引用本文： 徐嫚鴻, 漆晨, 劉勛, 林婷婷, 王瓊, 洪亞茹, 李筱榮, 東莉潔. 聚嘧啶束結合蛋白相關剪接子高表達對糖基化終末產物誘導下人視網膜微血管內皮細胞氧化損傷的作用. 中華眼底病雜志, 2020, 36(8): 633-640. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20181012-00344 復制
糖尿病視網膜病變（DR）是糖尿病最常見的微血管并發癥之一[1-2]。其發病機制包括內質網應激和未折疊蛋白反應、MMP分泌增加、氧化應激、線粒體損傷、表觀遺傳學修飾和血管內皮祖細胞功能障礙等[3-8]；而其中糖基化終末產物（AGEs）可啟動糖尿病性異常代謝，導致體內氧化和抗氧化系統失衡一直是本領域的研究熱點[9-10]。在糖尿病相關的病理生理過程中，高糖誘導的蛋白質氧化損傷發揮著越來越重要的作用[11]。葡萄糖氧化以及葡萄糖與循環蛋白的非酶促共價連接可導致糖化蛋白和AGEs的形成，AGEs便可與靶細胞上的AGE受體（RAGE）結合導致大量ROS產生并且誘發氧化應激損傷，進而誘導糖尿病并發癥的發生發展[12-14]。多聚嘧啶序列結合蛋白相關剪接子（PSF）是一種相對分子質量為76×103的核酸結合蛋白[15]，可以與聚嘧啶束結合蛋白結合發揮基因轉錄調控、DNA損傷修復和RNA剪接等基因調節作用[16]。本課題組前期研究發現，通過慢病毒轉染可實現PSF在人視網膜微血管內皮細胞（hRMECs）過表達[17]；PSF可以抑制H2O2對RPE細胞的氧化應激損傷[18-19]；而血紅素氧合酶-1（HO-1）具有對抗氧化應激損傷的作用。據此我們推測，PSF可能通過調控HO-1及其相關信號通路保護血管內皮細胞免受氧化應激損傷。為此，本研究觀察探討了PSF高表達對于AGEs誘導下hRMECs氧化損傷的保護作用及相應分子機制，以期為DR的治療提供潛在生物學靶點。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 主要實驗材料和實驗分組
hRMECs由天津醫科大學眼科醫院劉勃實醫生惠贈。過表達PSF慢病毒（LV-pCDH-CMV-PSF）和空載慢病毒（LV-pEGFP-Vector）由本實驗室自行構建。1倍DMEM培養基、胰蛋白酶、青霉素/鏈霉素（P/S）、10%胎牛血清（FBS，美國Gibco公司），PBS（上海立菲生物技術有限公司），PBS-T溶液（北京索萊寶公司）。細胞培養板（美國Costar公司），恒溫培養箱、超凈工作臺（美國Thermo Fisher公司）。AGEs-BSA（美國BioVision公司），兔抗HO-1抗體、兔抗磷酸化（p）細胞外調節蛋白激酶（ERK）抗體、兔抗ERK1抗體、兔抗核因子2相關因子2（Nrf2）抗體、兔抗GAPDH 抗體、鼠抗兔IgM 抗體（北京博奧森生物技術有限公司），鋅原卟啉（ZnPP，美國Sigma Aldrich公司），U0126（美國Emd millipore公司）。聚偏氟乙烯膜（美國Millipore公司），ECL曝光底物（美國GE公司）。BX51正置顯微鏡（日本Olympus公司）。HE染色試劑盒（北京索萊寶生物有限公司），Hoechst33258染色劑（上海翊圣生物科技有限公司），線粒體超氧化物熒光探針（上海前塵生物科技有限公司）。
將hRMECs分為正常組、空載組、PSF組、ZnPP組及PSF+ZnPP組進行實驗。正常組細胞使用含有10% FBS、P/S的DMEM培養基，置于37 ℃、95%空氣、5% CO2的密閉恒溫培養箱中培養。空載組細胞采用LV-pEGFP-Vector感染。PSF組細胞采用LV-pCDH-CMV-PSF感染。ZnPP組細胞采用ZnPP（10 mol/L）預處理2 h。PSF+ZnPP組細胞采用LV-pCDH-CMV-PSF感染后，再用ZnPP（10 mol/L）預處理2 h。除正常組外，其他四組細胞均接受AGEs刺激。即吸去hRMECs完全培養基，用150 μg/ml的AGEs刺激細胞72 h后換完全培養基或PBS，待用。
1.2 HE染色
將hRMECs以2.5×105個/ml的細胞密度接種于玻片上并置于24孔板中，用含10%FBS、P/S的DMEM 培養基在37 ℃、5% CO2培養箱中培養過夜。待細胞融合度達70%左右時，除正常組外的其他四組細胞分別加入150 μg/ml的AGEs刺激72 h，換PBS終止刺激，取出細胞爬片。在4%多聚甲醛中固定10 min后用PBS清洗，繼而在PBS-T溶液中破膜10 min，蘇木素染液染色1 min后用自來水洗滌；醋酸溶液中蘸取2次后用自來水洗滌；0.5%氨水中蘸取2次后用自來水洗滌，伊紅溶液浸泡50 s后在梯度酒精中脫水，然后在二甲苯溶液中浸泡30 s，最后用中性樹膠封片。光學顯微鏡下觀察AGEs刺激下PSF高表達對細胞形態的影響。每組細胞均設3個復孔，實驗重復3次。
1.3 Hoechst33258染色
將hRMECs以5×104個/ml的細胞密度接種于96孔板中，待細胞融合度達80%左右時，按實驗分組做相應處理后，將除正常組外的其他四組細胞棄去原完全培養基，使用150 μg/ml的AGEs刺激72 h，吸去上清液，PBS洗滌2次，每孔加入0.5 μg/ml的Hoechst33258染液30 μl，染色15 min后，吸去染液，PBS洗滌1次。熒光顯微鏡下觀察AGEs刺激后PSF高表達對細胞核形態的影響。每組細胞均設3個復孔，實驗重復3次。
1.4 流式細胞術
將生長狀態良好的hRMECs以5×104個/ml的細胞密度接種于96孔板中，細胞先用完全培養基培養24 h后用去除血清的培養基再次培養24 h。待細胞密度約為80%時，進行各組相應處理后，用無血清培養基配置線粒體超氧化物熒光探針（終濃度2.5 μmol/L）并加入孔板中孵育1 h，并使用流式細胞儀檢測ROS的產生情況。實驗重復3次。
1.5 Western blot檢測細胞中蛋白的表達水平
采用Western blot檢測細胞中HO-1、pERK、HO-1/Nrf2蛋白表達。將hRMECs以1.2×106個/ml的細胞密度接種于6孔板，用含10%FBS、P/S的DMEM培養基在37 ℃、5% CO2培養箱中培養過夜，按實驗設計分組并處理后（表1）在各組細胞中分別加入150 μg/ml的AGEs刺激72 h，換PBS終止刺激并分別收集各組全細胞提取物，以SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白復合物，轉膜后，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入相應一抗進行雜交，4 ℃孵育過夜后，以1倍TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min，用HRP標記的二抗繼續孵育1 h，再以1倍TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min，最后加入ECL曝光底物，進行曝光并拍照，以檢測相關蛋白表達。實驗重復3次。
表1
Western blot實驗分組及處理方式
1.6 統計學方法
采用Graphprism軟件對獲得數據進行圖表整理。采用SPSS18.0軟件進行統計學分析。多組計量資料比較采用方差齊性檢驗，方差齊時采用方差分析，方差不齊時采用t檢驗，總體均數有差異時采用兩兩比較。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 PSF抑制AGEs對hRMECs氧化損傷，加入ZnPP后細胞受損程度加劇
光學顯微鏡觀察發現，正常組細胞形態飽滿，細胞核呈圓形。AGEs處理的空載組、PSF組和PSF+ZnPP組細胞可見細胞體積縮小、細胞漿濃縮及細胞核固縮等細胞受損表現（圖1）。相比之下，PSF組的細胞受損程度輕于空載組和ZnPP組，PSF+ZnPP組細胞損傷程度明顯重于PSF組。定量分析結果顯示，PSF組受損細胞數較正常組明顯增多，較PSF+ZnPP組明顯減少，差異有統計學意義（F=27.5，P＜0.05）（圖2）。
圖1
各組細胞光學顯微鏡像。1A示正常組；1B示空載組；1C示PSF組；1D示ZnPP組；1F示PSF+ZnPP組。正常組細胞形態飽滿，細胞核呈圓形；AGEs處理的空載組、PSF組、ZnPP組和PSF+ZnPP組細胞可見細胞體積縮小、細胞漿濃縮及細胞核固縮等細胞受損表現（白箭）HE ×20
圖2
各組細胞受損細胞數比較。*P＜0.05
2.2 PSF對抗AGEs的氧化損傷作用，但ZnPP可加劇細胞受損
熒光顯微鏡觀察發現，正常組細胞核呈均勻的藍色熒光，細胞核邊緣光滑整齊；空載組、ZnPP組、PSF+ZnPP組細胞均出現細胞核固縮、碎片化表現，因而呈現點狀的致密濃染藍色熒光；而PSF組也出現了細胞受損凋亡的形態學改變，但受損程度明顯輕于空載組和PSF+ZnPP組（圖3）。PSF組受損細胞核數較正常組明顯增加，較PSF+ZnPP組明顯減少，差異均有統計學意義（F=38.7，P＜0.05）（圖4）。
圖3
各組細胞熒光顯微鏡像。3A示正常組；3B示空載組；3C示PSF組；3D示ZnPP組；3F示PSF+ZnPP組。正常組細胞核呈均勻的藍色熒光，細胞核邊緣光滑整齊；空載組、ZnPP組和PSF+ZnPP組細胞均出現細胞核固縮、碎片化表現，因而呈現點狀的致密濃染藍色熒光；而PSF組也出現了細胞受損凋亡的形態學改變，但受損程度明顯輕于空載組和PSF+ZnPP組（白箭）Hoechst33258 ×20
圖4
各組細胞受損細胞核數比較。*P＜0.05
2.3 PSF抑制AGEs刺激的ROS產生，ZnPP可加劇細胞中ROS生成
流式細胞儀檢測結果顯示，AGEs刺激可增加hRMECs中ROS的產生，PSF組ROS的水平明顯高于正常組，但明顯低于空載組、ZnPP組和PSF+ZnPP組，差異有統計學意義（F=126.4，P＜0.05）。ZnPP組細胞中ROS水平明顯高于PSF+ZnPP組，差異有統計學意義（F=69.4，P＜0.05）（圖5，6）。
圖5
各組細胞流式細胞圖。可見正常組細胞熒光強度較低，空載組和PSF組細胞熒光強度高于正常組，PSF+ZnPP組細胞熒光強度最高，ROS的產生最多
圖6
各組細胞平均熒光強度比較。*P＜0.05
2.4 PSF對AGEs處理的hRMECs中HO-1、pERK、Nrf2蛋白表達量的影響
Western blot檢測結果顯示，AGEs對正常組和空載組hRMECs中HO-1的蛋白表達量并無影響，但當上調細胞中PSF水平后，HO-1的蛋白表達量明顯增加。灰度分析結果顯示，PSF組HO-1蛋白表達量較正常組、空載組明顯增加，差異均有統計學意義（F=70.1，P＜0.05）（圖7A）。
圖7
各組HO-1、pERK、Nrf2蛋白表達量比較。7A示HO-1；7B示pERK；7C示HO-1；7D示Nrf2。*P＜0.05
Western blot檢測結果顯示，未加入AGEs處理細胞時，上調PSF水平并不能刺激細胞表達pERK蛋白；但當加入AGEs后，過表達的PSF則可促進pERK的蛋白表達。pERK在AGEs刺激的早期就可以表達，隨著AGEs作用時間的延長，pERK的蛋白表達量呈現先增加后減少的趨勢，在120 min時蛋白表達量最高。灰度分析結果顯示，AGEs處理30、60、120、240 min時pERK的蛋白表達量與15 min時比較，差異均有統計學意義（F=474.0，P＜0.05）（圖7B）。
Western blot檢測結果顯示，PSF可以增加HO-1、Nrf2的蛋白表達量，而U0126作用于細胞卻可以抑制HO-1、Nrf2的蛋白表達量。灰度分析結果顯示，PSF+/U0126－組HO-1、Nrf2蛋白表達量較PSF－/U0126－組明顯增加，PSF+/U0126+組HO-1、Nrf2蛋白表達量較PSF+/U0126－組明顯降低，差異有統計學意義（F=30.2、489.4，P＜0.05）（圖7C，7D）。
根據實驗結果，我們總結出PSF調控ERK從而抑制ROS的分子機制圖。PSF通過上調ERK和pERK的表達，進而促進Nrf2（N）的表達；細胞核內的Nrf2（N）顯著增加HO-1的轉錄水平，從而發揮抑制AGEs誘導細胞中ROS的產生，這可能是PSF抑制氧化應激從而治療DR的潛在作用機制（圖8）。
圖8
PSF調控ERK以減輕AGEs造成氧化應激損傷的分子生物學機制圖
3 討論
在DR的發病機制中，由于循環中高血糖與蛋白質、脂質或核酸等大分子在沒有酶參與的條件下生成AGEs，從而啟動糖尿病性異常代謝，進一步推動了氧化應激[20-21]。AGEs在糖尿病及其并發癥中均有重要作用，在發生糖尿病及腎衰時，體內AGEs聚集以及生長因子的過度分泌，會導致系膜增生核腎小球肥大[22]；此外RAGE與其配體的結合引起腎組織中的氧化應激和慢性炎癥，這些都與糖尿病腎病的發生發展密切相關[23]。AGEs還可氧化低密度脂蛋白直接改變其結構功能，同時通過與RAGE結合產生病理效應，在血管損傷的過程中起到重要作用[24]。本研究中我們通過HE染色和Hoechst33258染色觀察PSF對細胞抗氧化應激的作用。HE染色結果顯示，AGEs可以誘導細胞損傷，PSF可以抑制這種由于氧化應激而導致的損傷；Hoechst33258染色結果顯示，AGEs處理后細胞出現核固縮、碎片化等受損的形態學表現，當上調PSF后可以改善細胞的受損程度。研究指出，ZnPP是由于血液中鉛含量升高，抑制亞鐵絡合酶，導致紅細胞中游離原卟啉增多并且與紅細胞線粒體中的鋅結合而形成的復合物[25]。ZnPP可以抑制細胞中HO-1的表達[26]。當我們用ZnPP處理細胞后，即使上調PSF細胞也會出現受到氧化應激損傷的形態學表現，且受損程度較PSF組明顯嚴重。由此說明，PSF可能通過調節HO-1的基因轉錄和翻譯來對抗AGEs造成的氧化應激損傷。
HO-1是一種參與血紅素降解的限速酶，其上調在對抗氧化應激損傷、維持體內氧化和抗氧化動態平衡和抑制炎癥反應等過程中發揮重要作用[27-28]。進一步驗證PSF對HO-1的調控作用發現，正常培養的細胞和LV-pEGFP-Vector感染的細胞中HO-1蛋白的表達水平并無明顯升高；而當過表達PSF后，細胞中HO-1蛋白的表達量明顯增高。這提示在AGEs刺激下，PSF可以促進HO-1的表達。
絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）/ERK途徑是細胞中的蛋白質鏈，當信號分子與細胞表面上的受體結合，該途徑可以將來自細胞表面的受體信號傳遞至細胞核中，而在信號傳遞的過程中，ERK通過添加磷酸基團成為pERK而發揮“開關”作用[29-30]。Lee等[31]研究表明，類黃酮通過內皮細胞中的ERK/Nrf2 /抗氧化反應元件（ARE）依賴性途徑誘導HO-1表達。Zhang等[32]發現，依達拉奉治療可明顯改善慢性腦缺血所導致的認知功能障礙，同時可以激活與ERK相關的Nrf2信號通路，提高內源性抗氧化劑超氧化物歧化酶活性和HO-1水平，從而降低海馬區丙二醛的含量。因此我們猜想，PSF是通過調節ERK的表達來發揮對HO-1的調控。進一步的研究結果表明，當過表達PSF后，如果不對細胞進行AGEs刺激處理，pERK不表達；但當細胞受到AGEs刺激后，pERK在刺激早期就有表達，且pERK蛋白表達水平隨著AGEs作用時間延長而增加。據此我們推斷，PSF在細胞生理狀態下不發揮作用，而在細胞受到氧化應激后才會調控pERK的表達，并且這種調控作用具有時間依賴性。U0126是一種高度選擇性的MAPK激酶MEK1/2抑制劑，用U0126處理細胞可以抑制細胞中ERK的表達[33-34]。本研究結果顯示，U0126可以降低PSF所誘導的HO-1表達上調。這提示PSF是通過激活ERK并使其磷酸化來進一步啟動HO-1的轉錄和翻譯。
既往研究發現，Keap1-Nrf2/HO-1信號通路是多種疾病的治療靶點。Hesp可能通過激活Keap1-Nrf2/HO-1信號通路抑制由H2O2誘導的ARPE-19氧化損傷[35]。在阿爾茲海默癥中，該信號通路已被證實是神經保護作用的潛在靶點[36]。Nrf2是一種基本的亮氨酸拉鏈（bZIP）蛋白，可調節抗氧化蛋白的表達，防止因損傷和炎癥引發的氧化損傷。正常生理狀態下，Keap1與Nrf2以復合物的形式存在于細胞質中，而當機體受到氧化損傷時，細胞質中的Keap1發生構象變化，使Keap1和Nrf2由復合物形式解離，游離的Nrf2進入細胞核與ARE結合進而啟動HO-1的基因轉錄[37-39]。我們發現，ERK的抑制劑U0126可以抑制PSF對Nrf2表達的調控。我們認為，在氧化應激條件下PSF可以通過啟動ERK的轉錄，促進Nrf2和Keap1復合物在細胞質內的解離，同時促進Nrf2入核，進一步發揮對HO-1轉錄表達的調控作用，從而減輕AGEs對細胞的氧化損傷。本研究初步驗證了PSF抑制氧化應激的分子學機制，接下來還將對Keap1和Nrf2的具體作用機制進行深入探究。
糖尿病視網膜病變（DR）是糖尿病最常見的微血管并發癥之一[1-2]。其發病機制包括內質網應激和未折疊蛋白反應、MMP分泌增加、氧化應激、線粒體損傷、表觀遺傳學修飾和血管內皮祖細胞功能障礙等[3-8]；而其中糖基化終末產物（AGEs）可啟動糖尿病性異常代謝，導致體內氧化和抗氧化系統失衡一直是本領域的研究熱點[9-10]。在糖尿病相關的病理生理過程中，高糖誘導的蛋白質氧化損傷發揮著越來越重要的作用[11]。葡萄糖氧化以及葡萄糖與循環蛋白的非酶促共價連接可導致糖化蛋白和AGEs的形成，AGEs便可與靶細胞上的AGE受體（RAGE）結合導致大量ROS產生并且誘發氧化應激損傷，進而誘導糖尿病并發癥的發生發展[12-14]。多聚嘧啶序列結合蛋白相關剪接子（PSF）是一種相對分子質量為76×103的核酸結合蛋白[15]，可以與聚嘧啶束結合蛋白結合發揮基因轉錄調控、DNA損傷修復和RNA剪接等基因調節作用[16]。本課題組前期研究發現，通過慢病毒轉染可實現PSF在人視網膜微血管內皮細胞（hRMECs）過表達[17]；PSF可以抑制H2O2對RPE細胞的氧化應激損傷[18-19]；而血紅素氧合酶-1（HO-1）具有對抗氧化應激損傷的作用。據此我們推測，PSF可能通過調控HO-1及其相關信號通路保護血管內皮細胞免受氧化應激損傷。為此，本研究觀察探討了PSF高表達對于AGEs誘導下hRMECs氧化損傷的保護作用及相應分子機制，以期為DR的治療提供潛在生物學靶點。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 主要實驗材料和實驗分組
hRMECs由天津醫科大學眼科醫院劉勃實醫生惠贈。過表達PSF慢病毒（LV-pCDH-CMV-PSF）和空載慢病毒（LV-pEGFP-Vector）由本實驗室自行構建。1倍DMEM培養基、胰蛋白酶、青霉素/鏈霉素（P/S）、10%胎牛血清（FBS，美國Gibco公司），PBS（上海立菲生物技術有限公司），PBS-T溶液（北京索萊寶公司）。細胞培養板（美國Costar公司），恒溫培養箱、超凈工作臺（美國Thermo Fisher公司）。AGEs-BSA（美國BioVision公司），兔抗HO-1抗體、兔抗磷酸化（p）細胞外調節蛋白激酶（ERK）抗體、兔抗ERK1抗體、兔抗核因子2相關因子2（Nrf2）抗體、兔抗GAPDH 抗體、鼠抗兔IgM 抗體（北京博奧森生物技術有限公司），鋅原卟啉（ZnPP，美國Sigma Aldrich公司），U0126（美國Emd millipore公司）。聚偏氟乙烯膜（美國Millipore公司），ECL曝光底物（美國GE公司）。BX51正置顯微鏡（日本Olympus公司）。HE染色試劑盒（北京索萊寶生物有限公司），Hoechst33258染色劑（上海翊圣生物科技有限公司），線粒體超氧化物熒光探針（上海前塵生物科技有限公司）。
將hRMECs分為正常組、空載組、PSF組、ZnPP組及PSF+ZnPP組進行實驗。正常組細胞使用含有10% FBS、P/S的DMEM培養基，置于37 ℃、95%空氣、5% CO2的密閉恒溫培養箱中培養。空載組細胞采用LV-pEGFP-Vector感染。PSF組細胞采用LV-pCDH-CMV-PSF感染。ZnPP組細胞采用ZnPP（10 mol/L）預處理2 h。PSF+ZnPP組細胞采用LV-pCDH-CMV-PSF感染后，再用ZnPP（10 mol/L）預處理2 h。除正常組外，其他四組細胞均接受AGEs刺激。即吸去hRMECs完全培養基，用150 μg/ml的AGEs刺激細胞72 h后換完全培養基或PBS，待用。
1.2 HE染色
將hRMECs以2.5×105個/ml的細胞密度接種于玻片上并置于24孔板中，用含10%FBS、P/S的DMEM 培養基在37 ℃、5% CO2培養箱中培養過夜。待細胞融合度達70%左右時，除正常組外的其他四組細胞分別加入150 μg/ml的AGEs刺激72 h，換PBS終止刺激，取出細胞爬片。在4%多聚甲醛中固定10 min后用PBS清洗，繼而在PBS-T溶液中破膜10 min，蘇木素染液染色1 min后用自來水洗滌；醋酸溶液中蘸取2次后用自來水洗滌；0.5%氨水中蘸取2次后用自來水洗滌，伊紅溶液浸泡50 s后在梯度酒精中脫水，然后在二甲苯溶液中浸泡30 s，最后用中性樹膠封片。光學顯微鏡下觀察AGEs刺激下PSF高表達對細胞形態的影響。每組細胞均設3個復孔，實驗重復3次。
1.3 Hoechst33258染色
將hRMECs以5×104個/ml的細胞密度接種于96孔板中，待細胞融合度達80%左右時，按實驗分組做相應處理后，將除正常組外的其他四組細胞棄去原完全培養基，使用150 μg/ml的AGEs刺激72 h，吸去上清液，PBS洗滌2次，每孔加入0.5 μg/ml的Hoechst33258染液30 μl，染色15 min后，吸去染液，PBS洗滌1次。熒光顯微鏡下觀察AGEs刺激后PSF高表達對細胞核形態的影響。每組細胞均設3個復孔，實驗重復3次。
1.4 流式細胞術
將生長狀態良好的hRMECs以5×104個/ml的細胞密度接種于96孔板中，細胞先用完全培養基培養24 h后用去除血清的培養基再次培養24 h。待細胞密度約為80%時，進行各組相應處理后，用無血清培養基配置線粒體超氧化物熒光探針（終濃度2.5 μmol/L）并加入孔板中孵育1 h，并使用流式細胞儀檢測ROS的產生情況。實驗重復3次。
1.5 Western blot檢測細胞中蛋白的表達水平
采用Western blot檢測細胞中HO-1、pERK、HO-1/Nrf2蛋白表達。將hRMECs以1.2×106個/ml的細胞密度接種于6孔板，用含10%FBS、P/S的DMEM培養基在37 ℃、5% CO2培養箱中培養過夜，按實驗設計分組并處理后（表1）在各組細胞中分別加入150 μg/ml的AGEs刺激72 h，換PBS終止刺激并分別收集各組全細胞提取物，以SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白復合物，轉膜后，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入相應一抗進行雜交，4 ℃孵育過夜后，以1倍TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min，用HRP標記的二抗繼續孵育1 h，再以1倍TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min，最后加入ECL曝光底物，進行曝光并拍照，以檢測相關蛋白表達。實驗重復3次。
表1
Western blot實驗分組及處理方式
1.6 統計學方法
采用Graphprism軟件對獲得數據進行圖表整理。采用SPSS18.0軟件進行統計學分析。多組計量資料比較采用方差齊性檢驗，方差齊時采用方差分析，方差不齊時采用t檢驗，總體均數有差異時采用兩兩比較。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 PSF抑制AGEs對hRMECs氧化損傷，加入ZnPP后細胞受損程度加劇
光學顯微鏡觀察發現，正常組細胞形態飽滿，細胞核呈圓形。AGEs處理的空載組、PSF組和PSF+ZnPP組細胞可見細胞體積縮小、細胞漿濃縮及細胞核固縮等細胞受損表現（圖1）。相比之下，PSF組的細胞受損程度輕于空載組和ZnPP組，PSF+ZnPP組細胞損傷程度明顯重于PSF組。定量分析結果顯示，PSF組受損細胞數較正常組明顯增多，較PSF+ZnPP組明顯減少，差異有統計學意義（F=27.5，P＜0.05）（圖2）。
圖1
各組細胞光學顯微鏡像。1A示正常組；1B示空載組；1C示PSF組；1D示ZnPP組；1F示PSF+ZnPP組。正常組細胞形態飽滿，細胞核呈圓形；AGEs處理的空載組、PSF組、ZnPP組和PSF+ZnPP組細胞可見細胞體積縮小、細胞漿濃縮及細胞核固縮等細胞受損表現（白箭）HE ×20
圖2
各組細胞受損細胞數比較。*P＜0.05
2.2 PSF對抗AGEs的氧化損傷作用，但ZnPP可加劇細胞受損
熒光顯微鏡觀察發現，正常組細胞核呈均勻的藍色熒光，細胞核邊緣光滑整齊；空載組、ZnPP組、PSF+ZnPP組細胞均出現細胞核固縮、碎片化表現，因而呈現點狀的致密濃染藍色熒光；而PSF組也出現了細胞受損凋亡的形態學改變，但受損程度明顯輕于空載組和PSF+ZnPP組（圖3）。PSF組受損細胞核數較正常組明顯增加，較PSF+ZnPP組明顯減少，差異均有統計學意義（F=38.7，P＜0.05）（圖4）。
圖3
各組細胞熒光顯微鏡像。3A示正常組；3B示空載組；3C示PSF組；3D示ZnPP組；3F示PSF+ZnPP組。正常組細胞核呈均勻的藍色熒光，細胞核邊緣光滑整齊；空載組、ZnPP組和PSF+ZnPP組細胞均出現細胞核固縮、碎片化表現，因而呈現點狀的致密濃染藍色熒光；而PSF組也出現了細胞受損凋亡的形態學改變，但受損程度明顯輕于空載組和PSF+ZnPP組（白箭）Hoechst33258 ×20
圖4
各組細胞受損細胞核數比較。*P＜0.05
2.3 PSF抑制AGEs刺激的ROS產生，ZnPP可加劇細胞中ROS生成
流式細胞儀檢測結果顯示，AGEs刺激可增加hRMECs中ROS的產生，PSF組ROS的水平明顯高于正常組，但明顯低于空載組、ZnPP組和PSF+ZnPP組，差異有統計學意義（F=126.4，P＜0.05）。ZnPP組細胞中ROS水平明顯高于PSF+ZnPP組，差異有統計學意義（F=69.4，P＜0.05）（圖5，6）。
圖5
各組細胞流式細胞圖。可見正常組細胞熒光強度較低，空載組和PSF組細胞熒光強度高于正常組，PSF+ZnPP組細胞熒光強度最高，ROS的產生最多
圖6
各組細胞平均熒光強度比較。*P＜0.05
2.4 PSF對AGEs處理的hRMECs中HO-1、pERK、Nrf2蛋白表達量的影響
Western blot檢測結果顯示，AGEs對正常組和空載組hRMECs中HO-1的蛋白表達量并無影響，但當上調細胞中PSF水平后，HO-1的蛋白表達量明顯增加。灰度分析結果顯示，PSF組HO-1蛋白表達量較正常組、空載組明顯增加，差異均有統計學意義（F=70.1，P＜0.05）（圖7A）。
圖7
各組HO-1、pERK、Nrf2蛋白表達量比較。7A示HO-1；7B示pERK；7C示HO-1；7D示Nrf2。*P＜0.05
Western blot檢測結果顯示，未加入AGEs處理細胞時，上調PSF水平并不能刺激細胞表達pERK蛋白；但當加入AGEs后，過表達的PSF則可促進pERK的蛋白表達。pERK在AGEs刺激的早期就可以表達，隨著AGEs作用時間的延長，pERK的蛋白表達量呈現先增加后減少的趨勢，在120 min時蛋白表達量最高。灰度分析結果顯示，AGEs處理30、60、120、240 min時pERK的蛋白表達量與15 min時比較，差異均有統計學意義（F=474.0，P＜0.05）（圖7B）。
Western blot檢測結果顯示，PSF可以增加HO-1、Nrf2的蛋白表達量，而U0126作用于細胞卻可以抑制HO-1、Nrf2的蛋白表達量。灰度分析結果顯示，PSF+/U0126－組HO-1、Nrf2蛋白表達量較PSF－/U0126－組明顯增加，PSF+/U0126+組HO-1、Nrf2蛋白表達量較PSF+/U0126－組明顯降低，差異有統計學意義（F=30.2、489.4，P＜0.05）（圖7C，7D）。
根據實驗結果，我們總結出PSF調控ERK從而抑制ROS的分子機制圖。PSF通過上調ERK和pERK的表達，進而促進Nrf2（N）的表達；細胞核內的Nrf2（N）顯著增加HO-1的轉錄水平，從而發揮抑制AGEs誘導細胞中ROS的產生，這可能是PSF抑制氧化應激從而治療DR的潛在作用機制（圖8）。
圖8
PSF調控ERK以減輕AGEs造成氧化應激損傷的分子生物學機制圖
3 討論
在DR的發病機制中，由于循環中高血糖與蛋白質、脂質或核酸等大分子在沒有酶參與的條件下生成AGEs，從而啟動糖尿病性異常代謝，進一步推動了氧化應激[20-21]。AGEs在糖尿病及其并發癥中均有重要作用，在發生糖尿病及腎衰時，體內AGEs聚集以及生長因子的過度分泌，會導致系膜增生核腎小球肥大[22]；此外RAGE與其配體的結合引起腎組織中的氧化應激和慢性炎癥，這些都與糖尿病腎病的發生發展密切相關[23]。AGEs還可氧化低密度脂蛋白直接改變其結構功能，同時通過與RAGE結合產生病理效應，在血管損傷的過程中起到重要作用[24]。本研究中我們通過HE染色和Hoechst33258染色觀察PSF對細胞抗氧化應激的作用。HE染色結果顯示，AGEs可以誘導細胞損傷，PSF可以抑制這種由于氧化應激而導致的損傷；Hoechst33258染色結果顯示，AGEs處理后細胞出現核固縮、碎片化等受損的形態學表現，當上調PSF后可以改善細胞的受損程度。研究指出，ZnPP是由于血液中鉛含量升高，抑制亞鐵絡合酶，導致紅細胞中游離原卟啉增多并且與紅細胞線粒體中的鋅結合而形成的復合物[25]。ZnPP可以抑制細胞中HO-1的表達[26]。當我們用ZnPP處理細胞后，即使上調PSF細胞也會出現受到氧化應激損傷的形態學表現，且受損程度較PSF組明顯嚴重。由此說明，PSF可能通過調節HO-1的基因轉錄和翻譯來對抗AGEs造成的氧化應激損傷。
HO-1是一種參與血紅素降解的限速酶，其上調在對抗氧化應激損傷、維持體內氧化和抗氧化動態平衡和抑制炎癥反應等過程中發揮重要作用[27-28]。進一步驗證PSF對HO-1的調控作用發現，正常培養的細胞和LV-pEGFP-Vector感染的細胞中HO-1蛋白的表達水平并無明顯升高；而當過表達PSF后，細胞中HO-1蛋白的表達量明顯增高。這提示在AGEs刺激下，PSF可以促進HO-1的表達。
絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）/ERK途徑是細胞中的蛋白質鏈，當信號分子與細胞表面上的受體結合，該途徑可以將來自細胞表面的受體信號傳遞至細胞核中，而在信號傳遞的過程中，ERK通過添加磷酸基團成為pERK而發揮“開關”作用[29-30]。Lee等[31]研究表明，類黃酮通過內皮細胞中的ERK/Nrf2 /抗氧化反應元件（ARE）依賴性途徑誘導HO-1表達。Zhang等[32]發現，依達拉奉治療可明顯改善慢性腦缺血所導致的認知功能障礙，同時可以激活與ERK相關的Nrf2信號通路，提高內源性抗氧化劑超氧化物歧化酶活性和HO-1水平，從而降低海馬區丙二醛的含量。因此我們猜想，PSF是通過調節ERK的表達來發揮對HO-1的調控。進一步的研究結果表明，當過表達PSF后，如果不對細胞進行AGEs刺激處理，pERK不表達；但當細胞受到AGEs刺激后，pERK在刺激早期就有表達，且pERK蛋白表達水平隨著AGEs作用時間延長而增加。據此我們推斷，PSF在細胞生理狀態下不發揮作用，而在細胞受到氧化應激后才會調控pERK的表達，并且這種調控作用具有時間依賴性。U0126是一種高度選擇性的MAPK激酶MEK1/2抑制劑，用U0126處理細胞可以抑制細胞中ERK的表達[33-34]。本研究結果顯示，U0126可以降低PSF所誘導的HO-1表達上調。這提示PSF是通過激活ERK并使其磷酸化來進一步啟動HO-1的轉錄和翻譯。
既往研究發現，Keap1-Nrf2/HO-1信號通路是多種疾病的治療靶點。Hesp可能通過激活Keap1-Nrf2/HO-1信號通路抑制由H2O2誘導的ARPE-19氧化損傷[35]。在阿爾茲海默癥中，該信號通路已被證實是神經保護作用的潛在靶點[36]。Nrf2是一種基本的亮氨酸拉鏈（bZIP）蛋白，可調節抗氧化蛋白的表達，防止因損傷和炎癥引發的氧化損傷。正常生理狀態下，Keap1與Nrf2以復合物的形式存在于細胞質中，而當機體受到氧化損傷時，細胞質中的Keap1發生構象變化，使Keap1和Nrf2由復合物形式解離，游離的Nrf2進入細胞核與ARE結合進而啟動HO-1的基因轉錄[37-39]。我們發現，ERK的抑制劑U0126可以抑制PSF對Nrf2表達的調控。我們認為，在氧化應激條件下PSF可以通過啟動ERK的轉錄，促進Nrf2和Keap1復合物在細胞質內的解離，同時促進Nrf2入核，進一步發揮對HO-1轉錄表達的調控作用，從而減輕AGEs對細胞的氧化損傷。本研究初步驗證了PSF抑制氧化應激的分子學機制，接下來還將對Keap1和Nrf2的具體作用機制進行深入探究。
