引用本文： 侯孝忠, 徐林飛, 沈皆亮, 胡偵明. 血紅素氧合酶 1 對 TNF-α 誘導的人退變椎間盤髓核細胞凋亡的作用研究. 中國修復重建外科雜志, 2018, 32(1): 69-74. doi: 10.7507/1002-1892.201709043 復制
研究發現，椎間盤退變常導致脊柱結構失穩，進而導致腰背部疼痛[1-3]。因此延緩椎間盤退變可能會成為減輕患者腰背部疼痛的一種治療方式。而氧化應激和髓核細胞過度凋亡是導致椎間盤退變的重要潛在因素，因此通過抑制椎間盤細胞的過度凋亡可能減緩椎間盤退變[4-7]。目前，關于氧化應激和細胞凋亡的基礎研究主要集中在血紅素氧合酶 1（heme oxygenase 1，HO-1）。HO-1 是血紅素代謝的起始限速酶，正常情況下其表達水平較低，當受到重金屬、熱休克和內毒素等因素刺激后，表達水平會顯著增加。HO-1 具有抗氧化、抗炎和抗凋亡的作用，也與椎間盤退變密切相關[8-9]。本實驗使用 TNF-α 誘導建立人椎間盤退變髓核細胞凋亡模型，通過將 HO-1 誘導劑鈷原卟啉（CoPP）和抑制劑鋅原卟啉（ZnPP）分別作用于該細胞模型，觀察細胞凋亡變化情況，為進一步研究 HO-1 對椎間盤髓核細胞凋亡的作用及其機制提供思路。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
Ⅱ 型膠原酶、FBS、ZnPP、CoPP（Sigma 公司，美國）；DMEM/F12 細胞培養液（HyClone 公司，美國）； Hoechst 染色試劑盒（南京凱基生物技術有限公司）；TNF-α（R&D 公司，美國）；細胞計數試劑盒 8（cell counting kit 8，CCK-8；江蘇碧云天生物技術有限公司）；兔抗人活化型 Caspase-3（cleaved Caspase-3）單克隆抗體、兔抗人上皮膜蛋白 1（epithelial membrane protein 1，EMP-1）單克隆抗體、兔抗人 HO-1 單克隆抗體、兔抗人 p-P65 單克隆抗體（CST 公司，美國）；鼠抗人 β-actin 抗體（南京鐘鼎生物技術有限公司）；羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗（武漢博士德生物工程有限公司）；吡咯烷二硫基甲酸 （pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC；Selleck 公司，美國）。倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡（Nikon 公司，日本）；流式細胞儀（B&D Biosciences 公司，美國）。
1.2 椎間盤髓核細胞分離及培養
人退變椎間盤組織均由重慶醫科大學附屬第一醫院手術治療的 8 例腰椎間盤突出癥患者自愿捐贈，患者年齡 46～75 歲，椎間盤退變根據椎間盤影像學改良 Pfirrmann 分級標準[10]均為 Ⅲ～Ⅴ 級。標本獲取通過重慶醫科大學附屬第一醫院倫理委員會批準。
將術中摘取的髓核組織置于無菌培養皿中，放入冰盒中帶回實驗室。在超凈工作臺中用無菌 PBS 液反復清洗髓核組織，眼科剪剪碎后置于 0.25% 胰蛋白酶中處理 30 min，以離心半徑 13.5 cm、1 000 r/min 離心 5 min；棄胰蛋白酶液，置于 0.2%Ⅱ 型膠原酶中處理 4 h，用 200 目濾網過濾，以離心半徑 13.5 cm、1 000 r/min 離心 5 min；取細胞沉淀，加入含 20%FBS 的 DMEM/F12 培養液，于 37℃、5%CO2孵箱中培養。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態，待細胞融合至 70%～80% 時進行傳代，取第 3 代髓核細胞進行后續實驗。
1.3 TNF-α 最佳刺激濃度篩選
取髓核細胞以 0.25% 胰蛋白酶消化中和后，以離心半徑 13.5 cm、1 000 r/min 離心 5 min，取細胞沉淀，加入 1 mL 含 20%FBS 的 DMEM/F12 培養液，吹打均勻后制成細胞懸液，計數后調整細胞濃度為 1×104 個/mL，接種于 96 孔板，每孔 100 μL。于 37℃、5%CO2 培養箱培養 24 h 待細胞貼壁后分別給予不同濃度（10、20、50、100、200 ng/mL）TNF-α 溶液刺激細胞，各組 3 個復孔；以等體積培養基培養髓核細胞作為陰性對照組，僅有培養基無細胞作為空白對照組。培養 24 h 后采用 CCK-8 法檢測細胞活性，每孔加入 CCK-8，2 h 后測定吸光度（A）值。根據檢測結果選擇對細胞增殖活性抑制最顯著的濃度，作為 TNF-α 最佳刺激濃度進行后續實驗。
1.4 HO-1 對椎間盤髓核細胞凋亡的影響
1.4.1 實驗分組
實驗分為 4 組，分別為基礎培養液組（對照組）、TNF-α 刺激組（TNF-α 組）、TNF-α 和 CoPP 10 μmol/L 刺激組（CoPP 組）、TNF-α 和 ZnPP 15 μmol/L 刺激組（ZnPP 組）。
1.4.2 Hoechst 染色觀察髓核細胞凋亡
取髓核細胞同上法消化離心后制成細胞懸液，按 6×104 個/孔細胞接種于 24 孔板，待細胞融合至 70%～80% 后，按照分組分別給予不同試劑培養。培養 24 h 后，避光條件下棄培養液，加入 Hoechst 33258，置于 37℃ 孵箱中 10 min，清洗后封片，熒光顯微鏡下觀察，細胞核呈亮藍色為凋亡細胞。
1.4.3 流式細胞術檢測髓核細胞凋亡
取髓核細胞同上法消化離心后制成細胞懸液，按 1×105個/孔接種于 6 孔板，待細胞融合至 70%～80% 后，按照分組分別給予不同試劑培養。培養 24 h 后，收集培養液至 10 mL 離心管，無菌 PBS 液反復洗滌培養孔后，用不含 EDTA 的胰蛋白酶消化髓核細胞，與收集的培養液一并以離心半徑 13.5 cm、1 000 r/min 離心 5 min，收集細胞沉淀，PBS 液清洗，流式細胞儀檢測髓核細胞凋亡率。
1.4.4 Western blot 檢測髓核細胞凋亡相關蛋白及 HO-1 的表達
取髓核細胞同上法消化離心后制成細胞懸液，按 2.5×105個/瓶接種于培養瓶中，按照分組方法分別給予不同試劑培養。培養 24 h 后，棄培養液，用預冷 PBS 液反復洗滌，加入細胞裂解液，置于冰上裂解 30 min，細胞刮收集碎裂細胞及蛋白，以離心半徑 13.5 cm、12 000 r/min 離心 15 min，收集細胞總蛋白，用 BCA 法測定其蛋白濃度。按照 5∶1 比例加入上樣緩沖液，煮沸 10 min 變性。各組平衡蛋白量上樣后，在 12%SDS-PAGE 電泳上進行蛋白分離，再電轉至 0.45 μm 聚偏氟乙烯膜上。常溫下用 50 g/L 脫脂牛奶對膜封閉 2 h，用 TBST 洗滌 3 次。以 β-actin 作為內參，分別加入下述相應單克隆抗體（1∶1 000），兔抗人 cleaved Caspase-3、EMP-1、HO-1、p-P65 抗體和鼠抗人 β-actin 抗體，4℃ 過夜孵育。加入 1∶5 000 稀釋的二抗室溫下孵育 2 h，暗室顯影，發光，應用凝膠圖像分析軟件分析各目標條帶灰度值，計算目的蛋白與 β-actin 的比值作為其相對表達量。
1.5 HO-1 影響髓核細胞凋亡的分子機制
實驗分為 2 組，分別為 TNF-α 刺激組以及 TNF-α 100 ng/mL 和 PDTC 5 μmol/L 刺激組（TNF-α+PDTC 刺激組）。取髓核細胞同上法消化離心后制成細胞懸液，按 1×105 個/孔接種于 6 孔板，待細胞融合至 70%～80% 后，按照分組分別給予不同試劑培養 24 h 后，同 1.4.3 方法采用流式細胞儀檢測髓核細胞凋亡率。
1.6 統計學方法
采用 SPSS18.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 髓核細胞形態學觀察
倒置相差顯微鏡下觀察示，原代髓核細胞為圓形小光點漂浮在培養液中；培養 5 d 后髓核細胞開始貼壁，細胞形態較小，呈短梭形或多角形；10 d 后細胞質開始向外伸展，細胞變成長梭形；培養 2 周左右細胞融合率約為 80%，呈不規則梭形或火焰狀細胞團聚集。見圖 1。傳代后細胞形態呈不規則梭形，但無火焰狀團聚現象。
圖1
原代髓核細胞形態學觀察（×200）
a. 培養 5 d；b. 培養 15 d
Figure1. Morphological observation of primary degenerated NP cells (×200)a. After cultured for 5 days; b. After cultured for 15 days
2.2 TNF-α 最佳刺激濃度篩選
各濃度 TNF-α 培養 24 h 后，髓核細胞增殖活性均被抑制，CCK-8 法檢測陰性對照組、10、20、50、100 和 200 ng/mL 組 A 值分別為 94.43%±4.35%、94.47%±1.98%、83.00%±4.11%、75.33%±4.73%、52.73%±2.55%、47.67%±4.23%，其中僅 100、200 ng/mL 組與陰性對照組比較差異有統計學意義（P<0.05），且 100、200 ng/mL 組間比較差異無統計學意義（P>0.05），故確定 TNF-α 最佳抑制濃度為 100 ng/mL 進行后續實驗。
2.3 HO-1 對椎間盤髓核細胞凋亡的影響
2.3.1 Hoechst 染色觀察髓核細胞凋亡
熒光顯微鏡下觀察示，對照組和 CoPP 組細胞核呈較均勻的藍色熒光，凋亡細胞較少；而 TNF-α 組和 ZnPP 組可見凋亡樣改變細胞核，表現為亮藍色，出現核碎裂，熒光強度較對照組明顯增強，同時 ZnPP 組出現凋亡像的細胞多于 TNF-α 組。見圖 2。
圖2
Hoechst 染色觀察各組髓核細胞凋亡（熒光顯微鏡×200）
a. 對照組；b. TNF-α 組；c. CoPP 組；d. ZnPP 組
Figure2. Hoechst staining observation of cell apoptosis in each group (Fluorescence microscope×200)a. Control group; b. TNF-α group; c. CoPP group; d. ZnPP group
2.3.2 流式細胞術檢測髓核細胞凋亡
對照組、TNF-α 組、CoPP 組、ZnPP 組細胞凋亡率分別為 7.38%±0.78%、19.08%±0.98%、13.53%±1.19%、29.29%±0.90%。與對照組相比，TNF-α 組、CoPP 組及 ZnPP 組細胞凋亡率均顯著提高（P<0.05）；與 TNF-α 組相比，CoPP 組細胞凋亡率顯著降低（P<0.05），ZnPP 組細胞凋亡率顯著提高（P<0.05）。見圖 3。
圖3
流式細胞儀檢測各組細胞凋亡
a. 對照組；b. TNF-α 組；c. CoPP 組；d. ZnPP 組
Figure3. Cell apoptosis detection in each group by flow cytometry a. Control group; b. TNF-α group; c. CoPP group; d. ZnPP group2.3.3 Western blot 檢測髓核細胞凋亡相關蛋白及HO-1的表達
與對照組相比，TNF-α 組 HO-1 蛋白表達降低，凋亡蛋白 cleaved Caspase-3 及 EMP-1 表達升高（P<0.05）。與 TNF-α 組相比，CoPP 組 HO-1 蛋白表達明顯升高，凋亡蛋白 cleaved Caspase-3 及 EMP-1 表達明顯降低（P<0.05）；而 ZnPP 組 HO-1 蛋白表達明顯降低，凋亡蛋白 cleaved Caspase-3 及 EMP-1 表達明顯升高（P<0.05）。見圖 4。
圖4
Western blot 檢測髓核細胞凋亡相關蛋白及 HO-1 的表達
a. 蛋白條帶圖 1：對照組 2：TNF-α 組 3：CoPP 組 4：ZnPP 組；b. 各蛋白相對表達量
Figure4. Expressions of cleaved Caspase-3, EMP-1, and HO-1 proteins by Western blota. Protein stripe diagram 1: Control group 2: TNF-α group 3: CoPP group 4: ZnPP group; b. Relative expressions of proteins
同時，與對照組相比，TNF-α 組 p-P65 蛋白表達升高（P<0.05）。與 TNF-α 組相比，CoPP 組 p-P65 蛋白表達明顯降低（P<0.05）；而 ZnPP 組 p-P65 蛋白表達無明顯變化，比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 5。
圖5
Western blot 檢測髓核細胞 p-P65 蛋白表達
a. 蛋白條帶圖 1：對照組 2：TNF-α 組 3：CoPP 組 4：ZnPP 組；b. p-P65 蛋白相對表達量
Figure5. Expression of p-P65 protein by Western blota. Protein stripe diagram 1: Control group 2: TNF-α group 3: CoPP group 4: ZnPP group; b. Relative expression of p-P65 protein
2.4 應用 PDTC 對髓核細胞凋亡率的影響
TNF-α 刺激組細胞凋亡率為 20.33%±1.24%，TNF-α+PDTC 刺激組為 11.51%±0.72%，較 TNF-α 刺激組明顯降低，比較差異有統計學意義（t=3.076，P=0.031）。見圖 6。
圖6
流式細胞儀檢測 PDTC 對髓核細胞凋亡的影響
a. TNF-α 刺激組；b. TNF-α+PDTC 刺激組
Figure6. Cells apoptosis rate after PDTC treatment by flow cytometrya. TNF-α stimulated group; b. TNF-α+PDTC stimulated group
3 討論
TNF-α 是人體中主要的促炎性因子，不僅能促使髓核細胞發生凋亡，而且還能抑制髓核細胞外基質的表達，在椎間盤退變病理過程中發揮重要作用，因此本實驗使用 TNF-α 刺激髓核細胞建立椎間盤髓核細胞凋亡模型。CCK-8 法檢測結果顯示，TNF-α 濃度為 100、200 ng/mL 時，髓核細胞活性受到明顯抑制，但是 100、200 ng/mL 濃度對髓核細胞活性抑制效果無明顯差異，因此選擇 TNF-α 最佳抑制濃度為 100 ng/mL 進行后續實驗。
HO-1 是生物體內催化血紅素分解的關鍵酶，在抗炎、抗氧化及抗凋亡等方面具有重要作用，在高血壓、糖尿病及腎炎等疾病的發生發展中起一定防護作用[11-12]。Hu 等[9]研究表明，HO-1 能夠減緩由 IL-1β 誘導的人椎間盤髓核細胞退變，表明 HO-1 與椎間盤退變有一定關系。但是 HO-1 減緩椎間盤退變的具體機制以及是否與髓核細胞的凋亡相關尚需明確。谷穎等[13]發現通過促進 HO-1 表達，能在一定程度上抑制大鼠心肌細胞凋亡；隨著椎間盤退變程度增加，髓核組織的 HO-1 表達水平反而降低[9]，髓核組織凋亡蛋白的表達水平也隨之增加[14]。因此，我們認為 HO-1 在椎間盤細胞凋亡中發揮一定作用。
EMP-1 最初是在腦部腫瘤中發現，被稱為腦腫瘤相關性膜蛋白[15]。研究表明在 EMP-1 高表達的椎間盤中，椎間盤細胞凋亡水平增高，從而導致椎間盤退變[16-17]。本研究采用 CoPP 作為 HO-1 誘導劑，以提高 HO-1 蛋白表達水平。檢測結果顯示，與 TNF-α 組比較，CoPP 組髓核細胞凋亡率以及凋亡相關蛋白 cleaved Caspase-3、EMP-1 的表達水平降低；而 ZnPP 作為 HO-1 抑制劑使 HO-1 表達降低，但是與 TNF-α 組比較，ZnPP 組髓核細胞凋亡率以及凋亡相關蛋白 cleaved Caspase-3、EMP-1 的表達水平提高。表明 HO-1 能夠抑制 TNF-α 誘導的髓核細胞凋亡，從而可減緩椎間盤的退變。
NF-κB 是一種重要的核轉錄因子，其對細胞損傷、應激、凋亡和炎性反應的調控發揮著重要作用[18-19]。已有證據表明 NF-κB 通路與椎間盤退變過程密切相關[20]，同時 HO-1 可能通過 NF-κB 通路抑制腸毒素刺激的腸上皮細胞的凋亡[21]。但是缺少髓核細胞中 HO-1 與 NF-κB 通路關系的相關研究報道。我們檢測發現 TNF-α 組細胞內 p-P65 蛋白表達較對照組升高，而 CoPP 組與 TNF-α 組相比明顯下降。同時進一步給予 NF-кB 抑制劑 PDTC 處理髓核細胞后，發現細胞凋亡率顯著下降。因此，HO-1 抑制 TNF-α 誘導的髓核細胞凋亡，其機制可能是通過調控 NF-кB 通路得以實現。
綜上述，HO-1 對椎間盤髓核細胞有一定保護作用，能夠抑制 TNF-α 誘導的椎間盤髓核細胞凋亡水平，其主要機制可能是對 NF-кB 通路的調控，為防治椎間盤細胞的凋亡提供了新思路。但是本研究也存在不足之處：實驗中缺乏單純 HO-1 誘導劑和抑制劑對照組，對 NF-κB 通路的研究不夠深入，以及 HO-1 是如何調控 NF-κB 的上下信號通路方面也需要進一步研究。
研究發現，椎間盤退變常導致脊柱結構失穩，進而導致腰背部疼痛[1-3]。因此延緩椎間盤退變可能會成為減輕患者腰背部疼痛的一種治療方式。而氧化應激和髓核細胞過度凋亡是導致椎間盤退變的重要潛在因素，因此通過抑制椎間盤細胞的過度凋亡可能減緩椎間盤退變[4-7]。目前，關于氧化應激和細胞凋亡的基礎研究主要集中在血紅素氧合酶 1（heme oxygenase 1，HO-1）。HO-1 是血紅素代謝的起始限速酶，正常情況下其表達水平較低，當受到重金屬、熱休克和內毒素等因素刺激后，表達水平會顯著增加。HO-1 具有抗氧化、抗炎和抗凋亡的作用，也與椎間盤退變密切相關[8-9]。本實驗使用 TNF-α 誘導建立人椎間盤退變髓核細胞凋亡模型，通過將 HO-1 誘導劑鈷原卟啉（CoPP）和抑制劑鋅原卟啉（ZnPP）分別作用于該細胞模型，觀察細胞凋亡變化情況，為進一步研究 HO-1 對椎間盤髓核細胞凋亡的作用及其機制提供思路。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
Ⅱ 型膠原酶、FBS、ZnPP、CoPP（Sigma 公司，美國）；DMEM/F12 細胞培養液（HyClone 公司，美國）； Hoechst 染色試劑盒（南京凱基生物技術有限公司）；TNF-α（R&D 公司，美國）；細胞計數試劑盒 8（cell counting kit 8，CCK-8；江蘇碧云天生物技術有限公司）；兔抗人活化型 Caspase-3（cleaved Caspase-3）單克隆抗體、兔抗人上皮膜蛋白 1（epithelial membrane protein 1，EMP-1）單克隆抗體、兔抗人 HO-1 單克隆抗體、兔抗人 p-P65 單克隆抗體（CST 公司，美國）；鼠抗人 β-actin 抗體（南京鐘鼎生物技術有限公司）；羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗（武漢博士德生物工程有限公司）；吡咯烷二硫基甲酸 （pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC；Selleck 公司，美國）。倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡（Nikon 公司，日本）；流式細胞儀（B&D Biosciences 公司，美國）。
1.2 椎間盤髓核細胞分離及培養
人退變椎間盤組織均由重慶醫科大學附屬第一醫院手術治療的 8 例腰椎間盤突出癥患者自愿捐贈，患者年齡 46～75 歲，椎間盤退變根據椎間盤影像學改良 Pfirrmann 分級標準[10]均為 Ⅲ～Ⅴ 級。標本獲取通過重慶醫科大學附屬第一醫院倫理委員會批準。
將術中摘取的髓核組織置于無菌培養皿中，放入冰盒中帶回實驗室。在超凈工作臺中用無菌 PBS 液反復清洗髓核組織，眼科剪剪碎后置于 0.25% 胰蛋白酶中處理 30 min，以離心半徑 13.5 cm、1 000 r/min 離心 5 min；棄胰蛋白酶液，置于 0.2%Ⅱ 型膠原酶中處理 4 h，用 200 目濾網過濾，以離心半徑 13.5 cm、1 000 r/min 離心 5 min；取細胞沉淀，加入含 20%FBS 的 DMEM/F12 培養液，于 37℃、5%CO2孵箱中培養。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態，待細胞融合至 70%～80% 時進行傳代，取第 3 代髓核細胞進行后續實驗。
1.3 TNF-α 最佳刺激濃度篩選
取髓核細胞以 0.25% 胰蛋白酶消化中和后，以離心半徑 13.5 cm、1 000 r/min 離心 5 min，取細胞沉淀，加入 1 mL 含 20%FBS 的 DMEM/F12 培養液，吹打均勻后制成細胞懸液，計數后調整細胞濃度為 1×104 個/mL，接種于 96 孔板，每孔 100 μL。于 37℃、5%CO2 培養箱培養 24 h 待細胞貼壁后分別給予不同濃度（10、20、50、100、200 ng/mL）TNF-α 溶液刺激細胞，各組 3 個復孔；以等體積培養基培養髓核細胞作為陰性對照組，僅有培養基無細胞作為空白對照組。培養 24 h 后采用 CCK-8 法檢測細胞活性，每孔加入 CCK-8，2 h 后測定吸光度（A）值。根據檢測結果選擇對細胞增殖活性抑制最顯著的濃度，作為 TNF-α 最佳刺激濃度進行后續實驗。
1.4 HO-1 對椎間盤髓核細胞凋亡的影響
1.4.1 實驗分組
實驗分為 4 組，分別為基礎培養液組（對照組）、TNF-α 刺激組（TNF-α 組）、TNF-α 和 CoPP 10 μmol/L 刺激組（CoPP 組）、TNF-α 和 ZnPP 15 μmol/L 刺激組（ZnPP 組）。
1.4.2 Hoechst 染色觀察髓核細胞凋亡
取髓核細胞同上法消化離心后制成細胞懸液，按 6×104 個/孔細胞接種于 24 孔板，待細胞融合至 70%～80% 后，按照分組分別給予不同試劑培養。培養 24 h 后，避光條件下棄培養液，加入 Hoechst 33258，置于 37℃ 孵箱中 10 min，清洗后封片，熒光顯微鏡下觀察，細胞核呈亮藍色為凋亡細胞。
1.4.3 流式細胞術檢測髓核細胞凋亡
取髓核細胞同上法消化離心后制成細胞懸液，按 1×105個/孔接種于 6 孔板，待細胞融合至 70%～80% 后，按照分組分別給予不同試劑培養。培養 24 h 后，收集培養液至 10 mL 離心管，無菌 PBS 液反復洗滌培養孔后，用不含 EDTA 的胰蛋白酶消化髓核細胞，與收集的培養液一并以離心半徑 13.5 cm、1 000 r/min 離心 5 min，收集細胞沉淀，PBS 液清洗，流式細胞儀檢測髓核細胞凋亡率。
1.4.4 Western blot 檢測髓核細胞凋亡相關蛋白及 HO-1 的表達
取髓核細胞同上法消化離心后制成細胞懸液，按 2.5×105個/瓶接種于培養瓶中，按照分組方法分別給予不同試劑培養。培養 24 h 后，棄培養液，用預冷 PBS 液反復洗滌，加入細胞裂解液，置于冰上裂解 30 min，細胞刮收集碎裂細胞及蛋白，以離心半徑 13.5 cm、12 000 r/min 離心 15 min，收集細胞總蛋白，用 BCA 法測定其蛋白濃度。按照 5∶1 比例加入上樣緩沖液，煮沸 10 min 變性。各組平衡蛋白量上樣后，在 12%SDS-PAGE 電泳上進行蛋白分離，再電轉至 0.45 μm 聚偏氟乙烯膜上。常溫下用 50 g/L 脫脂牛奶對膜封閉 2 h，用 TBST 洗滌 3 次。以 β-actin 作為內參，分別加入下述相應單克隆抗體（1∶1 000），兔抗人 cleaved Caspase-3、EMP-1、HO-1、p-P65 抗體和鼠抗人 β-actin 抗體，4℃ 過夜孵育。加入 1∶5 000 稀釋的二抗室溫下孵育 2 h，暗室顯影，發光，應用凝膠圖像分析軟件分析各目標條帶灰度值，計算目的蛋白與 β-actin 的比值作為其相對表達量。
1.5 HO-1 影響髓核細胞凋亡的分子機制
實驗分為 2 組，分別為 TNF-α 刺激組以及 TNF-α 100 ng/mL 和 PDTC 5 μmol/L 刺激組（TNF-α+PDTC 刺激組）。取髓核細胞同上法消化離心后制成細胞懸液，按 1×105 個/孔接種于 6 孔板，待細胞融合至 70%～80% 后，按照分組分別給予不同試劑培養 24 h 后，同 1.4.3 方法采用流式細胞儀檢測髓核細胞凋亡率。
1.6 統計學方法
采用 SPSS18.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 髓核細胞形態學觀察
倒置相差顯微鏡下觀察示，原代髓核細胞為圓形小光點漂浮在培養液中；培養 5 d 后髓核細胞開始貼壁，細胞形態較小，呈短梭形或多角形；10 d 后細胞質開始向外伸展，細胞變成長梭形；培養 2 周左右細胞融合率約為 80%，呈不規則梭形或火焰狀細胞團聚集。見圖 1。傳代后細胞形態呈不規則梭形，但無火焰狀團聚現象。
圖1
原代髓核細胞形態學觀察（×200）
a. 培養 5 d；b. 培養 15 d
Figure1. Morphological observation of primary degenerated NP cells (×200)a. After cultured for 5 days; b. After cultured for 15 days
2.2 TNF-α 最佳刺激濃度篩選
各濃度 TNF-α 培養 24 h 后，髓核細胞增殖活性均被抑制，CCK-8 法檢測陰性對照組、10、20、50、100 和 200 ng/mL 組 A 值分別為 94.43%±4.35%、94.47%±1.98%、83.00%±4.11%、75.33%±4.73%、52.73%±2.55%、47.67%±4.23%，其中僅 100、200 ng/mL 組與陰性對照組比較差異有統計學意義（P<0.05），且 100、200 ng/mL 組間比較差異無統計學意義（P>0.05），故確定 TNF-α 最佳抑制濃度為 100 ng/mL 進行后續實驗。
2.3 HO-1 對椎間盤髓核細胞凋亡的影響
2.3.1 Hoechst 染色觀察髓核細胞凋亡
熒光顯微鏡下觀察示，對照組和 CoPP 組細胞核呈較均勻的藍色熒光，凋亡細胞較少；而 TNF-α 組和 ZnPP 組可見凋亡樣改變細胞核，表現為亮藍色，出現核碎裂，熒光強度較對照組明顯增強，同時 ZnPP 組出現凋亡像的細胞多于 TNF-α 組。見圖 2。
圖2
Hoechst 染色觀察各組髓核細胞凋亡（熒光顯微鏡×200）
a. 對照組；b. TNF-α 組；c. CoPP 組；d. ZnPP 組
Figure2. Hoechst staining observation of cell apoptosis in each group (Fluorescence microscope×200)a. Control group; b. TNF-α group; c. CoPP group; d. ZnPP group
2.3.2 流式細胞術檢測髓核細胞凋亡
對照組、TNF-α 組、CoPP 組、ZnPP 組細胞凋亡率分別為 7.38%±0.78%、19.08%±0.98%、13.53%±1.19%、29.29%±0.90%。與對照組相比，TNF-α 組、CoPP 組及 ZnPP 組細胞凋亡率均顯著提高（P<0.05）；與 TNF-α 組相比，CoPP 組細胞凋亡率顯著降低（P<0.05），ZnPP 組細胞凋亡率顯著提高（P<0.05）。見圖 3。
圖3
流式細胞儀檢測各組細胞凋亡
a. 對照組；b. TNF-α 組；c. CoPP 組；d. ZnPP 組
Figure3. Cell apoptosis detection in each group by flow cytometry a. Control group; b. TNF-α group; c. CoPP group; d. ZnPP group2.3.3 Western blot 檢測髓核細胞凋亡相關蛋白及HO-1的表達
與對照組相比，TNF-α 組 HO-1 蛋白表達降低，凋亡蛋白 cleaved Caspase-3 及 EMP-1 表達升高（P<0.05）。與 TNF-α 組相比，CoPP 組 HO-1 蛋白表達明顯升高，凋亡蛋白 cleaved Caspase-3 及 EMP-1 表達明顯降低（P<0.05）；而 ZnPP 組 HO-1 蛋白表達明顯降低，凋亡蛋白 cleaved Caspase-3 及 EMP-1 表達明顯升高（P<0.05）。見圖 4。
圖4
Western blot 檢測髓核細胞凋亡相關蛋白及 HO-1 的表達
a. 蛋白條帶圖 1：對照組 2：TNF-α 組 3：CoPP 組 4：ZnPP 組；b. 各蛋白相對表達量
Figure4. Expressions of cleaved Caspase-3, EMP-1, and HO-1 proteins by Western blota. Protein stripe diagram 1: Control group 2: TNF-α group 3: CoPP group 4: ZnPP group; b. Relative expressions of proteins
同時，與對照組相比，TNF-α 組 p-P65 蛋白表達升高（P<0.05）。與 TNF-α 組相比，CoPP 組 p-P65 蛋白表達明顯降低（P<0.05）；而 ZnPP 組 p-P65 蛋白表達無明顯變化，比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 5。
圖5
Western blot 檢測髓核細胞 p-P65 蛋白表達
a. 蛋白條帶圖 1：對照組 2：TNF-α 組 3：CoPP 組 4：ZnPP 組；b. p-P65 蛋白相對表達量
Figure5. Expression of p-P65 protein by Western blota. Protein stripe diagram 1: Control group 2: TNF-α group 3: CoPP group 4: ZnPP group; b. Relative expression of p-P65 protein
2.4 應用 PDTC 對髓核細胞凋亡率的影響
TNF-α 刺激組細胞凋亡率為 20.33%±1.24%，TNF-α+PDTC 刺激組為 11.51%±0.72%，較 TNF-α 刺激組明顯降低，比較差異有統計學意義（t=3.076，P=0.031）。見圖 6。
圖6
流式細胞儀檢測 PDTC 對髓核細胞凋亡的影響
a. TNF-α 刺激組；b. TNF-α+PDTC 刺激組
Figure6. Cells apoptosis rate after PDTC treatment by flow cytometrya. TNF-α stimulated group; b. TNF-α+PDTC stimulated group
3 討論
TNF-α 是人體中主要的促炎性因子，不僅能促使髓核細胞發生凋亡，而且還能抑制髓核細胞外基質的表達，在椎間盤退變病理過程中發揮重要作用，因此本實驗使用 TNF-α 刺激髓核細胞建立椎間盤髓核細胞凋亡模型。CCK-8 法檢測結果顯示，TNF-α 濃度為 100、200 ng/mL 時，髓核細胞活性受到明顯抑制，但是 100、200 ng/mL 濃度對髓核細胞活性抑制效果無明顯差異，因此選擇 TNF-α 最佳抑制濃度為 100 ng/mL 進行后續實驗。
HO-1 是生物體內催化血紅素分解的關鍵酶，在抗炎、抗氧化及抗凋亡等方面具有重要作用，在高血壓、糖尿病及腎炎等疾病的發生發展中起一定防護作用[11-12]。Hu 等[9]研究表明，HO-1 能夠減緩由 IL-1β 誘導的人椎間盤髓核細胞退變，表明 HO-1 與椎間盤退變有一定關系。但是 HO-1 減緩椎間盤退變的具體機制以及是否與髓核細胞的凋亡相關尚需明確。谷穎等[13]發現通過促進 HO-1 表達，能在一定程度上抑制大鼠心肌細胞凋亡；隨著椎間盤退變程度增加，髓核組織的 HO-1 表達水平反而降低[9]，髓核組織凋亡蛋白的表達水平也隨之增加[14]。因此，我們認為 HO-1 在椎間盤細胞凋亡中發揮一定作用。
EMP-1 最初是在腦部腫瘤中發現，被稱為腦腫瘤相關性膜蛋白[15]。研究表明在 EMP-1 高表達的椎間盤中，椎間盤細胞凋亡水平增高，從而導致椎間盤退變[16-17]。本研究采用 CoPP 作為 HO-1 誘導劑，以提高 HO-1 蛋白表達水平。檢測結果顯示，與 TNF-α 組比較，CoPP 組髓核細胞凋亡率以及凋亡相關蛋白 cleaved Caspase-3、EMP-1 的表達水平降低；而 ZnPP 作為 HO-1 抑制劑使 HO-1 表達降低，但是與 TNF-α 組比較，ZnPP 組髓核細胞凋亡率以及凋亡相關蛋白 cleaved Caspase-3、EMP-1 的表達水平提高。表明 HO-1 能夠抑制 TNF-α 誘導的髓核細胞凋亡，從而可減緩椎間盤的退變。
NF-κB 是一種重要的核轉錄因子，其對細胞損傷、應激、凋亡和炎性反應的調控發揮著重要作用[18-19]。已有證據表明 NF-κB 通路與椎間盤退變過程密切相關[20]，同時 HO-1 可能通過 NF-κB 通路抑制腸毒素刺激的腸上皮細胞的凋亡[21]。但是缺少髓核細胞中 HO-1 與 NF-κB 通路關系的相關研究報道。我們檢測發現 TNF-α 組細胞內 p-P65 蛋白表達較對照組升高，而 CoPP 組與 TNF-α 組相比明顯下降。同時進一步給予 NF-кB 抑制劑 PDTC 處理髓核細胞后，發現細胞凋亡率顯著下降。因此，HO-1 抑制 TNF-α 誘導的髓核細胞凋亡，其機制可能是通過調控 NF-кB 通路得以實現。
綜上述，HO-1 對椎間盤髓核細胞有一定保護作用，能夠抑制 TNF-α 誘導的椎間盤髓核細胞凋亡水平，其主要機制可能是對 NF-кB 通路的調控，為防治椎間盤細胞的凋亡提供了新思路。但是本研究也存在不足之處：實驗中缺乏單純 HO-1 誘導劑和抑制劑對照組，對 NF-κB 通路的研究不夠深入，以及 HO-1 是如何調控 NF-κB 的上下信號通路方面也需要進一步研究。
