引用本文： 王斌, 席智杰, 梁倩倩, 米琨, 俸志斌. 基質誘導自體軟骨細胞移植治療股骨滑車軟骨損傷. 中國修復重建外科雜志, 2017, 31(1): 98-104. doi: 10.7507/1002-1892.201607097 復制
軟骨損傷可由創傷、感染、退行性變引起[1]，約20%接受膝關節鏡手術的患者合并有軟骨損傷[2-4]。很多軟骨損傷患者由于治療不及時導致骨性關節炎[5]，最終不得不接受關節融合術或關節置換術，嚴重影響了患者生活質量并加重了經濟負擔[6-9]。組織工程軟骨移植是治療大面積軟骨缺損的較好方法，但其移植物構建過程復雜，臨床療效尚需進一步評價。為了探索并拓展組織工程軟骨移植治療大面積軟骨缺損的應用前景，我院于 2012 年 6 月—2014 年 10 月采用基質誘導自體軟骨細胞移植（matrix-induced autologous chondrocyte implantation，MACI）治療大面積股骨滑車軟骨損傷 10 例，取得了良好的早期療效。報告如下。
1 臨床資料
1.1 一般資料
本組男 6 例，女 4 例；年齡 15～48 歲，平均 33 歲。左膝 3 例，右膝 7 例。9 例有明確外傷史（包括運動損傷 7 例、交通事故傷 2 例），1 例剝脫性骨軟骨炎。患者均表現為慢性膝關節疼痛，6 例伴有膝關節反復腫脹，其中 2 例浮髕試驗（+）。患者均無明顯屈伸受限，1 例麥氏征（+），3 例前抽屜試驗及Lachman（+），2 例側方應力試驗（+）。術前常規行膝關節正側位 X 線片及 MRI 檢查，初步判斷骨軟骨損傷部位：股骨內髁 6 例，股骨外髁 3 例，股骨滑車 1 例。 術前 MRI 提示合并半月板損傷 1 例、前交叉韌帶損傷 3 例及內、外側副韌帶部分撕裂 2 例。術前病灶深度為 2～7 mm、平均 2.80 mm，病灶面積 28.26～153.86 mm2、平均 84.85 mm2；術前疼痛視覺模擬評分（VAS）為（7.00±1.05）分，膝關節 Lysholm 評分為（59.80±13.29）分，膝關節運動 Tegner 評分為（2.10±0.74）分。明確診斷至關節鏡活檢手術時間為 5 d～3 個月，平均 14 d。本研究獲醫院醫學倫理委員會批準，術前患者均簽署知情同意書。
1.2 手術方法
1.2.1 關節鏡手術 于連續硬膜外麻醉下行患膝關節鏡下活檢。常規探查膝關節，發現合并半月板損傷 1 例，予以修整成形后 1 個月行 MACI；合并前交叉韌帶損傷 3 例，予以同側半腱肌、股薄肌肌腱重建前交叉韌帶，6 個月后行 MACI；合并內、外側副韌帶部分撕裂 2 例，未行手術處理，常規長腿支具固定 4 周后再行 MACI。另 4 例未合并其他損傷者于關節鏡活檢術后 2 周行 MACI。
1.2.2 人軟骨細胞-Bio-gide 膠原支架復合物（MACI膜）制備 采集患膝股骨滑車非負重區健康關節軟骨 200～300 mg 作為種子細胞來源，進行分離、培養并制備 MACI 膜（杭州明興生物科技有限公司完成制備）。將活檢取得的軟骨組織切成 5 mm×5 mm 大小軟骨片，PBS 沖洗 2 遍，按 Klagsbrun 法獲取軟骨細胞。將獲取的軟骨細胞加入有 10 mL DMEM 培養液的 50 mL 培養瓶，置于 37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱靜置培養，48 h 后全量換液，此后每 2 天換液 1 次。當細胞密度達 70% 融合后用 2.5 g/L 胰蛋白酶消化，按 1∶2 比例傳代培養。取第 3 代細胞，用 2.5 g/L 胰蛋白酶消化后調節細胞濃度為 5×107個/mL的細胞懸液。取細胞懸液 0.2 mL 加入每個 Bio-gide 膠原支架（Geistlich公司，瑞士）制備 MACI 膜，然后將 MACI 膜置于 100 mm 培養皿中，待細胞充分吸附在材料上后，加入含 10%FBS 的 DMEM 培養基，于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱進行培養，培養液每 2 天更換 1 次。連續培養 2 周后送臨床進行 MACI 膜移植，并分別于培養 24、48、72 h 行掃描電鏡觀察人軟骨細胞在 Bio-gide 膠原支架上的黏附和生長狀態。
1.2.3 Bio-gide 膠原支架力學測試方法 用 CP-25 型沖片機（上海申銳測試設備制造有限公司）將支架裁切成A、B 兩種規格測試片：A（長5 cm，中部寬度0.4 cm），B（2 cm×3 cm，在一端距邊緣 0.4 cm 處穿 1 根縫合線）。將測試片固定在 Instron3343 型力學測試機（Instron公司，英國）夾具上，進行扯斷拉長率、拉伸強度測試：啟動預設程序，微電腦控制器根據程序自動計算并顯示測試結果，保持數據，連續測試 3 片；縫合強度測試：將測試片 B 固定于測試機夾具兩端，一端固定縫合線，另一端直接固定測試片，啟動預設程序進行縫合強度測試，保持數據，連續測試 3 片。
1.2.4 MACI 膜植入術 以右膝外側股骨滑車為例。約 2 周后 MACI 膜制備完畢，再次入院施行 MACI 膜植入手術。于連續硬膜外麻醉下患者取平臥位，患膝屈曲 90°，根據缺損位置選擇髕旁外側切口，切開皮膚、皮下、關節囊，顯露右側股骨滑車負重區病變部位，用小刮匙刮除剝脫及病變的軟骨，必要時清理囊性變或壞死的軟骨下骨，用 11 號刀片修整軟骨缺損區創面為圓形或橢圓形。如果缺損區較大，需先行植骨術填充骨缺損區，再植入 MACI 膜。在軟骨缺損區用紗布修剪做一試膜，以試膜為樣板剪出形狀、大小相應的 MACI 膜，在修整好的缺損部位涂纖維蛋白膠后，將 MACI 膜貼于軟骨缺損區并按壓 1 min。屈伸患膝，如果 MACI 膜位置不變或松動，表明細胞膜固定良好，沖洗關節腔，逐層縫合切口，加壓包扎。
1.3 術后康復
術后康復鍛煉遵循個體化、循序漸進和全身鍛煉的原則。 術后 3～4 d 開始 CPM 機訓練，起始角度 15°，在患者舒適條件下每天增加 5～10°，3 周內達到完全生理活動范圍。3～6 周除 CMP 機和股四頭肌鍛煉外，還應進行坐姿伸膝鍛煉；4～6 周使用雙拐步行；6～12 周使用單拐，進行雙側閉鏈和開鏈運動，繼續股四頭肌鍛煉和直腿抬高；12 周后丟棄拐杖，完全負重，正常步態行走，可進行爬樓、踏車、跑步機上慢跑等運動，同期繼續進行平衡鍛煉。術后每個月隨訪 1 次，術后 3～12 個月門診復查攝患膝 MRI 評估軟骨愈合情況。
1.4 統計學方法
采用 SPSS17.0 統計軟件進行分析。數據以均數 ± 標準差表示，手術前后比較采用配對t 檢驗；檢驗水準取雙側α=0.05。
2 結果
本組患者 MACI 膜均成功制備。掃描電鏡觀察示，空白支架的結構連續性良好，膠原纖維結構清晰、交錯成疏松網狀、無凝塊。軟骨細胞呈圓形，在支架上沿膠原走向呈現導向性排列；軟骨細胞在支架上黏附、生長良好，鋪滿支架，分泌大量細胞外基質；隨著培養時間延長，軟骨細胞逐漸被外基質包埋。見圖 1。力學測試示，支架扯斷拉長率為 65.27%，拉伸強度為 26.81 MPa，縫合強度為 6.49 N，提示其力學性能良好。
本組患者 MACI 膜移植手術均獲成功，手術時間 43～99 min，平均 58.5 min；住院時間 6～15 d，平均 7 d。術后切口均Ⅰ期愈合。本組 10 例均獲隨訪，隨訪時間 9～16 個月，平均 12 個月。其中 4 例因受區清創后骨缺損較大予以髂骨取骨植骨術。所有移植的 MACI 膜與受區愈合時間為 12～16 周，平均 14 周。隨訪期間無軟骨剝脫、膝關節疼痛、神經血管損傷、深靜脈血栓形成及膝關節粘連等并發癥發生。末次隨訪時VAS評分為（1.30±0.82）分，Lysholm 評分為（94.00±3.19）分，Tegner 評分為（4.90±0.86）分，與術前比較差異均有統計學意義（t=12.060，P=0.000；t=–9.200，P=0.000；t=–14.000，P=0.000）。見圖 2。
圖1
掃描電鏡觀察細胞在 Bio-gide 膠原支架上的黏附及生長情況 從左至右依次為×100、×500、×1 000 a. 空白支架；b.復合細胞培養 24 h；c. 復合細胞培養48 h；d. 復合細胞培養 72 h
Figure1.
The adhesion and growth of human chondrocytes on the Bio-gide collagen scaffold under scanning electron microscopy The magnification was ×100, ×500, and ×1 000 from left to right a. Blank control scaffold; b. Chondrocytes cultured for 24 hours; c. Chondrocytes cultured for 48 hours; d. Chondrocytes cultured for 72 hours
圖2
患者，男，24 歲，右膝股骨外側滑車軟骨損傷 a. 術前MRI示股骨滑車骨軟骨損傷；b. 術中顯露股骨滑車骨軟骨損傷區；c. 術中MACI膜與受區軟骨貼合良好；d. 術后 3 個月 MRI 示 MACI 愈合良好
Figure2.
A 24-year-old male patient with femoral trochlea cartilage injury at the right knee a. Preoperative MRI, showing femoral trochlea cartilage injury; b. Exposure of femoral trochlea cartilage injury; c. Good fitting of MACI membrane with the cartilage of recipient site; d. MRI at 3 months after operation, showing good healing of femoral trochlea cartilage injury
3 討論
軟骨修復是再生醫學領域富有挑戰性的研究課題之一[10-14]，主要原因在于軟骨無血管、神經和淋巴引流，僅靠關節腔內滑液獲取營養；另外，由于關節軟骨所處的高壓力、低氧、低營養環境，其代謝以無氧酵解為主[15-16]；同時，軟骨細胞深陷于細胞外基質中很難遷移到損傷部位，加之成熟軟骨細胞的增殖能力有限，致使關節軟骨損傷后愈合能力非常有限[17-18]。
軟骨損傷主要臨床表現為慢性疼痛、關節功能受限等。X 線片對軟骨損傷診斷意義不大，只有當軟骨損傷較大、較深時，X 線片上可出現囊性變或相應的關節面骨缺損。CT 對于較大的軟骨損傷，特別是波及軟骨下骨的軟骨損傷有明確的定位作用，同時三維重建可更好地顯示軟骨損傷的三維特征。MRI 對于軟骨損傷診斷意義重大，其對軟骨損傷的靈敏度和特異度均較好，是影像學診斷軟骨損傷的首選方法。MRI 不僅有診斷軟骨損傷的特定序列可以明確診斷及定位，更重要的是 MRI 分級可對手術方案制定有指導作用，是軟骨移植手術術前必須的輔助檢查。
軟骨損傷常用治療方法包括摩擦成形術、微骨折術、自體骨軟骨移植、軟骨細胞移植等，但目前尚缺乏非常成功且廣泛使用的方法，特別是對于損傷面積較大的軟骨缺損[19]。組織工程和再生醫學為軟骨缺損的治療提供了一種補充選擇。組織工程采用細胞和生物材料修復損傷組織[20]，用有功能的生物組織替代可再生、損壞或有缺陷的組織[21-22]，這種修復方法對軟骨的修復極具發展潛力[23]。應用該策略時，不僅需要決定細胞的數量、應用合適的生物材料，還要考慮是否用促進生長或分化的細胞因子或其他刺激因素。組織工程軟骨是用來自于人非負重區的自體軟骨細胞，在體外培養、擴增并種植在支架上，再植入軟骨缺損區，從而實現軟骨修復和重建的治療方法[21,24]。MACI取患者關節非負重區域軟骨組織，在體外分離出軟骨細胞，培養、擴增后種植在 Ⅰ/Ⅲ 型膠原膜上，移植時根據軟骨缺損區的形態修剪成相應形狀，利用生物蛋白膠將其膠原膜黏貼在軟骨缺損區[25]。自體軟骨細胞移植（autologous chondrocyte implantation，ACI）用患者自體軟骨細胞進行移植，其優點在于減少了免疫排斥和傳染疾病風險。MACI 是 ACI 領域的代表技術，在歐洲和大洋洲的許多國家得到廣泛應用[26-27]，但在我國應用相對較少。
MACI 的手術適應證：該技術主要適用于較年輕的關節軟骨損傷及剝脫性骨軟骨炎所致軟骨損傷患者；要求患者的膝關節穩定性良好，力線正常[28]。對于年齡超過 55 歲的患者，或由于類風濕性關節炎等其他系統性疾病引起的軟骨損傷則不適用，這類患者往往采用單髁置換、髕股關節置換或全膝關節置換術治療。本組患者年齡均<55 歲，其中 9 例由創傷引起，另 1 例為剝脫性骨軟骨炎。嚴格掌握適應證是手術成功的關鍵之一，也是避免移植后 MACI 膜與受區不愈合的重要手段。
MACI 的優點：① 利用 MACI 修復損傷軟骨避免了軟骨細胞外漏、流失[29]，軟骨細胞分布不均勻及軟骨膜過度生長的缺點。②在非負重區采集軟骨不會對關節功能及修復效果造成不良影響，其優勢在于不受骨軟骨缺損面積大小限制，也無供區損傷的缺點。③ 該技術操作方便，手術時間短，小切口即可完成移植；移植物使用纖維膠黏合固定，無需縫合固定，是目前較為理想的軟骨損傷治療方法。最新研究報道顯示，關節鏡下 MACI 可減少膝關節粘連、術后疼痛及手術瘢痕，加速術后康復[30]，相比傳統開放的 MACI 更具優勢。也有研究報道 MACI 治療髕股關節軟骨損傷取得了良好療效[31]，從而使 MACI 在膝關節的應用范圍不斷擴大。MACI 的不足：① 患者需經歷兩次手術，第 2 次 MACI 手術很難在關節鏡下完成，往往需要開放手術。② 開放的 MACI 術后患者康復時間較久，對患者的心理耐受提出挑戰。 MACI 術后個體化康復方案的制定，針對不同時期要采用 MRI 或關節鏡對移植物的生長狀態進行評估，如何增加修復組織中透明軟骨的比例等問題需進一步改進[29]。如何發展出能更好地形成原始軟骨和有效形成軟骨空間分布的生物材料[32-33]，如何選擇一種更理想的支架材料，軟骨細胞在體外培養過程中如何快速增殖，軟骨在支架中如何均勻分布，術后與周圍正常軟骨的融合以及 MACI 膜的耐磨性、硬度的確定等均需要進一步提升和改善，這些問題仍是 MACI 重點攻克的難題。
MACI 的手術技巧及注意事項：① 進行關節鏡下活檢時盡量避開滑車負重區，在髁間窩邊緣正常的軟骨區取材，以免損傷負重區擴大 MACI 的手術范圍。② 活檢前例行在關節鏡下對膝關節內所有結構進行探查，如合并有韌帶或半月板損傷，需予以相應處理，必要時需待合并傷愈合、功能恢復后再行 MACI。③ 行 MACI 手術時，仔細清創受區軟骨缺損區的邊緣，使其成為光整圓形或橢圓形，力求與關節面垂直，以有助于 MACI 膜的貼合。④ 徹底清理壞死的軟骨下骨及囊性變病灶中填充的肉芽組織，清理后如發現軟骨下骨缺損較大，則需考慮植骨。本組有 4 例予以髂骨取骨植骨術。植骨塊需剪成小塊，仔細壓緊植骨塊使之與軟骨下骨緣相平齊。⑤ 軟骨缺損區的測量盡可能準確，MACI 膜的剪取需與軟骨缺損區大小、形狀力求一致。⑥ 用纖維蛋白膠黏貼 MACI 膜時，需確保 MACI 膜與受區軟骨面齊平，避免高凸，否則術后易發生撞擊，從而導致 MACI 膜剝脫。
綜上述，只要診斷明確、適應證掌握恰當、具備一定手術技巧、術后康復合理及時，MACI 治療股骨滑車軟骨損傷是一種操作簡便快捷、近期療效好、創傷較小、恢復較快、安全可靠的治療方法。但本研究樣本量較小，隨訪時間較短，其長期臨床療效需進一步擴大樣本量跟蹤隨訪評價。本研究所構建的移植物結構特征由于是基質誘導人軟骨細胞移植，因此僅進行了掃描電鏡觀察形態學結果，在今后實驗中還應對構建的移植物結構特征作進一步研究，以充分闡明其形態學特征。另外，本組有 4 例進行了髂骨取骨植骨術，但臨床療效評價中未對髂骨取骨后髖關節功能進行評價，后期擴大研究中希望能增加髂骨取骨側髖關節的功能評價，以期更全面客觀地評價該手術臨床療效。移植物愈合后軟骨退變情況的跟蹤研究及干預方法將是下一步研究的主要方向。
軟骨損傷可由創傷、感染、退行性變引起[1]，約20%接受膝關節鏡手術的患者合并有軟骨損傷[2-4]。很多軟骨損傷患者由于治療不及時導致骨性關節炎[5]，最終不得不接受關節融合術或關節置換術，嚴重影響了患者生活質量并加重了經濟負擔[6-9]。組織工程軟骨移植是治療大面積軟骨缺損的較好方法，但其移植物構建過程復雜，臨床療效尚需進一步評價。為了探索并拓展組織工程軟骨移植治療大面積軟骨缺損的應用前景，我院于 2012 年 6 月—2014 年 10 月采用基質誘導自體軟骨細胞移植（matrix-induced autologous chondrocyte implantation，MACI）治療大面積股骨滑車軟骨損傷 10 例，取得了良好的早期療效。報告如下。
1 臨床資料
1.1 一般資料
本組男 6 例，女 4 例；年齡 15～48 歲，平均 33 歲。左膝 3 例，右膝 7 例。9 例有明確外傷史（包括運動損傷 7 例、交通事故傷 2 例），1 例剝脫性骨軟骨炎。患者均表現為慢性膝關節疼痛，6 例伴有膝關節反復腫脹，其中 2 例浮髕試驗（+）。患者均無明顯屈伸受限，1 例麥氏征（+），3 例前抽屜試驗及Lachman（+），2 例側方應力試驗（+）。術前常規行膝關節正側位 X 線片及 MRI 檢查，初步判斷骨軟骨損傷部位：股骨內髁 6 例，股骨外髁 3 例，股骨滑車 1 例。 術前 MRI 提示合并半月板損傷 1 例、前交叉韌帶損傷 3 例及內、外側副韌帶部分撕裂 2 例。術前病灶深度為 2～7 mm、平均 2.80 mm，病灶面積 28.26～153.86 mm2、平均 84.85 mm2；術前疼痛視覺模擬評分（VAS）為（7.00±1.05）分，膝關節 Lysholm 評分為（59.80±13.29）分，膝關節運動 Tegner 評分為（2.10±0.74）分。明確診斷至關節鏡活檢手術時間為 5 d～3 個月，平均 14 d。本研究獲醫院醫學倫理委員會批準，術前患者均簽署知情同意書。
1.2 手術方法
1.2.1 關節鏡手術 于連續硬膜外麻醉下行患膝關節鏡下活檢。常規探查膝關節，發現合并半月板損傷 1 例，予以修整成形后 1 個月行 MACI；合并前交叉韌帶損傷 3 例，予以同側半腱肌、股薄肌肌腱重建前交叉韌帶，6 個月后行 MACI；合并內、外側副韌帶部分撕裂 2 例，未行手術處理，常規長腿支具固定 4 周后再行 MACI。另 4 例未合并其他損傷者于關節鏡活檢術后 2 周行 MACI。
1.2.2 人軟骨細胞-Bio-gide 膠原支架復合物（MACI膜）制備 采集患膝股骨滑車非負重區健康關節軟骨 200～300 mg 作為種子細胞來源，進行分離、培養并制備 MACI 膜（杭州明興生物科技有限公司完成制備）。將活檢取得的軟骨組織切成 5 mm×5 mm 大小軟骨片，PBS 沖洗 2 遍，按 Klagsbrun 法獲取軟骨細胞。將獲取的軟骨細胞加入有 10 mL DMEM 培養液的 50 mL 培養瓶，置于 37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱靜置培養，48 h 后全量換液，此后每 2 天換液 1 次。當細胞密度達 70% 融合后用 2.5 g/L 胰蛋白酶消化，按 1∶2 比例傳代培養。取第 3 代細胞，用 2.5 g/L 胰蛋白酶消化后調節細胞濃度為 5×107個/mL的細胞懸液。取細胞懸液 0.2 mL 加入每個 Bio-gide 膠原支架（Geistlich公司，瑞士）制備 MACI 膜，然后將 MACI 膜置于 100 mm 培養皿中，待細胞充分吸附在材料上后，加入含 10%FBS 的 DMEM 培養基，于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱進行培養，培養液每 2 天更換 1 次。連續培養 2 周后送臨床進行 MACI 膜移植，并分別于培養 24、48、72 h 行掃描電鏡觀察人軟骨細胞在 Bio-gide 膠原支架上的黏附和生長狀態。
1.2.3 Bio-gide 膠原支架力學測試方法 用 CP-25 型沖片機（上海申銳測試設備制造有限公司）將支架裁切成A、B 兩種規格測試片：A（長5 cm，中部寬度0.4 cm），B（2 cm×3 cm，在一端距邊緣 0.4 cm 處穿 1 根縫合線）。將測試片固定在 Instron3343 型力學測試機（Instron公司，英國）夾具上，進行扯斷拉長率、拉伸強度測試：啟動預設程序，微電腦控制器根據程序自動計算并顯示測試結果，保持數據，連續測試 3 片；縫合強度測試：將測試片 B 固定于測試機夾具兩端，一端固定縫合線，另一端直接固定測試片，啟動預設程序進行縫合強度測試，保持數據，連續測試 3 片。
1.2.4 MACI 膜植入術 以右膝外側股骨滑車為例。約 2 周后 MACI 膜制備完畢，再次入院施行 MACI 膜植入手術。于連續硬膜外麻醉下患者取平臥位，患膝屈曲 90°，根據缺損位置選擇髕旁外側切口，切開皮膚、皮下、關節囊，顯露右側股骨滑車負重區病變部位，用小刮匙刮除剝脫及病變的軟骨，必要時清理囊性變或壞死的軟骨下骨，用 11 號刀片修整軟骨缺損區創面為圓形或橢圓形。如果缺損區較大，需先行植骨術填充骨缺損區，再植入 MACI 膜。在軟骨缺損區用紗布修剪做一試膜，以試膜為樣板剪出形狀、大小相應的 MACI 膜，在修整好的缺損部位涂纖維蛋白膠后，將 MACI 膜貼于軟骨缺損區并按壓 1 min。屈伸患膝，如果 MACI 膜位置不變或松動，表明細胞膜固定良好，沖洗關節腔，逐層縫合切口，加壓包扎。
1.3 術后康復
術后康復鍛煉遵循個體化、循序漸進和全身鍛煉的原則。 術后 3～4 d 開始 CPM 機訓練，起始角度 15°，在患者舒適條件下每天增加 5～10°，3 周內達到完全生理活動范圍。3～6 周除 CMP 機和股四頭肌鍛煉外，還應進行坐姿伸膝鍛煉；4～6 周使用雙拐步行；6～12 周使用單拐，進行雙側閉鏈和開鏈運動，繼續股四頭肌鍛煉和直腿抬高；12 周后丟棄拐杖，完全負重，正常步態行走，可進行爬樓、踏車、跑步機上慢跑等運動，同期繼續進行平衡鍛煉。術后每個月隨訪 1 次，術后 3～12 個月門診復查攝患膝 MRI 評估軟骨愈合情況。
1.4 統計學方法
采用 SPSS17.0 統計軟件進行分析。數據以均數 ± 標準差表示，手術前后比較采用配對t 檢驗；檢驗水準取雙側α=0.05。
2 結果
本組患者 MACI 膜均成功制備。掃描電鏡觀察示，空白支架的結構連續性良好，膠原纖維結構清晰、交錯成疏松網狀、無凝塊。軟骨細胞呈圓形，在支架上沿膠原走向呈現導向性排列；軟骨細胞在支架上黏附、生長良好，鋪滿支架，分泌大量細胞外基質；隨著培養時間延長，軟骨細胞逐漸被外基質包埋。見圖 1。力學測試示，支架扯斷拉長率為 65.27%，拉伸強度為 26.81 MPa，縫合強度為 6.49 N，提示其力學性能良好。
本組患者 MACI 膜移植手術均獲成功，手術時間 43～99 min，平均 58.5 min；住院時間 6～15 d，平均 7 d。術后切口均Ⅰ期愈合。本組 10 例均獲隨訪，隨訪時間 9～16 個月，平均 12 個月。其中 4 例因受區清創后骨缺損較大予以髂骨取骨植骨術。所有移植的 MACI 膜與受區愈合時間為 12～16 周，平均 14 周。隨訪期間無軟骨剝脫、膝關節疼痛、神經血管損傷、深靜脈血栓形成及膝關節粘連等并發癥發生。末次隨訪時VAS評分為（1.30±0.82）分，Lysholm 評分為（94.00±3.19）分，Tegner 評分為（4.90±0.86）分，與術前比較差異均有統計學意義（t=12.060，P=0.000；t=–9.200，P=0.000；t=–14.000，P=0.000）。見圖 2。
圖1
掃描電鏡觀察細胞在 Bio-gide 膠原支架上的黏附及生長情況 從左至右依次為×100、×500、×1 000 a. 空白支架；b.復合細胞培養 24 h；c. 復合細胞培養48 h；d. 復合細胞培養 72 h
Figure1.
The adhesion and growth of human chondrocytes on the Bio-gide collagen scaffold under scanning electron microscopy The magnification was ×100, ×500, and ×1 000 from left to right a. Blank control scaffold; b. Chondrocytes cultured for 24 hours; c. Chondrocytes cultured for 48 hours; d. Chondrocytes cultured for 72 hours
圖2
患者，男，24 歲，右膝股骨外側滑車軟骨損傷 a. 術前MRI示股骨滑車骨軟骨損傷；b. 術中顯露股骨滑車骨軟骨損傷區；c. 術中MACI膜與受區軟骨貼合良好；d. 術后 3 個月 MRI 示 MACI 愈合良好
Figure2.
A 24-year-old male patient with femoral trochlea cartilage injury at the right knee a. Preoperative MRI, showing femoral trochlea cartilage injury; b. Exposure of femoral trochlea cartilage injury; c. Good fitting of MACI membrane with the cartilage of recipient site; d. MRI at 3 months after operation, showing good healing of femoral trochlea cartilage injury
3 討論
軟骨修復是再生醫學領域富有挑戰性的研究課題之一[10-14]，主要原因在于軟骨無血管、神經和淋巴引流，僅靠關節腔內滑液獲取營養；另外，由于關節軟骨所處的高壓力、低氧、低營養環境，其代謝以無氧酵解為主[15-16]；同時，軟骨細胞深陷于細胞外基質中很難遷移到損傷部位，加之成熟軟骨細胞的增殖能力有限，致使關節軟骨損傷后愈合能力非常有限[17-18]。
軟骨損傷主要臨床表現為慢性疼痛、關節功能受限等。X 線片對軟骨損傷診斷意義不大，只有當軟骨損傷較大、較深時，X 線片上可出現囊性變或相應的關節面骨缺損。CT 對于較大的軟骨損傷，特別是波及軟骨下骨的軟骨損傷有明確的定位作用，同時三維重建可更好地顯示軟骨損傷的三維特征。MRI 對于軟骨損傷診斷意義重大，其對軟骨損傷的靈敏度和特異度均較好，是影像學診斷軟骨損傷的首選方法。MRI 不僅有診斷軟骨損傷的特定序列可以明確診斷及定位，更重要的是 MRI 分級可對手術方案制定有指導作用，是軟骨移植手術術前必須的輔助檢查。
軟骨損傷常用治療方法包括摩擦成形術、微骨折術、自體骨軟骨移植、軟骨細胞移植等，但目前尚缺乏非常成功且廣泛使用的方法，特別是對于損傷面積較大的軟骨缺損[19]。組織工程和再生醫學為軟骨缺損的治療提供了一種補充選擇。組織工程采用細胞和生物材料修復損傷組織[20]，用有功能的生物組織替代可再生、損壞或有缺陷的組織[21-22]，這種修復方法對軟骨的修復極具發展潛力[23]。應用該策略時，不僅需要決定細胞的數量、應用合適的生物材料，還要考慮是否用促進生長或分化的細胞因子或其他刺激因素。組織工程軟骨是用來自于人非負重區的自體軟骨細胞，在體外培養、擴增并種植在支架上，再植入軟骨缺損區，從而實現軟骨修復和重建的治療方法[21,24]。MACI取患者關節非負重區域軟骨組織，在體外分離出軟骨細胞，培養、擴增后種植在 Ⅰ/Ⅲ 型膠原膜上，移植時根據軟骨缺損區的形態修剪成相應形狀，利用生物蛋白膠將其膠原膜黏貼在軟骨缺損區[25]。自體軟骨細胞移植（autologous chondrocyte implantation，ACI）用患者自體軟骨細胞進行移植，其優點在于減少了免疫排斥和傳染疾病風險。MACI 是 ACI 領域的代表技術，在歐洲和大洋洲的許多國家得到廣泛應用[26-27]，但在我國應用相對較少。
MACI 的手術適應證：該技術主要適用于較年輕的關節軟骨損傷及剝脫性骨軟骨炎所致軟骨損傷患者；要求患者的膝關節穩定性良好，力線正常[28]。對于年齡超過 55 歲的患者，或由于類風濕性關節炎等其他系統性疾病引起的軟骨損傷則不適用，這類患者往往采用單髁置換、髕股關節置換或全膝關節置換術治療。本組患者年齡均<55 歲，其中 9 例由創傷引起，另 1 例為剝脫性骨軟骨炎。嚴格掌握適應證是手術成功的關鍵之一，也是避免移植后 MACI 膜與受區不愈合的重要手段。
MACI 的優點：① 利用 MACI 修復損傷軟骨避免了軟骨細胞外漏、流失[29]，軟骨細胞分布不均勻及軟骨膜過度生長的缺點。②在非負重區采集軟骨不會對關節功能及修復效果造成不良影響，其優勢在于不受骨軟骨缺損面積大小限制，也無供區損傷的缺點。③ 該技術操作方便，手術時間短，小切口即可完成移植；移植物使用纖維膠黏合固定，無需縫合固定，是目前較為理想的軟骨損傷治療方法。最新研究報道顯示，關節鏡下 MACI 可減少膝關節粘連、術后疼痛及手術瘢痕，加速術后康復[30]，相比傳統開放的 MACI 更具優勢。也有研究報道 MACI 治療髕股關節軟骨損傷取得了良好療效[31]，從而使 MACI 在膝關節的應用范圍不斷擴大。MACI 的不足：① 患者需經歷兩次手術，第 2 次 MACI 手術很難在關節鏡下完成，往往需要開放手術。② 開放的 MACI 術后患者康復時間較久，對患者的心理耐受提出挑戰。 MACI 術后個體化康復方案的制定，針對不同時期要采用 MRI 或關節鏡對移植物的生長狀態進行評估，如何增加修復組織中透明軟骨的比例等問題需進一步改進[29]。如何發展出能更好地形成原始軟骨和有效形成軟骨空間分布的生物材料[32-33]，如何選擇一種更理想的支架材料，軟骨細胞在體外培養過程中如何快速增殖，軟骨在支架中如何均勻分布，術后與周圍正常軟骨的融合以及 MACI 膜的耐磨性、硬度的確定等均需要進一步提升和改善，這些問題仍是 MACI 重點攻克的難題。
MACI 的手術技巧及注意事項：① 進行關節鏡下活檢時盡量避開滑車負重區，在髁間窩邊緣正常的軟骨區取材，以免損傷負重區擴大 MACI 的手術范圍。② 活檢前例行在關節鏡下對膝關節內所有結構進行探查，如合并有韌帶或半月板損傷，需予以相應處理，必要時需待合并傷愈合、功能恢復后再行 MACI。③ 行 MACI 手術時，仔細清創受區軟骨缺損區的邊緣，使其成為光整圓形或橢圓形，力求與關節面垂直，以有助于 MACI 膜的貼合。④ 徹底清理壞死的軟骨下骨及囊性變病灶中填充的肉芽組織，清理后如發現軟骨下骨缺損較大，則需考慮植骨。本組有 4 例予以髂骨取骨植骨術。植骨塊需剪成小塊，仔細壓緊植骨塊使之與軟骨下骨緣相平齊。⑤ 軟骨缺損區的測量盡可能準確，MACI 膜的剪取需與軟骨缺損區大小、形狀力求一致。⑥ 用纖維蛋白膠黏貼 MACI 膜時，需確保 MACI 膜與受區軟骨面齊平，避免高凸，否則術后易發生撞擊，從而導致 MACI 膜剝脫。
綜上述，只要診斷明確、適應證掌握恰當、具備一定手術技巧、術后康復合理及時，MACI 治療股骨滑車軟骨損傷是一種操作簡便快捷、近期療效好、創傷較小、恢復較快、安全可靠的治療方法。但本研究樣本量較小，隨訪時間較短，其長期臨床療效需進一步擴大樣本量跟蹤隨訪評價。本研究所構建的移植物結構特征由于是基質誘導人軟骨細胞移植，因此僅進行了掃描電鏡觀察形態學結果，在今后實驗中還應對構建的移植物結構特征作進一步研究，以充分闡明其形態學特征。另外，本組有 4 例進行了髂骨取骨植骨術，但臨床療效評價中未對髂骨取骨后髖關節功能進行評價，后期擴大研究中希望能增加髂骨取骨側髖關節的功能評價，以期更全面客觀地評價該手術臨床療效。移植物愈合后軟骨退變情況的跟蹤研究及干預方法將是下一步研究的主要方向。
