目的觀察探討聚嘧啶束結合蛋白相關剪接子（PSF）高表達對糖基化終末產物（AGEs）誘導下人視網微血管內皮細胞（hRMECs）氧化損傷的保護作用及相應分子機制。方法將hRMECs分為正常組、空載組、PSF組、鋅原卟啉（ZnPP）組及PSF+ ZnPP組進行實驗。正常組細胞使用含有10%胎牛血清、青霉素/鏈霉素的DMEM培養基，置于37 °C、95%空氣、5% CO2的密閉恒溫培養箱中培養。空載組細胞采用空載慢病毒感染。PSF組細胞采用過表達PSF慢病毒感染。ZnPP組細胞采用ZnPP（10 mol/L）處理2 h。PSF+ZnPP組細胞采用過表達PSF慢病毒感染后，再用ZnPP（10 mol/L）預處理2 h。后四組細胞輔以AGEs刺激，HE、Hoechst33258染色法和流式細胞法觀察PSF高表達對細胞損傷的保護作用以及ZnPP對PSF的拮抗作用。采用Western blot檢測細胞中血紅素氧合酶-1（HO-1）、磷酸化（p）細胞外調節蛋白激酶（ERK）、核因子2相關因子2（Nrf2）的蛋白表達。引入ERK通路的特異性拮抗劑U0126，Western blot驗證U0126對PSF蛋白所誘導的HO-1表達的逆轉作用。結果HE染色和Hoechst33258染色結果顯示，PSF組受損細胞核數較正常組明顯增加，較PSF+ZnPP組明顯減少，差異均有統計學意義（F=27.5、38.7，P＜0.05）。流式細胞法結果顯示，PSF組細胞產生的ROS較正常組明顯增加，較PSF+ZnPP組明顯減少，差異有統計學意義（F=126.4，P＜0.05）。Western blot檢測結果顯示，PSF組HO-1蛋白表達量較正常組、空載組明顯增加，差異均有統計學意義（F=70.1，P＜0.05）；AGEs處理30、60、120、240 min時pERK的蛋白表達量與15 min時比較，差異均有統計學意義（F=474.0，P＜0.05）；PSF+/U0126－組HO-1、Nrf2蛋白表達量較PSF－/U0126－組明顯增加，PSF+/U0126+組HO-1、Nrf2蛋白表達量較PSF+/U0126－組明顯降低，差異有統計學意義（F=30.2、489.4，P＜0.05）。結論PSF高表達可以通過活化ERK通路，促進Nrf2轉位入核進而誘導HO-1表達，從而保護hRMECs免受AGEs誘導的氧化損傷。
目的觀察聚嘧啶束結合蛋白相關剪接因子（PSF）高表達對糖基化終末產物（AGEs）誘導下RPE細胞損傷的保護作用。方法將體外培養的人RPE細胞分為正常對照組（N組）、空白對照組（N+AGAGEs組）、空載體對照組（Vec+AGEs組）、PSF高表達組（PSF+AGEs組）。N組RPE細胞常規培養；N+AGEs組只做轉染處理但不導入任何外源性基因的RPE細胞聯合AGEs誘導；Vec+AGEs組、PSF+AGEs組利用轉染試劑脂質體2000將pcDNA空載體或pcDNA-PSF真核表達質粒導入RPE細胞聯合AGEs誘導。除N組以外，其余3組細胞進行相應的轉染處理，24 h后應用150 μg/ml的AGEs刺激72 h。采用HE染色和Hoechst 33258染色觀察PSF高表達對RPE細胞凋亡相關形態改變的影響；通過ROS水平檢測分析PSF高表達對AGEs誘導的RPE細胞ROS表達的影響；采用MTT比色法檢測PSF高表達對RPE細胞生存力的影響；采用Western blot檢測PSF不同作用時間及不同劑量對血紅素氧合酶1（HO-1）表達的影響。結果HE染色和Hoechst 33258染色觀察發現，N組細胞形態飽滿，細胞核呈圓形，細胞質豐富，染色均一；N+AGEs組、Vec+AGEs組細胞體積縮小，嗜酸性染色增強，細胞核致密濃染、固縮甚至碎裂；PSF+AGEs組細胞形態尚飽滿，細胞漿染色較均勻，細胞核染色均一。MTT比色法檢測結果顯示，PSF高表達可有效提高RPE細胞生存力，但該作用可被ZnPP有效拮抗，且差異有統計學意義（F=33.26，P＜0.05）。DCFH-DA法檢測結果顯示，與N+AGEs組、Vec+AGEs組比較，PSF+AGEs組細胞中ROS產量下降，差異有統計學意義（F=11.94，P＜0.05）。Western blot檢測結果顯示，PSF蛋白以時間、劑量依賴性的方式上調HO-1的表達水平。PSF蛋白作用24、48、72 h的HO-1相對表達水平較0 h明顯升高，差異有統計學意義（F=164.91，P＜0.05）。0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 μg PSF蛋白作用下的HO-1相對表達水平較0.0 μg明顯升高，差異有統計學意義（F=104.82，P＜0.05）。結論PSF可能通過上調HO-1的表達而抑制ROS產生，從而對AGEs誘導下的RPE細胞損傷發揮保護作用。
目的觀察慢病毒介導聚嘧啶束結合蛋白相關剪接因子（PSF）對氧誘導視網膜病變（OIR）小鼠視網膜新生血管的抑制作用。方法5日齡C57BL/6J小鼠112只隨機分為正常對照組、單純OIR模型組、OIR模型+慢病毒空載體處理組（以下簡稱Vec組）及OIR模型+ PSF慢病毒處理組（以下簡稱PSF組），分別為16、32、32、32只。小鼠7日齡時，正常對照組小鼠常規環境飼養；單純OIR模型組、Vec組及PSF組小鼠建立OIR模型。小鼠12日齡時，Vec組、PSF組小鼠玻璃體腔分別注射滴度為1×1011 TU/ml的空載體病毒或PSF慢病毒1 μl。正常對照組和單純OIR模型組小鼠不再做任何處理。小鼠17日齡時，采用HE染色計數突破視網膜內界膜的血管內皮細胞核；作視網膜鋪片，測量各組小鼠視網膜無灌注區相對面積；采用實時定量PCR檢測各組小鼠視網膜中NF-E2相關因子2（Nrf2）和血紅素氧合酶1（HO-1）的mRNA相對表達量；采用Western blot檢測各組小鼠視網膜中Nrf2、HO-1及PSF的蛋白相對表達量。組間比較采用單因素方差分析。結果正常對照組、單純OIR模型組、Vec組、PSF組小鼠突破內界膜的血管內皮細胞核數分別為0.00、14.36±5.50、15.67±4.96、8.13±2.09個；視網膜無灌注區面積分別為0.00%、（35.71±2.81）%、（36.57±4.53）%、（15.33±4.75）%。4組間小鼠突破內界膜的血管內皮細胞核數及視網膜無灌注區面積比較，差異均有統計學意義（F=24.87、165.70，P＜0.05）。組間兩兩比較，單純OIR模型組、Vec組較正常對照組突破內界膜的血管內皮細胞核數增多，視網膜無灌注區面積增大；PSF組較單純OIR模型組、Vec組突破內界膜的血管內皮細胞核數減少，視網膜無灌注區面積減小，差異均有統計學意義（P＜0.05）。實時定量PCR及Western blot檢測結果顯示，4組間小鼠視網膜Nrf2、PSF mRNA相對表達量（F=53.66、83.54）以及Nrf2、HO-1、PSF蛋白相對表達量（F=58.38、52.69、24.79）比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。組間兩兩比較，單純OIR模型組、Vec組小鼠視網膜Nrf2、PSF mRNA相對表達量及Nrf2、HO-1、PSF蛋白相對表達量較正常對照組明顯降低，PSF組小鼠視網膜Nrf2、PSF mRNA相對表達量及Nrf2、HO-1、PSF蛋白相對表達量較單純OIR模型組、Vec組明顯增加，差異均有統計學意義（P＜0.05）。結論慢病毒介導的PSF可通過上調Nrf2及HO-1的表達抑制OIR小鼠視網膜新生血管形成。
目的觀察多聚嘧啶序列結合蛋白相關剪接因子（PSF）對缺氧誘導的人視網膜微血管內皮細胞（hRMECs）功能的影響。方法采用三質粒系統構建慢病毒顆粒（LV）-PSF。LV-PSF體外感染hRMECs后通過流式細胞計數法測定其感染效率。應用實時定量PCR（RT-PCR）檢測經LV-PSF感染的hRMECs中PSF mRNA表達水平。將實驗分為體內和體外兩部分。體內實驗：7日齡健康C57B/L6小鼠20只，采用隨機數字表法分為正常組、氧誘導視網膜病變（OIR）組、OIR+LV-空載體（Vec）組和OIR+LV-PSF組，每組5只。除正常組外，其余3組構建OIR模型。OIR組除缺氧刺激外，不做其余處理。OIR+LV-Vec組和OIR+LV-PSF組小鼠分別玻璃體腔注射LV-Vec或LV-PSF。觀察LV-PSF對視網膜新生血管（RNV）形成的影響。體外實驗：將hRMECs分為正常組、缺氧組、空載組、PSF高表達組。正常組為正常體外培養的hRMECs；缺氧組為缺氧刺激3 h恢復正常培養條件24 h的hRMECs；空載組、PSF高表達組分別為用LV-Vec、LV-PSF感染48 h，再用缺氧刺激3 h恢復正常培養條件24 h的hRMECs。采用MTT比色法觀察PSF對細胞增生能力的影響。采用細胞劃痕實驗和Transwell遷移實驗觀察PSF對缺氧刺激下細胞遷移能力的影響。采用RT-PCR觀察各組細胞中HIF-1α、VEGF及PSF的mRNA表達。結果成功構建可穩定高表達PSF的LV-PSF，流式細胞儀測定其感染效率為97%，RT-PCR測得經LV-PSF感染的hRMECs中PSF mRNA水平明顯上調。體內實驗：OIR組、OIR+LV-Vec組小鼠RNV面積較正常組明顯增加（t=18.31、43.71），OIR+LV-PSF組小鼠RNV面積較OIR組（t=11.30）、OIR+LV-Vec組（t=15.47）明顯減小，差異均有統計學意義（P＜0.05）。體外實驗：MTT比色法檢測結果顯示，缺氧組hRMECs增生能力較正常組明顯增強（t=2.57），PSF高表達組hRMECs增生能力較正常組、缺氧組、空載組明顯降低（t=5.26、5.46、3.73），差異均有統計學意義（P＜0.05）。細胞劃痕實驗結果顯示，缺氧刺激3 h恢復正常條件24 h或48 h均可刺激缺氧組與空載組細胞明顯遷移（t=8.35、13.84，P＜0.05）；而與缺氧組與空載組比較，PSF高表達組細胞遷移不明顯（t=10.99、18.27、9.75、8.93、26.94、7.01，P＜0.05）。Transwell小室實驗結果顯示，正常組和空載組微孔膜上染色的細胞數較多，而PSF高表達組微孔膜上染色的細胞數明顯減少（t=9.33、6.15，P＜0.05）。RT-PCR檢測結果顯示，與正常組比較，缺氧組、空載組hRMECs中HIF-1α、VEGF的mRNA表達明顯增加（t=15.23、21.09，P＜0.05），PSF mRNA表達無明顯變化（t=0.12、2.15， P＜0.05）；與缺氧組、空載組比較，PSF高表達組hRMECs中HIF-1α、VEGF的mRNA表達明顯下降（t=10.18、13.10，P＜0.05），PSF mRNA表達明顯增加（t=65.00、85.79，P＜0.05）。結論PSF可減少OIR模型小鼠RNV面積。PSF可能通過HIF-1α/VEGF信號通路抑制缺氧誘導的hRMECs增生和遷移。