引用本文： 高尚, 唐康來, 張吉強, 楊志金, 崔海峰, 李跑, 唐紅, 周梅. 循環牽拉對大鼠跟腱來源肌腱干細胞c-fos基因表達的影響. 中國修復重建外科雜志, 2017, 31(1): 85-90. doi: 10.7507/1002-1892.201609014 復制
肌腱病是最常見的運動損傷性疾病，臨床表現為疼痛和炎性反應，目前認為重復過度使用引起肌腱漸進性退變是導致該病的主要原因[1-2]。肌腱病的組織發生大量異位骨化和脂肪化，但發生機制尚不明確。2007 年 Bi 等[3]發現了存在于肌腱中的肌腱干細胞（tendon stem cells，TSCs），研究表明 TSCs 是肌腱細胞的重要前體細胞，具有多向分化潛能[4-5]，在適度牽拉條件下向成腱方向分化，而在過度牽拉條件下向成骨、成脂肪等非腱性方向分化[6]。肌腱病組織的異常表現可能與 TSCs 的異常分化有關，這為研究肌腱病的發病機制提供了新思路，也使得研究機械牽拉刺激對細胞基因表達的影響顯得尤為重要。
立早基因是細胞經外部刺激后最先表達的一組基因，是聯系細胞生化改變與細胞最終對刺激發生特異性反應的中介物，因此又被認為是第三信使[7]。其中 c-fos 基因是即刻早期基因家族成員之一，含 3.5 kb 堿基的 DNA 序列，由 4 個外顯子和 3 個內含子組成，可轉錄為 2.2 kb 堿基的成熟 mRNA。在肌腱愈合過程中，c-fos 可能參與激活再生反應、刺激生成Ⅰ型膠原蛋白[8]。同時，c-fos 轉錄的上調已被證實是機械刺激轉錄反應中較早的環節，它可能在根本上導致了負荷相關的細胞基質重塑[9]。在心肌細胞[10]、肌細胞[11]、內皮細胞[12]、成骨細胞[13-14]和骨母細胞[15]等多種細胞中均存在機械刺激后 c-fos 基因的早期表達。然而，機械牽拉刺激對 TSCs 的c-fos 表達影響尚不清楚。為此，本實驗采用自行設計的體外細胞單軸循環牽伸載荷模型[16]，對 TSCs 進行不同條件的牽伸刺激，探討牽伸對 c-fos 基因表達的影響，以期為肌腱病發病機制研究及治療提供新思路。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
8 周齡雄性 SD 大鼠 3 只，體質量 200～250 g，由第三軍醫大學實驗動物中心提供。
DMEM 培養基、胰蛋白酶（HyClone公司，美國）；FBS（GIBCO公司，美國）；纖連蛋白、分散酶、Ⅰ型膠原酶、中性蛋白酶（Sigma 公司，美國）；RNAiso Plus 試劑盒、PrimeScript 逆轉錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq Ⅲ（Takara公司，日本）。iCycler 熒光定量 PCR 儀（Bio-Rad 公司，美國）。微溝槽硅樹脂細胞培養皿由本科室自制。
細胞牽拉器由本科室自行研制[16]，包括機械部分和電子控制部分，通過電子控制部分控制機械部分驅動硅樹脂細胞培養皿支架做往復運動，從而使貼附于培養皿表面的細胞獲得體外機械牽拉。不同牽拉應變量以牽拉位移距離表示[1]。
1.2 TSCs的提取、培養和傳代
大鼠跟腱來源 TSCs 分離及培養參照 Rui 等[17]和胡超等[18]的方法。取 3 只 SD 大鼠，CO2處死后取出雙側跟腱，剔除腱鞘及腱周結締組織，只取中間部分的屈肌腱。將肌腱均勻剪碎成 1 mm×1 mm 大小，加入 2 mL 消化液（含 3 mg/mL Ⅰ型膠原酶和 4 mg/mL 中性蛋白酶），37℃ 孵箱消化 1.5 h。加入含 15%FBS 的DMEM 培養基 2 mL 中止消化后，以離心半徑 10 cm、1 000 r/min 離心 8 min。用含 15%FBS 的 DMEM 培養基4 mL 懸浮，連同可能未消化完全的肌腱殘留組織直接種于培養皿中，加入含10%FBS的DMEM培養基，置于37℃、5% CO2溫箱中孵育。4～5 d 后換液，培養 8～10 d，可觀察到原代細胞長滿。細胞擴增后，取第 3 代用于相關實驗。TSCs的鑒定按本課題組胡超等[18]的方法進行。
1.3 實驗方法
將表面光滑的硅樹脂培養皿消毒后烘干備用。用纖連蛋白處理培養皿表面后，將 5×105 個第 3 代 TSCs 接種于硅樹脂培養皿。接種 24 h 后，倒置相差顯微鏡觀察 TSCs 貼壁生長情況，觀察有無細胞脫落及漂浮。體外細胞牽拉器頻率設置為 1 Hz，整個牽拉過程均在 37℃、5%CO2 孵箱中進行。
1.3.1 c-fos mRNA 相對表達量隨牽拉時間的變化 分別用 4% 和 8% 牽拉強度牽拉細胞，并在牽拉 0、5、15、30、60、120 min 后收集細胞進行實時熒光定量 PCR 檢測，觀察 c-fos mRNA 相對表達量隨牽拉時間的變化，并找到表達最高時間點（Tmax）。
1.3.2 c-fos mRNA 相對表達量隨牽拉強度的變化 分別用 0、2%、4%、6%、8%和12% 的牽拉強度，在牽拉 Tmax 后收集細胞，觀察 c-fos mRNA 相對表達量隨牽拉強度的變化。
1.3.3 c-fos mRNA 相對表達量經短時刺激后的變化 分別用 2%、4%、6%、8% 和 12% 的牽拉強度，對 TSCs 分別經 0、5、15 min 短時間牽拉后靜置至 Tmax，觀察 c-fos mRNA 相對表達量經短時刺激后的變化情況。
1.3.4 TSCs 分化標志基因相對表達量隨牽拉強度和牽拉時間的變化 分別用 4% 和 8% 牽拉強度牽拉細胞，并在牽拉 0、Tmax、120 min 后收集細胞，檢測細胞分化標志基因的相對表達量。
1.3.5 實時熒光定量 PCR 檢測方法 使用 RNaiso Plus 試劑盒提取細胞總 RNA，并逆轉錄為 cDNA。檢測 c-fos，成肌腱分化標志基因Ⅰ型膠原、腱調蛋白（tenomodulin，TNMD），成骨分化標志基因 Runx2、遠端缺失基因 5（distal-less homeobox 5，Dlx5），成脂肪分化標志基因脂肪酸結合蛋白 4（fatty acid binding protein 4，FABP4）等基于表達，以 GAPDH 作為內參。各基因引物序列：c-fos 上游 5'-CTACTACCATTCCCCAGCCG-3'，下游 5'-CTCCCGCTCTGGCGTAAG-3'；Ⅰ型膠原上游 5'-TGGTGAGACGTGGAAACCTG-3'，下游 5'-CTTGGGTCCCTCGACTCCTA-3'；TNMD 上游 5'-GCGACAATGTGACTATGTAC-3'，下游 5'-GTCTTCTCCACCTTCACTTG-3'；Runx2 上游 5'-GAACTCAGCACCAAGTCCTTT-3'，下游 5'-TGGCATCTACGGCACTCTA-3'；Dlx5 上游 5'-CTTATGCGGACTACGGCTACG-3'，下游 5'-CCTGGGTTTACGAACTTTCTTTG-3'；FABP4 上游5'-CGAGATTTCCTTCAAACTGGG-3'，下游 5'-TCTTGTAGAAGTCACGCCTTTC-3'；GAPDH 上游5'-TGACTTCAACAGCAACTC-3'，下游 5'-TGTAGCCATATTCATTGTCA-3'。PCR 反應條件：95℃ 預變性 8 min；95℃ 變性 10 s、60℃ 退火 20 s、72℃ 延伸 25 s，40 個循環。溶解曲線分析為 55～95℃，0.5℃/15 s。采用 2-ΔΔCt法分析目的基因相對表達量，所有實驗均重復 3 次。
1.4 統計學方法
采用 GraphPad Prism 6.01 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用多因素方差分析，兩兩比較采用 Tukey 法；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 c-fos mRNA相對表達量隨牽拉時間的變化
與 0 min 相比，在 4% 和 8% 牽拉強度下，c-fos mRNA 相對表達量均在牽拉 15 min 時顯著升高，牽拉 30 min 時達峰值，差異均有統計學意義（P<0.05）；牽拉至 60 min時c-fos mRNA 相對表達量恢復至起始水平，與 0 min 比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 1。因此Tmax 為 30 min。
2.2 c-fos mRNA相對表達量隨牽拉強度的變化
牽拉 30 min 條件下，與牽拉強度 0 比較，2%、4%、6%、8% 和 12% 牽拉強度下 c-fos mRNA 相對表達量均顯著升高，且 6%、8% 和 12% 牽拉強度較 2%、4% 牽拉強度進一步升高，差異均有統計學意義（P<0.05）；2%、4% 間及6%、8%、12% 間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 2。
2.3 c-fos mRNA相對表達量經短時刺激后的變化
各牽拉強度下僅牽拉 5 min c-fos mRNA 相對表達量即有明顯升高，與 0 min 比較差異均有統計學意義（P<0.05）；繼續牽拉至 15 min和靜置至 30 min，c-fos mRNA 相對表達量進一步升高，與牽拉 5 min 時比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 3。
2.4 TSCs分化標志基因相對表達量隨牽拉強度和牽拉時間的變化
與 0 min 相比，4% 牽拉強度下，在牽拉 30 min 和 120 min 時，各分化標志基因相對表達量差異均無統計學意義（P>0.05）。而 8% 牽拉強度下，在牽拉 30 min 時，Runx2 基因相對表達量顯著升高，在牽拉 120 min 時，Ⅰ型膠原、TNMD、Dlx5、Runx2 基因相對表達量均升高，差異均有統計學意義（P>0.05）；FABP4 基因相對表達量在牽拉 30 min 和 120 min 時，與0 min比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 4。
圖1
不同牽拉強度下牽拉不同時間c-fos mRNA相對表達量
Figure1.
The relative expressions of c-fos mRNA at different time points under different stretch intensities
圖2
不同牽拉強度牽拉30 min c-fos mRNA相對表達量
Figure2.
The relative expressions of c-fos mRNA under different stretch intensities at 30 minutes
圖3
不同牽拉強度經0、5、15 min短時間牽拉后靜置至30 min c-fos mRNA相對表達量
Figure3.
The relative expressions of c-fos mRNA under different stretch intensities for 0, 5, and 15 minutes and followed by incubation at relax status up to 30 minutes
圖4
不同牽拉強度下經0、30、120 min牽拉后TSCs分化標志基因相對表達量 a.Ⅰ型膠原；b. TNMD；c. Dlx5；d. Runx2；e. FABP4
Figure4.
The relative expressions of differentiation related genes mRNA under different stretch intensities at 0, 30, or 120 minutes a. Collagen type I; b. TNMD; c. Dlx5; d. Runx2; e. FABP4
3 討論
肌腱在運動過程中經過反復牽拉，使TSCs在軸向上發生形變。在過度反復牽拉過程中，可能由于損傷與修復的失衡而導致肌腱微損傷進行性加重，從而導致肌腱病，嚴重時甚至出現肌腱斷裂，這在運動員中很常見。由此可見，牽拉作用于肌腱后，在一定條件下具有損害效應。然而，對于已產生肌腱病的運動員或肌腱手術后的患者，采取肌腱牽拉運動卻能改善預后，加快肌腱恢復速度[19]。這說明牽拉應力對于肌腱的影響取決于牽拉方式，以及牽拉強度、時間等一系列因素。
已有多項研究證實，許多種類的細胞在經過機械牽拉刺激后，其立早基因（如 c-fos、c-jun、Egr-1、c-myc 等）能夠快速表達，其中 c-fos 表達的研究較為廣泛[20]。然而，對于同樣經受牽拉應力的 TSCs，c-fos 的表達情況尚未見報道。因此，本實驗通過自制體外細胞單軸循環牽拉載荷模型對 TSCs 的牽拉，觀察 c-fos 的早期表達，對進一步研究機械信號-基因信號耦聯機制具有重要意義。
Zhang 等[6]的研究表明，4% 和8% 體外細胞牽拉強度對 TSCs 的分化分別具有腱向分化和非腱向分化作用。因此，我們首先利用 4% 和 8% 的牽拉強度對 TSCs 進行多時間點牽拉觀察。結果發現在機械牽拉 15 min 后 c-fos mRNA 相對表達量顯著上升，在 30 min 時達峰值。繼續牽拉后 c-fos mRNA 相對表達量驟降，于 60 min 后回到最初水平。c-fos mRNA 相對表達量在牽拉過程中驟降可能與 mRNA 分子的多聚 A 尾被酶降解有關[20]。
通過以上實驗發現，在牽拉 30 min 時c-fos mRNA 相對表達量達最大。因此，我們通過 2%~12% 的牽拉強度牽拉30 min，研究牽拉強度與 c-fos 表達的關系。之所以選擇此牽拉強度范圍是由于肌腱根據應力-應變曲線，2% 牽拉強度時肌腱纖維開始伸直，至 12% 時已對肌腱纖維產生明顯損傷作用[21]。實驗結果顯示，2% 的牽拉強度即可使 c-fos mRNA 相對表達量升高，并且與 4% 牽拉強度無明顯差異；而 6% 牽拉強度時其表達量進一步升高，并且與 8%、12% 牽拉強度無明顯差異。這表明 c-fos mRNA 的表達具有一定牽伸強度依賴性。
為了檢測短時間牽拉后 c-fos 基因的表達，我們將細胞分別在各牽拉強度下牽拉 5、15 min，然后靜置孵育至 30 min。結果發現僅牽伸 5 min，c-fos 即可得到表達。這與既往研究報道的持續牽拉心肌細胞[22]或子宮平滑肌細胞[20]1 min 即可引起 c-fos mRNA 的表達相似。表明 TSCs 對刺激的反應非常敏感，極短時間的牽拉刺激即可引起 c-fos 表達，從而引發其下游的鏈式反應。同時，我們也發現 c-fos 的轉錄完成需要數分鐘時間，因為在 4% 和 8% 牽拉強度下，牽拉 5 min 時立即檢測，c-fos mRNA 相對表達量與 0 min時無統計學差異；但牽拉 5 min，靜置孵育至 30 min時，c-fos mRNA 相對表達量較 0 min 顯著增加。
最后我們檢測了 4% 和 8% 牽拉強度下 TSCs 分化標志基因的轉錄情況。結果發現 8% 牽拉強度下，經過 120 min 刺激后，大部分標志基因的表達量明顯升高，而 4% 牽拉強度在 120 min 牽拉下各指標與 0 min 相比無統計學差異。進一步表明了不同牽拉強度不僅在長時間作用后對 TSCs 的分化產生不同影響，還可能在牽拉早期已對不同基因的表達產生了不同作用。
綜上述，不同牽拉強度對 TSCs 分化方向具有不同影響，并且起著非常重要的作用。通過對 TSCs 立早基因 c-fos 表達的研究表明，在牽拉初期，牽拉強度、時間已對細胞產生了不同影響，可能進一步影響了 TSCs 的分化方向。本研究僅研究了短時間牽拉效果，考慮到不同蛋白組裝的時間差異，檢測僅在基因層面進行，在排除其他干擾條件后 c-fos 對下游各分化基因的影響還有待進一步研究。
肌腱病是最常見的運動損傷性疾病，臨床表現為疼痛和炎性反應，目前認為重復過度使用引起肌腱漸進性退變是導致該病的主要原因[1-2]。肌腱病的組織發生大量異位骨化和脂肪化，但發生機制尚不明確。2007 年 Bi 等[3]發現了存在于肌腱中的肌腱干細胞（tendon stem cells，TSCs），研究表明 TSCs 是肌腱細胞的重要前體細胞，具有多向分化潛能[4-5]，在適度牽拉條件下向成腱方向分化，而在過度牽拉條件下向成骨、成脂肪等非腱性方向分化[6]。肌腱病組織的異常表現可能與 TSCs 的異常分化有關，這為研究肌腱病的發病機制提供了新思路，也使得研究機械牽拉刺激對細胞基因表達的影響顯得尤為重要。
立早基因是細胞經外部刺激后最先表達的一組基因，是聯系細胞生化改變與細胞最終對刺激發生特異性反應的中介物，因此又被認為是第三信使[7]。其中 c-fos 基因是即刻早期基因家族成員之一，含 3.5 kb 堿基的 DNA 序列，由 4 個外顯子和 3 個內含子組成，可轉錄為 2.2 kb 堿基的成熟 mRNA。在肌腱愈合過程中，c-fos 可能參與激活再生反應、刺激生成Ⅰ型膠原蛋白[8]。同時，c-fos 轉錄的上調已被證實是機械刺激轉錄反應中較早的環節，它可能在根本上導致了負荷相關的細胞基質重塑[9]。在心肌細胞[10]、肌細胞[11]、內皮細胞[12]、成骨細胞[13-14]和骨母細胞[15]等多種細胞中均存在機械刺激后 c-fos 基因的早期表達。然而，機械牽拉刺激對 TSCs 的c-fos 表達影響尚不清楚。為此，本實驗采用自行設計的體外細胞單軸循環牽伸載荷模型[16]，對 TSCs 進行不同條件的牽伸刺激，探討牽伸對 c-fos 基因表達的影響，以期為肌腱病發病機制研究及治療提供新思路。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
8 周齡雄性 SD 大鼠 3 只，體質量 200～250 g，由第三軍醫大學實驗動物中心提供。
DMEM 培養基、胰蛋白酶（HyClone公司，美國）；FBS（GIBCO公司，美國）；纖連蛋白、分散酶、Ⅰ型膠原酶、中性蛋白酶（Sigma 公司，美國）；RNAiso Plus 試劑盒、PrimeScript 逆轉錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq Ⅲ（Takara公司，日本）。iCycler 熒光定量 PCR 儀（Bio-Rad 公司，美國）。微溝槽硅樹脂細胞培養皿由本科室自制。
細胞牽拉器由本科室自行研制[16]，包括機械部分和電子控制部分，通過電子控制部分控制機械部分驅動硅樹脂細胞培養皿支架做往復運動，從而使貼附于培養皿表面的細胞獲得體外機械牽拉。不同牽拉應變量以牽拉位移距離表示[1]。
1.2 TSCs的提取、培養和傳代
大鼠跟腱來源 TSCs 分離及培養參照 Rui 等[17]和胡超等[18]的方法。取 3 只 SD 大鼠，CO2處死后取出雙側跟腱，剔除腱鞘及腱周結締組織，只取中間部分的屈肌腱。將肌腱均勻剪碎成 1 mm×1 mm 大小，加入 2 mL 消化液（含 3 mg/mL Ⅰ型膠原酶和 4 mg/mL 中性蛋白酶），37℃ 孵箱消化 1.5 h。加入含 15%FBS 的DMEM 培養基 2 mL 中止消化后，以離心半徑 10 cm、1 000 r/min 離心 8 min。用含 15%FBS 的 DMEM 培養基4 mL 懸浮，連同可能未消化完全的肌腱殘留組織直接種于培養皿中，加入含10%FBS的DMEM培養基，置于37℃、5% CO2溫箱中孵育。4～5 d 后換液，培養 8～10 d，可觀察到原代細胞長滿。細胞擴增后，取第 3 代用于相關實驗。TSCs的鑒定按本課題組胡超等[18]的方法進行。
1.3 實驗方法
將表面光滑的硅樹脂培養皿消毒后烘干備用。用纖連蛋白處理培養皿表面后，將 5×105 個第 3 代 TSCs 接種于硅樹脂培養皿。接種 24 h 后，倒置相差顯微鏡觀察 TSCs 貼壁生長情況，觀察有無細胞脫落及漂浮。體外細胞牽拉器頻率設置為 1 Hz，整個牽拉過程均在 37℃、5%CO2 孵箱中進行。
1.3.1 c-fos mRNA 相對表達量隨牽拉時間的變化 分別用 4% 和 8% 牽拉強度牽拉細胞，并在牽拉 0、5、15、30、60、120 min 后收集細胞進行實時熒光定量 PCR 檢測，觀察 c-fos mRNA 相對表達量隨牽拉時間的變化，并找到表達最高時間點（Tmax）。
1.3.2 c-fos mRNA 相對表達量隨牽拉強度的變化 分別用 0、2%、4%、6%、8%和12% 的牽拉強度，在牽拉 Tmax 后收集細胞，觀察 c-fos mRNA 相對表達量隨牽拉強度的變化。
1.3.3 c-fos mRNA 相對表達量經短時刺激后的變化 分別用 2%、4%、6%、8% 和 12% 的牽拉強度，對 TSCs 分別經 0、5、15 min 短時間牽拉后靜置至 Tmax，觀察 c-fos mRNA 相對表達量經短時刺激后的變化情況。
1.3.4 TSCs 分化標志基因相對表達量隨牽拉強度和牽拉時間的變化 分別用 4% 和 8% 牽拉強度牽拉細胞，并在牽拉 0、Tmax、120 min 后收集細胞，檢測細胞分化標志基因的相對表達量。
1.3.5 實時熒光定量 PCR 檢測方法 使用 RNaiso Plus 試劑盒提取細胞總 RNA，并逆轉錄為 cDNA。檢測 c-fos，成肌腱分化標志基因Ⅰ型膠原、腱調蛋白（tenomodulin，TNMD），成骨分化標志基因 Runx2、遠端缺失基因 5（distal-less homeobox 5，Dlx5），成脂肪分化標志基因脂肪酸結合蛋白 4（fatty acid binding protein 4，FABP4）等基于表達，以 GAPDH 作為內參。各基因引物序列：c-fos 上游 5'-CTACTACCATTCCCCAGCCG-3'，下游 5'-CTCCCGCTCTGGCGTAAG-3'；Ⅰ型膠原上游 5'-TGGTGAGACGTGGAAACCTG-3'，下游 5'-CTTGGGTCCCTCGACTCCTA-3'；TNMD 上游 5'-GCGACAATGTGACTATGTAC-3'，下游 5'-GTCTTCTCCACCTTCACTTG-3'；Runx2 上游 5'-GAACTCAGCACCAAGTCCTTT-3'，下游 5'-TGGCATCTACGGCACTCTA-3'；Dlx5 上游 5'-CTTATGCGGACTACGGCTACG-3'，下游 5'-CCTGGGTTTACGAACTTTCTTTG-3'；FABP4 上游5'-CGAGATTTCCTTCAAACTGGG-3'，下游 5'-TCTTGTAGAAGTCACGCCTTTC-3'；GAPDH 上游5'-TGACTTCAACAGCAACTC-3'，下游 5'-TGTAGCCATATTCATTGTCA-3'。PCR 反應條件：95℃ 預變性 8 min；95℃ 變性 10 s、60℃ 退火 20 s、72℃ 延伸 25 s，40 個循環。溶解曲線分析為 55～95℃，0.5℃/15 s。采用 2-ΔΔCt法分析目的基因相對表達量，所有實驗均重復 3 次。
1.4 統計學方法
采用 GraphPad Prism 6.01 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用多因素方差分析，兩兩比較采用 Tukey 法；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 c-fos mRNA相對表達量隨牽拉時間的變化
與 0 min 相比，在 4% 和 8% 牽拉強度下，c-fos mRNA 相對表達量均在牽拉 15 min 時顯著升高，牽拉 30 min 時達峰值，差異均有統計學意義（P<0.05）；牽拉至 60 min時c-fos mRNA 相對表達量恢復至起始水平，與 0 min 比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 1。因此Tmax 為 30 min。
2.2 c-fos mRNA相對表達量隨牽拉強度的變化
牽拉 30 min 條件下，與牽拉強度 0 比較，2%、4%、6%、8% 和 12% 牽拉強度下 c-fos mRNA 相對表達量均顯著升高，且 6%、8% 和 12% 牽拉強度較 2%、4% 牽拉強度進一步升高，差異均有統計學意義（P<0.05）；2%、4% 間及6%、8%、12% 間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 2。
2.3 c-fos mRNA相對表達量經短時刺激后的變化
各牽拉強度下僅牽拉 5 min c-fos mRNA 相對表達量即有明顯升高，與 0 min 比較差異均有統計學意義（P<0.05）；繼續牽拉至 15 min和靜置至 30 min，c-fos mRNA 相對表達量進一步升高，與牽拉 5 min 時比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 3。
2.4 TSCs分化標志基因相對表達量隨牽拉強度和牽拉時間的變化
與 0 min 相比，4% 牽拉強度下，在牽拉 30 min 和 120 min 時，各分化標志基因相對表達量差異均無統計學意義（P>0.05）。而 8% 牽拉強度下，在牽拉 30 min 時，Runx2 基因相對表達量顯著升高，在牽拉 120 min 時，Ⅰ型膠原、TNMD、Dlx5、Runx2 基因相對表達量均升高，差異均有統計學意義（P>0.05）；FABP4 基因相對表達量在牽拉 30 min 和 120 min 時，與0 min比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 4。
圖1
不同牽拉強度下牽拉不同時間c-fos mRNA相對表達量
Figure1.
The relative expressions of c-fos mRNA at different time points under different stretch intensities
圖2
不同牽拉強度牽拉30 min c-fos mRNA相對表達量
Figure2.
The relative expressions of c-fos mRNA under different stretch intensities at 30 minutes
圖3
不同牽拉強度經0、5、15 min短時間牽拉后靜置至30 min c-fos mRNA相對表達量
Figure3.
The relative expressions of c-fos mRNA under different stretch intensities for 0, 5, and 15 minutes and followed by incubation at relax status up to 30 minutes
圖4
不同牽拉強度下經0、30、120 min牽拉后TSCs分化標志基因相對表達量 a.Ⅰ型膠原；b. TNMD；c. Dlx5；d. Runx2；e. FABP4
Figure4.
The relative expressions of differentiation related genes mRNA under different stretch intensities at 0, 30, or 120 minutes a. Collagen type I; b. TNMD; c. Dlx5; d. Runx2; e. FABP4
3 討論
肌腱在運動過程中經過反復牽拉，使TSCs在軸向上發生形變。在過度反復牽拉過程中，可能由于損傷與修復的失衡而導致肌腱微損傷進行性加重，從而導致肌腱病，嚴重時甚至出現肌腱斷裂，這在運動員中很常見。由此可見，牽拉作用于肌腱后，在一定條件下具有損害效應。然而，對于已產生肌腱病的運動員或肌腱手術后的患者，采取肌腱牽拉運動卻能改善預后，加快肌腱恢復速度[19]。這說明牽拉應力對于肌腱的影響取決于牽拉方式，以及牽拉強度、時間等一系列因素。
已有多項研究證實，許多種類的細胞在經過機械牽拉刺激后，其立早基因（如 c-fos、c-jun、Egr-1、c-myc 等）能夠快速表達，其中 c-fos 表達的研究較為廣泛[20]。然而，對于同樣經受牽拉應力的 TSCs，c-fos 的表達情況尚未見報道。因此，本實驗通過自制體外細胞單軸循環牽拉載荷模型對 TSCs 的牽拉，觀察 c-fos 的早期表達，對進一步研究機械信號-基因信號耦聯機制具有重要意義。
Zhang 等[6]的研究表明，4% 和8% 體外細胞牽拉強度對 TSCs 的分化分別具有腱向分化和非腱向分化作用。因此，我們首先利用 4% 和 8% 的牽拉強度對 TSCs 進行多時間點牽拉觀察。結果發現在機械牽拉 15 min 后 c-fos mRNA 相對表達量顯著上升，在 30 min 時達峰值。繼續牽拉后 c-fos mRNA 相對表達量驟降，于 60 min 后回到最初水平。c-fos mRNA 相對表達量在牽拉過程中驟降可能與 mRNA 分子的多聚 A 尾被酶降解有關[20]。
通過以上實驗發現，在牽拉 30 min 時c-fos mRNA 相對表達量達最大。因此，我們通過 2%~12% 的牽拉強度牽拉30 min，研究牽拉強度與 c-fos 表達的關系。之所以選擇此牽拉強度范圍是由于肌腱根據應力-應變曲線，2% 牽拉強度時肌腱纖維開始伸直，至 12% 時已對肌腱纖維產生明顯損傷作用[21]。實驗結果顯示，2% 的牽拉強度即可使 c-fos mRNA 相對表達量升高，并且與 4% 牽拉強度無明顯差異；而 6% 牽拉強度時其表達量進一步升高，并且與 8%、12% 牽拉強度無明顯差異。這表明 c-fos mRNA 的表達具有一定牽伸強度依賴性。
為了檢測短時間牽拉后 c-fos 基因的表達，我們將細胞分別在各牽拉強度下牽拉 5、15 min，然后靜置孵育至 30 min。結果發現僅牽伸 5 min，c-fos 即可得到表達。這與既往研究報道的持續牽拉心肌細胞[22]或子宮平滑肌細胞[20]1 min 即可引起 c-fos mRNA 的表達相似。表明 TSCs 對刺激的反應非常敏感，極短時間的牽拉刺激即可引起 c-fos 表達，從而引發其下游的鏈式反應。同時，我們也發現 c-fos 的轉錄完成需要數分鐘時間，因為在 4% 和 8% 牽拉強度下，牽拉 5 min 時立即檢測，c-fos mRNA 相對表達量與 0 min時無統計學差異；但牽拉 5 min，靜置孵育至 30 min時，c-fos mRNA 相對表達量較 0 min 顯著增加。
最后我們檢測了 4% 和 8% 牽拉強度下 TSCs 分化標志基因的轉錄情況。結果發現 8% 牽拉強度下，經過 120 min 刺激后，大部分標志基因的表達量明顯升高，而 4% 牽拉強度在 120 min 牽拉下各指標與 0 min 相比無統計學差異。進一步表明了不同牽拉強度不僅在長時間作用后對 TSCs 的分化產生不同影響，還可能在牽拉早期已對不同基因的表達產生了不同作用。
綜上述，不同牽拉強度對 TSCs 分化方向具有不同影響，并且起著非常重要的作用。通過對 TSCs 立早基因 c-fos 表達的研究表明，在牽拉初期，牽拉強度、時間已對細胞產生了不同影響，可能進一步影響了 TSCs 的分化方向。本研究僅研究了短時間牽拉效果，考慮到不同蛋白組裝的時間差異，檢測僅在基因層面進行，在排除其他干擾條件后 c-fos 對下游各分化基因的影響還有待進一步研究。
