯示皮瓣移植術后第 2 天，高壓氧組、水蛭素組及聯合組皮瓣 MVD 均明顯高于對照組。表明皮瓣移植術后，給予天然水蛭素和高壓氧治療對皮瓣新生血管形成均有明顯促進作用。通過早期干預形成較多的新生血管，改善了皮瓣的微循環灌注，使皮瓣的缺血、淤血情況得以明顯改善。至術后第 4 天時，聯合組大鼠皮瓣的 MVD 最高，明顯高于高壓氧組和水蛭素組；同時，術后第 6 天聯合組皮瓣成活率也最高，提示術后高壓氧聯合天然水蛭素治療具有協同作用，能促進術后早期皮瓣微循環的建立，明顯提高移植皮瓣成活率。
然而，移植后的皮瓣組織構建不僅依賴于血管生成，還取決于組織的炎性反應及損傷修復。TNF-α 是一種由活化的巨噬細胞及單核細胞分泌的細胞因子，作為啟動炎性反應的關鍵因子，可誘導 NF-κB 磷酸化，從而激活一系列聯級反應，進而促進多種細胞因子及炎性介質的釋放[21-22]，并能通過顯著增加細胞黏附分子的表達來增強內皮細胞與白細胞的相互作用，介導炎性反應的進一步發展[23]。此外，TNF-α 還可以誘導組織細胞發生凋亡[24]。因而，組織中 TNF-α 的含量可代表其炎性反應程度。
理論上，減輕組織損傷的炎性反應有利于創傷愈合[25]，促進移植皮瓣的成活。有研究表明，高壓氧治療能通過抑制 NF-κB 的活化來抑制大鼠外周血和組織中炎性因子的產生[26-27]，并能下調血清和組織中 IL-1β 和 TNF-α 的水平[28-29]，抑制炎性反應。我們前期研究顯示，局部應用天然水蛭素，能明顯降低皮瓣移植術后 TNF-α、IL-6 等炎性因子的表達水平[11]。本研究中，我們對皮瓣組織進行 TNF-α 免疫組織化學染色觀察，結果顯示術后第 2、4 天，高壓氧組、水蛭素組和聯合組的 TNF-α 蛋白表達量均顯著低于對照組，表明術后給予高壓氧處理及天然水蛭素治療均能明顯減輕皮瓣移植術后炎性反應。其中第 4 天時，聯合組中的 TNF-α 蛋白表達量最低，顯著低于高壓氧組及水蛭素組，表明天然水蛭素聯合高壓氧治療具有協同效應，能明顯抑制術后皮瓣組織的炎性應激反應。
綜上述，局部應用天然水蛭素和高壓氧治療均能促進移植皮瓣的新生血管形成、減輕皮瓣炎性反應，兩者聯合治療時能發揮協同效應，進一步提高移植皮瓣的成活率。但兩者聯合治療條件及其具體的交互作用機制尚需進一步研究和探討。
