引用本文： 劉宗超, 韋章超, 劉勇, 王振龍, 付志江, 劉世貴, 沈皆亮, 胡偵明. 基質細胞衍生因子 1 對于血管內皮細胞增殖影響及其相關機制研究. 中國修復重建外科雜志, 2017, 31(1): 91-97. doi: 10.7507/1002-1892.201609071 復制
健康成熟的椎間盤是人體內最大的乏血管組織，微血管只存于纖維環的外 1/3 層和上下骨終板中，而在退變的椎間盤組織中通過免疫組織化學方法可檢測到大量微血管存在[1-3]。已有研究表明[4]，退變椎間盤中長入的新生血管可使內部髓核組織發生免疫反應，募集大量炎性因子，從而加速其退變進程。血管內皮細胞（vascular endothelial cells，VECs）被認為是新生血管的主要物質。近年來許多研究結果顯示，退變的纖維環細胞可產生和分泌 VEGF，從而為新生血管的長入創造條件[5-6]。本研究小組前期研究顯示，在退變髓核組織中基質細胞衍生因子 1（stromal cell derived factorl，SDF-1）呈現高表達，且與椎間盤退變密切相關[7]。而 Hiasa 等[8]的研究表明，通過 SDF-1 的基因轉染可在局部缺血組織中增強其血管生成和長入能力。那么在退變椎間盤中高表達的 SDF-1 是否同樣起著誘導血管生成的作用，其相關機制是什么，成為本研究的重點。本研究擬通過將人退變髓核細胞（nucelus pulposus cells，NPCs）與人 VECs 共培養，檢測人退變 NPCs 分泌的 SDF-1 對 VECs 增殖凋亡的影響及潛在的調控機制，為預防椎間盤退變提供新的方法學選擇。
1 材料與方法
1.1 組織來源
實驗所需標本來源于西南醫科大學附屬中醫院骨科 8 例椎間盤突出癥患者的椎間盤組織，其中男 4 例，女 4 例；年齡 31～67 歲，平均 49 歲。病變節段：L2、3 1 例，L3、4 2 例，L4、5 1 例，L5、S1 4 例。退變程度按 Pfirrmann 標準分級：3 級 5 例，4 級 2 例，5 級 1 例。患者術前均簽署知情同意書，本研究方案獲西南醫科大學醫學倫理委員會批準。
1.2 主要試劑及儀器
Ⅱ型膠原酶（Sigma 公司，美國）；胰蛋白酶（北京索萊寶科技有限公司）；PBS 緩沖液、DMEM/F12 培養基（HyClone 公司，美國）；FBS（GIBCO 公司，美國）；青霉素-鏈霉素溶液、總蛋白提取試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒、5×SDS-PAGE 加樣緩沖液、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒、β-actin 小鼠抗人多克隆抗體、ECL 化學發光試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；VEGF ELISA 試劑盒（RD 公司，美國）；SDF-1 小鼠抗人單克隆抗體（Abcam 公司，美國）；磷酸化 Akt（p-Akt）小鼠抗人單克隆抗體、總 Akt 小鼠抗人單克隆抗體（Cell Signaling Technology 公司，美國）；SDF-1 過表達慢病毒（上海吉凱基因化學技術有限公司）；Akt 抑制劑 GSK690693（Selleck 公司，美國）。3D 培養耗材（Alvetex 公司，美國）；37℃ 溫水浴箱（金壇華榮電氣成套設備廠）；電子精密天平（Radwag 公司，波蘭）；超凈工作臺、細胞培養箱（賽默飛公司，美國）；低溫高速離心機（NBS 公司，美國）；凈水器（Millipore 公司，美國）；倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡（Nikon 公司，日本）；掃描電鏡（Hitachi 公司，日本）；流式細胞儀（BD 公司，美國）；酶標儀（Tecan 公司，奧地利）；電泳儀、電泳轉膜系統（北京六一生物科技有限公司）；凝膠掃描系統、FACS Vantage SE 流式細胞儀（Bio-Rad 公司，美國）。
1.3 人退變 NPCs 原代培養
將術中摘取的椎間盤組織置于超凈臺中，用 PBS 緩沖液充分洗凈血漬。用眼科剪和眼科鑷分離出凍膠樣髓核組織，置入 15 mL 離心管中，以 1∶4 體積比加入 2.5 g/L 胰蛋白酶，37℃ 消化 30 min 后，800×g 離心 10 min，棄上清；再以 1∶4 體積比加入 2 g/L Ⅱ型膠原酶，37℃ 消化約 5 h，以組織塊呈絮狀、逐漸消失為止。用 200 目細胞篩過濾，將取得的過濾液同上法離心獲取細胞沉淀。用含 10%FBS 的 DMEM/F12 完全培養基重懸細胞沉淀，通過細胞計數后以 1×105 個/mL 密度接種于 T25 培養瓶中。于 37℃、5%CO2 細胞培養箱培養。3 d 左右加液，1 周左右換液，2～3 周細胞融合達 90% 左右行胰蛋白酶消化傳代培養。采用Ⅱ型膠原和聚蛋白多糖（Aggrecan）細胞免疫熒光法鑒定為髓核細胞[3]。
1.4 SDF-1 過表達慢病毒轉染人退變 NPCs
取第 1 代單層培養的 NPCs 進行慢病毒轉染。轉染前 1 d 以 5×104 個/孔密度將 NPCs 種植于 6 孔板中，轉染前 30 min 觀察細胞融合度達 30%～50%，更換新鮮的完全培養基。首先將 SDF-1 過表達慢病毒原液稀釋成 1×106TU/mL 的病毒工作液，將 10 μL 病毒工作液和 10 μL 濃度為 50 μg/mL 的 Polybrene 混合加入 1 mL 完全培養基中，上下顛倒輕輕混勻，室溫下靜置 15 min，每孔加入 1 mL 上述轉染復合物，感染復數約為 50（預實驗得到的最佳感染復數）。72 h 后熒光顯微鏡觀察熒光強度；Western blot 法（見 1.6.2 方法）檢測轉染后 SDF-1 蛋白表達，驗證其轉染效率，以未轉染細胞為對照。SDF-1 過表達序列：上游 5'-AGGTCGA-CTCTAGAGGATCCCGCCACCATGAACGCCAAG-GTCGTG-3'；下游 5'-AGTCCATGGTGGCGACC-GGCTTGTTTAAAGCTTTCTCCAGG-3'。
1.5 人退變 NPCs 與人 VECs 共培養
取 HMEC-1 細胞作為本實驗的人 VECs，與三維培養的人退變 NPCs 共培養。具體方法：將 HMEC-1 以平面培養方式種植于 6 孔板中，將同上法轉染 72 h 后的第 2 代人退變 NPCs 種植于 alvetex? 三維培養支架上，兩者相互獨立生長，但通用含 10%FBS 的 DMEM/F12 培養基，于 37℃、5%CO2 無菌細胞孵箱中共培養。共培養至檢測時間點后，移除上方含 NPCs 的三維支架，采用常規胰蛋白酶消化法收集 HMEC-1 進行后續檢測。以未轉染慢病毒 NPCs 的共培養體系作為對照組。
1.6 觀測指標
1.6.1 掃描電鏡觀察 共培養 72 h 后，取出培養孔中的 alvetex? 三維培養支架材料，2.5% 戊二醛固定 30 min；PBS 緩沖液沖洗 5 min×3 次，梯度乙醇常規脫水，采用叔丁醇置換，行臨界點干燥后噴金，掃描電鏡觀察人退變 NPCs 在 alvetex? 三維培養支架中的生長狀態。
1.6.2 Western blot 檢測蛋白表達 采用 RIPA 裂解液消化、提取各處理組細胞總蛋白，BCA 法檢測蛋白濃度。以每孔 50 μg 的相同蛋白質量行 SDS-PAGE 凝膠電泳，電轉至聚偏氟乙烯膜，轉膜后用 5%BCA 封閉 1 h，加入小鼠抗人 SDF-1 單克隆抗體，小鼠抗人 p-Akt 和總 Akt 單克隆抗體。4℃ 過夜，第 2 天復溫后加入二抗孵育 1 h，充分洗膜后加 ECL 顯色反應。分別檢測轉染組、未轉染組和抑制劑組（轉染組中加入 GSK690693）p-Akt 和總 Akt 蛋白表達。
1.6.3 細胞凋亡檢測 采用膜聯蛋白Ⅴ（AnnexinⅤ）-PE/碘化丙啶（propidium iodide，PI）雙染法檢測細胞凋亡，具體方法：共培養 72 h 后，收集轉染組和非轉染組 HMEC-1，胰蛋白酶消化 HMEC-1 后計數細胞，取 1×104 個 HMEC-1 重懸于結合緩沖液，依次加入 AnnexinⅤ和 PI 進行標記，37℃ 孵育 1 h 后，采用流式細胞儀檢測，Flowjo 軟件對結果進行分析，早期凋亡細胞在 Annexin V+/7-AAD- 象限，晚期凋亡細胞在 Annexin V+/7-AAD+ 象限，將這兩個象限各自細胞比例相加即為總的細胞凋亡率。
1.6.4 ELISA 檢測 VEGF 表達 分別取轉染組和未轉染組培養基 10 μL/孔加入酶標板，37℃ 孵育 90 min；加入 100 μL 生物素化抗體工作液，37℃ 孵育 60 min，洗滌 3 次；加入 100 μL 酶結合物工作液，37℃ 孵育 30 min，洗滌 5 次；加入 90 μL 底物溶液，37℃ 孵育 15 min，加入 50 μL 終止液，置于酶標儀 450 nm 波長處測量吸光度（A）值，計算 VEGF 蛋白表達量。
1.6.5 細胞計數試劑盒 8（cell counting kit 8，CCK-8）法檢測 HMEC-1 增殖情況 共培養 12、24、48、72 h 時檢測轉染組和未轉染組 HMEC-1 增殖情況；為檢測 Akt 信號通路對 HMEC-1 增殖的影響，在共培養體系中加入 GSK690693（抑制劑組），于 0、24 h 檢測各組 HMEC-1 增殖改變。具體方法：將 NPCs 和 HCME-1 以 1∶1 比例共培養于 96 孔板中，每種細胞初始數量為 1×104 個，每小時取3 孔觀察，37℃ 孵箱中培養 4 h 后顯微鏡觀察細胞是否貼壁。經相應處理后，各時間點每孔加入 10 μL CCK-8，輕輕混勻后放入孵箱繼續培養 1 h，然后在酶標儀上 450 nm 波長下測定A 值，間接反映細胞數量。
1.7 統計學方法
采用 SPSS19.0 統計軟件進行分析。數據以均數 ± 標準差表示，組間比較采用獨立樣本t 檢驗；檢驗水準取雙側α=0.05。
2 結果
2.1 NPCs 鑒定和三維培養觀察
細胞免疫熒光染色示Ⅱ型膠原和 Aggrecan 均呈陽性，于細胞質表達，分別呈綠色和紅色熒光，細胞核未見染色。見圖 1。
圖1
轉染 72 h 細胞免疫熒光法鑒定人退變 NPCs（熒光顯微鏡 ×200） a. Ⅱ型膠原 從左至右分別為Ⅱ型膠原、DAPI、二者重合； b. Aggrecan 從左至右分別為 Aggrecan、DAPI、二者重合
Figure1.
Identification of human degeneration NPCs by immunofluorescence assay at 72 hours after transfection (Fluorescence microscope×200) a. Collagen type II From left to right for collagen type II, DAPI, and merge; b. Aggrecan From left to right for Aggrecan, DAPI, and merge
為了維持 NPCs 表型，取 alvetex? 支架進行三維培養。alvetex? 三維培養支架材料的疏松孔洞直徑約 50 μm，掃描電鏡下在材料空隙中可見附著的人退變 NPCs，細胞呈立體球形，伸出偽足與支架材料相互黏附，細胞周圍可見大量分泌的細胞外基質。見圖 2。
圖2
人退變 NPCs 三維培養觀察（掃描電鏡 ×2 000） a. 支架材料； b. 人退變 NPCs，細胞呈立體球形定植于材料空隙中； c. 細胞伸出偽足與支架材料相互黏附，細胞周圍可見大量分泌的細胞外基質
Figure2.
Three dimensional culture observation of human degeneration NPCs (Scanning electron microscope×2 000) a. Scaffold material; b. Human degeneration NPCs, cells were spherical and located in the gap of the material; c. Cell extended parapodium with adhered to scaffold materials, a large number of secreted extracellular matrix was seen around cells
2.2 SDF-1 過表達慢病毒轉染人退變 NPCs 效果觀察
轉染 72 h 后熒光顯微鏡觀察可見明顯紅色熒光，Western blot 結果顯示轉染后 SDF-1 蛋白表達較未轉染組明顯上升，提示過表達慢病毒轉染 NPCs 效率較高，能有效過表達 SDF-1 蛋白。見圖 3。
圖3
SDF-1 過表達慢病毒轉染效率檢測 a. 轉染 72 h 熒光顯微鏡觀察（ ×200）；b. Western blot 檢測 SDF-1 表達 Mr：相對分子質量 1：未轉染組 2：轉染組
Figure3.
The transfection efficiency of SDF-1 over-expression lentivirus a. Fluorescence microscope observation at 72 hours after transfection( ×200); b. SDF-1 expression by Western blot Mr: Relative molecular mass 1: Untransfection group 2: Transfection group
2.3 SDF-1 過表達抑制 HMEC-1 細胞凋亡
共培養 72 h，轉染組 HMEC-1 的凋亡率為 4.57%±1.52%，顯著低于未轉染組的 8.33%±2.14%，差異有統計學意義（t=–5.039，P=0.007）。見圖 4。
圖4
SDF-1 過表達對 HMEC-1 凋亡的影響 a. 未轉染組；b. 轉染組
Figure4.
The influence of SDF-1 over-expression on HMEC-1 cell apoptosis a. Untransfection group; b. Transfection group
2.4 ELISA 檢測 VEGF 表達
共培養 72 h，轉染組培養基中 VEGF 濃度為（15.4±3.7）ng/μL，顯著高于未轉染組的（5.3±2.5）ng/μL，比較差異有統計學意義（t=7.302，P=0.002）。
2.5 Western blot 檢測 p-Akt 和總 Akt 蛋白表達
在共培養體系中，轉染組 p-Akt 蛋白表達量顯著高于未轉染組，抑制劑組加入 GSK690693 作用后 p-Akt 表達被顯著抑制；3 組總 Akt 蛋白表達量無明顯差異。見圖 5。
圖5
Western blot 檢測各組 p-Akt 及總 Akt 蛋白表達 a. 未轉染組； b. 轉染組； c. 抑制劑組
Figure5.
p-Akt and total Akt protein expressions by Western blot a. Untransfection group; b. Transfection group; c. Inhibitor group
2.6 CCK-8 檢測細胞增殖情況
共培養 24 h 后轉染組 HMEC-1 增殖情況均優于未轉染組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 6。共培養 24 h，轉染組 HMEC-1 增殖情況顯著高于未轉染組及抑制劑組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 7。
圖6
CCK-8 法檢測轉染組及未轉染組 HMEC-1 增殖情況
Figure6.
HMEC-1 proliferation of transfection group and untransfection group by CCK-8 assay
圖7
CCK-8 法檢測共培養 0、24 h 轉染組、未轉染組及抑制劑組 HMEC-1 增殖情況
Figure7.
HMEC-1 proliferation of transfection group, untransfection group, and inhibitor group at immediate and 24 hours after co-culture by CCK-8 assay
3 討論
SDF-1 是人體中一類重要的趨化因子，在正常生理狀態下，其可以募集帶有趨化因子受體 4（chemokine receptor 4，CXCR4）受體的炎性細胞或干細胞前往損傷部位，起到組織修復重建的作用。Pereira 等[9] 將含有 SDF-1 的透明質酸凝膠置入牛椎間盤后發現，其可使 MSCs 高效聚集在椎間盤中，從而延緩椎間盤退變。但 Zhang 等[10] 發現，在椎間盤的病理狀態下，突出的椎間盤組織中 SDF-1 和 CXCR4 表達明顯上升。本課題組的前期研究同樣表明，SDF-1 可促進退變 NPCs 的凋亡[7]。一個正常成熟的椎間盤內部無血管組織，其內在封閉的髓核組織成為人體內最大的抗原組織。組織學和影像學研究發現，在退變的椎間盤內部存在大量毛細血管組織，因此一旦有炎性細胞進入，將造成抗原-抗體反應，這也是椎間盤源性疼痛的一個潛在原因[11]。如何在早期抑制血管長入，從而避免后續的免疫炎性反應成為本研究的預期目標設想。本研究結果發現，高表達的 SDF-1 有利于血管內皮細胞株 HMEC-1 的增殖，而這些調控作用或許與 NPCs 中 Akt 信號通路的激活有關。
既往研究報道 NPCs 在體外二維培養條件下容易失去細胞表型，不能真實反映體內生理病理狀況。alvetex? 三維培養支架是一種高度疏松的交聯聚苯乙烯支架，形成的疏松孔洞直徑 36～40 μm，孔洞間的連通縫隙 12～14 μm，并被截成 200 μm 厚的薄片。它提供了一個非常合適的三維結構，細胞可在此環境里進行增殖、遷移、分化及執行各種生物學功能。細胞保持三維形態，并與相鄰細胞建立更緊密的相互聯系。
既往研究表明，高表達的 SDF-1 是新生血管形成的必要條件[12-13]。因此，我們采用了退變 NPCs 和 HMEC-1 體外共培養的方式，研究退變 NPCs 中高表達 SDF-1 對于 HMEC-1 的細胞增殖影響。結果表明 SDF-1 在慢病毒轉染后，熒光明顯且蛋白水平表達顯著增高，說明慢病毒轉染成功。Jia 等[14] 研究報道在退變椎間盤組織中 SDF-1 和 VEGF 表達密切相關，均呈現高表達。而本研究在三維共培養條件下，當 NPCs 的 SDF-1 高表達后，培養液的 VEGF 水平明顯增高，提示 SDF-1 可促進 VEGF 表達增高。Chang 等[15] 研究表明，SDF-1 在糖尿病新生血管化的發病機制中可有效促進 VEGF 水平的表達增高。本研究進一步的 CCK-8 檢測表明，SDF-1 高表達后使得 HMEC-1 增殖率顯著升高。由此可見，在退變椎間盤組織中 SDF-1 的高表達同樣是新生毛細血管長入的潛在原因。因此，通過抑制 SDF-1 的表達從而減少新生血管在退變椎間盤中的長入，進一步抑制炎性反應，成為今后一個有潛力的治療椎間盤退行性疾病的手段。
本研究的不足之處在于對 SDF-1 對 VEGF 表達調控機制的研究過少，我們只探討了 SDF-1 可促進 Akt 磷酸化水平的影響，而未探討其上下游許多關鍵靶點的表達情況，如 PTEN、P53 等。但基于本研究發現 SDF-1 對 HMEC-1 有較強的促增殖作用，且可顯著提高局部 VEGF 的表達水平，為后續實驗奠定了一定基礎。其次，本研究缺少體內實驗數據，我們擬在下一步實驗中選取退變椎間盤犬類模型，通過局部病毒感染方式觀察 SDF-1 在體內對新生血管化的確切作用及其具體機制，為椎間盤退行性疾病的治療提供新思路。
綜上述，本研究通過慢病毒介導的過表達系統靶向調控退變 NPCs 的 SDF-1 表達，利用 alvetex? 三維培養支架對于 NPCs 進行體外三維培養后再與 HMEC-1 共培養，結果顯示 SDF-1 過表達后可顯著提高 VEGF 的表達量，從而進一步提高 HMEC-1 增殖率。這一調控機制或許與 SDF-1-Akt 信號通路密切相關。在今后實驗中，我們將進一步研究是否能夠通過抑制退變椎間盤中 SDF-1 的高表達，從而抑制新生血管的長入，進而避免局部炎性反應的發生，為揭示椎間盤退行性疾病的發病機制尋找新的治療靶點和提供新的思路。
健康成熟的椎間盤是人體內最大的乏血管組織，微血管只存于纖維環的外 1/3 層和上下骨終板中，而在退變的椎間盤組織中通過免疫組織化學方法可檢測到大量微血管存在[1-3]。已有研究表明[4]，退變椎間盤中長入的新生血管可使內部髓核組織發生免疫反應，募集大量炎性因子，從而加速其退變進程。血管內皮細胞（vascular endothelial cells，VECs）被認為是新生血管的主要物質。近年來許多研究結果顯示，退變的纖維環細胞可產生和分泌 VEGF，從而為新生血管的長入創造條件[5-6]。本研究小組前期研究顯示，在退變髓核組織中基質細胞衍生因子 1（stromal cell derived factorl，SDF-1）呈現高表達，且與椎間盤退變密切相關[7]。而 Hiasa 等[8]的研究表明，通過 SDF-1 的基因轉染可在局部缺血組織中增強其血管生成和長入能力。那么在退變椎間盤中高表達的 SDF-1 是否同樣起著誘導血管生成的作用，其相關機制是什么，成為本研究的重點。本研究擬通過將人退變髓核細胞（nucelus pulposus cells，NPCs）與人 VECs 共培養，檢測人退變 NPCs 分泌的 SDF-1 對 VECs 增殖凋亡的影響及潛在的調控機制，為預防椎間盤退變提供新的方法學選擇。
1 材料與方法
1.1 組織來源
實驗所需標本來源于西南醫科大學附屬中醫院骨科 8 例椎間盤突出癥患者的椎間盤組織，其中男 4 例，女 4 例；年齡 31～67 歲，平均 49 歲。病變節段：L2、3 1 例，L3、4 2 例，L4、5 1 例，L5、S1 4 例。退變程度按 Pfirrmann 標準分級：3 級 5 例，4 級 2 例，5 級 1 例。患者術前均簽署知情同意書，本研究方案獲西南醫科大學醫學倫理委員會批準。
1.2 主要試劑及儀器
Ⅱ型膠原酶（Sigma 公司，美國）；胰蛋白酶（北京索萊寶科技有限公司）；PBS 緩沖液、DMEM/F12 培養基（HyClone 公司，美國）；FBS（GIBCO 公司，美國）；青霉素-鏈霉素溶液、總蛋白提取試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒、5×SDS-PAGE 加樣緩沖液、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒、β-actin 小鼠抗人多克隆抗體、ECL 化學發光試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；VEGF ELISA 試劑盒（RD 公司，美國）；SDF-1 小鼠抗人單克隆抗體（Abcam 公司，美國）；磷酸化 Akt（p-Akt）小鼠抗人單克隆抗體、總 Akt 小鼠抗人單克隆抗體（Cell Signaling Technology 公司，美國）；SDF-1 過表達慢病毒（上海吉凱基因化學技術有限公司）；Akt 抑制劑 GSK690693（Selleck 公司，美國）。3D 培養耗材（Alvetex 公司，美國）；37℃ 溫水浴箱（金壇華榮電氣成套設備廠）；電子精密天平（Radwag 公司，波蘭）；超凈工作臺、細胞培養箱（賽默飛公司，美國）；低溫高速離心機（NBS 公司，美國）；凈水器（Millipore 公司，美國）；倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡（Nikon 公司，日本）；掃描電鏡（Hitachi 公司，日本）；流式細胞儀（BD 公司，美國）；酶標儀（Tecan 公司，奧地利）；電泳儀、電泳轉膜系統（北京六一生物科技有限公司）；凝膠掃描系統、FACS Vantage SE 流式細胞儀（Bio-Rad 公司，美國）。
1.3 人退變 NPCs 原代培養
將術中摘取的椎間盤組織置于超凈臺中，用 PBS 緩沖液充分洗凈血漬。用眼科剪和眼科鑷分離出凍膠樣髓核組織，置入 15 mL 離心管中，以 1∶4 體積比加入 2.5 g/L 胰蛋白酶，37℃ 消化 30 min 后，800×g 離心 10 min，棄上清；再以 1∶4 體積比加入 2 g/L Ⅱ型膠原酶，37℃ 消化約 5 h，以組織塊呈絮狀、逐漸消失為止。用 200 目細胞篩過濾，將取得的過濾液同上法離心獲取細胞沉淀。用含 10%FBS 的 DMEM/F12 完全培養基重懸細胞沉淀，通過細胞計數后以 1×105 個/mL 密度接種于 T25 培養瓶中。于 37℃、5%CO2 細胞培養箱培養。3 d 左右加液，1 周左右換液，2～3 周細胞融合達 90% 左右行胰蛋白酶消化傳代培養。采用Ⅱ型膠原和聚蛋白多糖（Aggrecan）細胞免疫熒光法鑒定為髓核細胞[3]。
1.4 SDF-1 過表達慢病毒轉染人退變 NPCs
取第 1 代單層培養的 NPCs 進行慢病毒轉染。轉染前 1 d 以 5×104 個/孔密度將 NPCs 種植于 6 孔板中，轉染前 30 min 觀察細胞融合度達 30%～50%，更換新鮮的完全培養基。首先將 SDF-1 過表達慢病毒原液稀釋成 1×106TU/mL 的病毒工作液，將 10 μL 病毒工作液和 10 μL 濃度為 50 μg/mL 的 Polybrene 混合加入 1 mL 完全培養基中，上下顛倒輕輕混勻，室溫下靜置 15 min，每孔加入 1 mL 上述轉染復合物，感染復數約為 50（預實驗得到的最佳感染復數）。72 h 后熒光顯微鏡觀察熒光強度；Western blot 法（見 1.6.2 方法）檢測轉染后 SDF-1 蛋白表達，驗證其轉染效率，以未轉染細胞為對照。SDF-1 過表達序列：上游 5'-AGGTCGA-CTCTAGAGGATCCCGCCACCATGAACGCCAAG-GTCGTG-3'；下游 5'-AGTCCATGGTGGCGACC-GGCTTGTTTAAAGCTTTCTCCAGG-3'。
1.5 人退變 NPCs 與人 VECs 共培養
取 HMEC-1 細胞作為本實驗的人 VECs，與三維培養的人退變 NPCs 共培養。具體方法：將 HMEC-1 以平面培養方式種植于 6 孔板中，將同上法轉染 72 h 后的第 2 代人退變 NPCs 種植于 alvetex? 三維培養支架上，兩者相互獨立生長，但通用含 10%FBS 的 DMEM/F12 培養基，于 37℃、5%CO2 無菌細胞孵箱中共培養。共培養至檢測時間點后，移除上方含 NPCs 的三維支架，采用常規胰蛋白酶消化法收集 HMEC-1 進行后續檢測。以未轉染慢病毒 NPCs 的共培養體系作為對照組。
1.6 觀測指標
1.6.1 掃描電鏡觀察 共培養 72 h 后，取出培養孔中的 alvetex? 三維培養支架材料，2.5% 戊二醛固定 30 min；PBS 緩沖液沖洗 5 min×3 次，梯度乙醇常規脫水，采用叔丁醇置換，行臨界點干燥后噴金，掃描電鏡觀察人退變 NPCs 在 alvetex? 三維培養支架中的生長狀態。
1.6.2 Western blot 檢測蛋白表達 采用 RIPA 裂解液消化、提取各處理組細胞總蛋白，BCA 法檢測蛋白濃度。以每孔 50 μg 的相同蛋白質量行 SDS-PAGE 凝膠電泳，電轉至聚偏氟乙烯膜，轉膜后用 5%BCA 封閉 1 h，加入小鼠抗人 SDF-1 單克隆抗體，小鼠抗人 p-Akt 和總 Akt 單克隆抗體。4℃ 過夜，第 2 天復溫后加入二抗孵育 1 h，充分洗膜后加 ECL 顯色反應。分別檢測轉染組、未轉染組和抑制劑組（轉染組中加入 GSK690693）p-Akt 和總 Akt 蛋白表達。
1.6.3 細胞凋亡檢測 采用膜聯蛋白Ⅴ（AnnexinⅤ）-PE/碘化丙啶（propidium iodide，PI）雙染法檢測細胞凋亡，具體方法：共培養 72 h 后，收集轉染組和非轉染組 HMEC-1，胰蛋白酶消化 HMEC-1 后計數細胞，取 1×104 個 HMEC-1 重懸于結合緩沖液，依次加入 AnnexinⅤ和 PI 進行標記，37℃ 孵育 1 h 后，采用流式細胞儀檢測，Flowjo 軟件對結果進行分析，早期凋亡細胞在 Annexin V+/7-AAD- 象限，晚期凋亡細胞在 Annexin V+/7-AAD+ 象限，將這兩個象限各自細胞比例相加即為總的細胞凋亡率。
1.6.4 ELISA 檢測 VEGF 表達 分別取轉染組和未轉染組培養基 10 μL/孔加入酶標板，37℃ 孵育 90 min；加入 100 μL 生物素化抗體工作液，37℃ 孵育 60 min，洗滌 3 次；加入 100 μL 酶結合物工作液，37℃ 孵育 30 min，洗滌 5 次；加入 90 μL 底物溶液，37℃ 孵育 15 min，加入 50 μL 終止液，置于酶標儀 450 nm 波長處測量吸光度（A）值，計算 VEGF 蛋白表達量。
1.6.5 細胞計數試劑盒 8（cell counting kit 8，CCK-8）法檢測 HMEC-1 增殖情況 共培養 12、24、48、72 h 時檢測轉染組和未轉染組 HMEC-1 增殖情況；為檢測 Akt 信號通路對 HMEC-1 增殖的影響，在共培養體系中加入 GSK690693（抑制劑組），于 0、24 h 檢測各組 HMEC-1 增殖改變。具體方法：將 NPCs 和 HCME-1 以 1∶1 比例共培養于 96 孔板中，每種細胞初始數量為 1×104 個，每小時取3 孔觀察，37℃ 孵箱中培養 4 h 后顯微鏡觀察細胞是否貼壁。經相應處理后，各時間點每孔加入 10 μL CCK-8，輕輕混勻后放入孵箱繼續培養 1 h，然后在酶標儀上 450 nm 波長下測定A 值，間接反映細胞數量。
1.7 統計學方法
采用 SPSS19.0 統計軟件進行分析。數據以均數 ± 標準差表示，組間比較采用獨立樣本t 檢驗；檢驗水準取雙側α=0.05。
2 結果
2.1 NPCs 鑒定和三維培養觀察
細胞免疫熒光染色示Ⅱ型膠原和 Aggrecan 均呈陽性，于細胞質表達，分別呈綠色和紅色熒光，細胞核未見染色。見圖 1。
圖1
轉染 72 h 細胞免疫熒光法鑒定人退變 NPCs（熒光顯微鏡 ×200） a. Ⅱ型膠原 從左至右分別為Ⅱ型膠原、DAPI、二者重合； b. Aggrecan 從左至右分別為 Aggrecan、DAPI、二者重合
Figure1.
Identification of human degeneration NPCs by immunofluorescence assay at 72 hours after transfection (Fluorescence microscope×200) a. Collagen type II From left to right for collagen type II, DAPI, and merge; b. Aggrecan From left to right for Aggrecan, DAPI, and merge
為了維持 NPCs 表型，取 alvetex? 支架進行三維培養。alvetex? 三維培養支架材料的疏松孔洞直徑約 50 μm，掃描電鏡下在材料空隙中可見附著的人退變 NPCs，細胞呈立體球形，伸出偽足與支架材料相互黏附，細胞周圍可見大量分泌的細胞外基質。見圖 2。
圖2
人退變 NPCs 三維培養觀察（掃描電鏡 ×2 000） a. 支架材料； b. 人退變 NPCs，細胞呈立體球形定植于材料空隙中； c. 細胞伸出偽足與支架材料相互黏附，細胞周圍可見大量分泌的細胞外基質
Figure2.
Three dimensional culture observation of human degeneration NPCs (Scanning electron microscope×2 000) a. Scaffold material; b. Human degeneration NPCs, cells were spherical and located in the gap of the material; c. Cell extended parapodium with adhered to scaffold materials, a large number of secreted extracellular matrix was seen around cells
2.2 SDF-1 過表達慢病毒轉染人退變 NPCs 效果觀察
轉染 72 h 后熒光顯微鏡觀察可見明顯紅色熒光，Western blot 結果顯示轉染后 SDF-1 蛋白表達較未轉染組明顯上升，提示過表達慢病毒轉染 NPCs 效率較高，能有效過表達 SDF-1 蛋白。見圖 3。
圖3
SDF-1 過表達慢病毒轉染效率檢測 a. 轉染 72 h 熒光顯微鏡觀察（ ×200）；b. Western blot 檢測 SDF-1 表達 Mr：相對分子質量 1：未轉染組 2：轉染組
Figure3.
The transfection efficiency of SDF-1 over-expression lentivirus a. Fluorescence microscope observation at 72 hours after transfection( ×200); b. SDF-1 expression by Western blot Mr: Relative molecular mass 1: Untransfection group 2: Transfection group
2.3 SDF-1 過表達抑制 HMEC-1 細胞凋亡
共培養 72 h，轉染組 HMEC-1 的凋亡率為 4.57%±1.52%，顯著低于未轉染組的 8.33%±2.14%，差異有統計學意義（t=–5.039，P=0.007）。見圖 4。
圖4
SDF-1 過表達對 HMEC-1 凋亡的影響 a. 未轉染組；b. 轉染組
Figure4.
The influence of SDF-1 over-expression on HMEC-1 cell apoptosis a. Untransfection group; b. Transfection group
2.4 ELISA 檢測 VEGF 表達
共培養 72 h，轉染組培養基中 VEGF 濃度為（15.4±3.7）ng/μL，顯著高于未轉染組的（5.3±2.5）ng/μL，比較差異有統計學意義（t=7.302，P=0.002）。
2.5 Western blot 檢測 p-Akt 和總 Akt 蛋白表達
在共培養體系中，轉染組 p-Akt 蛋白表達量顯著高于未轉染組，抑制劑組加入 GSK690693 作用后 p-Akt 表達被顯著抑制；3 組總 Akt 蛋白表達量無明顯差異。見圖 5。
圖5
Western blot 檢測各組 p-Akt 及總 Akt 蛋白表達 a. 未轉染組； b. 轉染組； c. 抑制劑組
Figure5.
p-Akt and total Akt protein expressions by Western blot a. Untransfection group; b. Transfection group; c. Inhibitor group
2.6 CCK-8 檢測細胞增殖情況
共培養 24 h 后轉染組 HMEC-1 增殖情況均優于未轉染組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 6。共培養 24 h，轉染組 HMEC-1 增殖情況顯著高于未轉染組及抑制劑組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 7。
圖6
CCK-8 法檢測轉染組及未轉染組 HMEC-1 增殖情況
Figure6.
HMEC-1 proliferation of transfection group and untransfection group by CCK-8 assay
圖7
CCK-8 法檢測共培養 0、24 h 轉染組、未轉染組及抑制劑組 HMEC-1 增殖情況
Figure7.
HMEC-1 proliferation of transfection group, untransfection group, and inhibitor group at immediate and 24 hours after co-culture by CCK-8 assay
3 討論
SDF-1 是人體中一類重要的趨化因子，在正常生理狀態下，其可以募集帶有趨化因子受體 4（chemokine receptor 4，CXCR4）受體的炎性細胞或干細胞前往損傷部位，起到組織修復重建的作用。Pereira 等[9] 將含有 SDF-1 的透明質酸凝膠置入牛椎間盤后發現，其可使 MSCs 高效聚集在椎間盤中，從而延緩椎間盤退變。但 Zhang 等[10] 發現，在椎間盤的病理狀態下，突出的椎間盤組織中 SDF-1 和 CXCR4 表達明顯上升。本課題組的前期研究同樣表明，SDF-1 可促進退變 NPCs 的凋亡[7]。一個正常成熟的椎間盤內部無血管組織，其內在封閉的髓核組織成為人體內最大的抗原組織。組織學和影像學研究發現，在退變的椎間盤內部存在大量毛細血管組織，因此一旦有炎性細胞進入，將造成抗原-抗體反應，這也是椎間盤源性疼痛的一個潛在原因[11]。如何在早期抑制血管長入，從而避免后續的免疫炎性反應成為本研究的預期目標設想。本研究結果發現，高表達的 SDF-1 有利于血管內皮細胞株 HMEC-1 的增殖，而這些調控作用或許與 NPCs 中 Akt 信號通路的激活有關。
既往研究報道 NPCs 在體外二維培養條件下容易失去細胞表型，不能真實反映體內生理病理狀況。alvetex? 三維培養支架是一種高度疏松的交聯聚苯乙烯支架，形成的疏松孔洞直徑 36～40 μm，孔洞間的連通縫隙 12～14 μm，并被截成 200 μm 厚的薄片。它提供了一個非常合適的三維結構，細胞可在此環境里進行增殖、遷移、分化及執行各種生物學功能。細胞保持三維形態，并與相鄰細胞建立更緊密的相互聯系。
既往研究表明，高表達的 SDF-1 是新生血管形成的必要條件[12-13]。因此，我們采用了退變 NPCs 和 HMEC-1 體外共培養的方式，研究退變 NPCs 中高表達 SDF-1 對于 HMEC-1 的細胞增殖影響。結果表明 SDF-1 在慢病毒轉染后，熒光明顯且蛋白水平表達顯著增高，說明慢病毒轉染成功。Jia 等[14] 研究報道在退變椎間盤組織中 SDF-1 和 VEGF 表達密切相關，均呈現高表達。而本研究在三維共培養條件下，當 NPCs 的 SDF-1 高表達后，培養液的 VEGF 水平明顯增高，提示 SDF-1 可促進 VEGF 表達增高。Chang 等[15] 研究表明，SDF-1 在糖尿病新生血管化的發病機制中可有效促進 VEGF 水平的表達增高。本研究進一步的 CCK-8 檢測表明，SDF-1 高表達后使得 HMEC-1 增殖率顯著升高。由此可見，在退變椎間盤組織中 SDF-1 的高表達同樣是新生毛細血管長入的潛在原因。因此，通過抑制 SDF-1 的表達從而減少新生血管在退變椎間盤中的長入，進一步抑制炎性反應，成為今后一個有潛力的治療椎間盤退行性疾病的手段。
本研究的不足之處在于對 SDF-1 對 VEGF 表達調控機制的研究過少，我們只探討了 SDF-1 可促進 Akt 磷酸化水平的影響，而未探討其上下游許多關鍵靶點的表達情況，如 PTEN、P53 等。但基于本研究發現 SDF-1 對 HMEC-1 有較強的促增殖作用，且可顯著提高局部 VEGF 的表達水平，為后續實驗奠定了一定基礎。其次，本研究缺少體內實驗數據，我們擬在下一步實驗中選取退變椎間盤犬類模型，通過局部病毒感染方式觀察 SDF-1 在體內對新生血管化的確切作用及其具體機制，為椎間盤退行性疾病的治療提供新思路。
綜上述，本研究通過慢病毒介導的過表達系統靶向調控退變 NPCs 的 SDF-1 表達，利用 alvetex? 三維培養支架對于 NPCs 進行體外三維培養后再與 HMEC-1 共培養，結果顯示 SDF-1 過表達后可顯著提高 VEGF 的表達量，從而進一步提高 HMEC-1 增殖率。這一調控機制或許與 SDF-1-Akt 信號通路密切相關。在今后實驗中，我們將進一步研究是否能夠通過抑制退變椎間盤中 SDF-1 的高表達，從而抑制新生血管的長入，進而避免局部炎性反應的發生，為揭示椎間盤退行性疾病的發病機制尋找新的治療靶點和提供新的思路。
