引用本文： 漆晨, 張慧, 林婷婷, 柯屹峰, 任新軍, 步紹翀, 黃亮瑜, 王勇, 焦明菲, 胡立穎, 王瓊, 洪亞茹, 李筱榮, 東莉潔. 聚嘧啶束結合蛋白相關剪接因子高表達對糖基化終末產物誘導下視網膜色素上皮細胞損傷的保護作用. 中華眼底病雜志, 2020, 36(1): 46-52. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2020.01.011 復制
慢性高血糖所致的糖基化終末產物（AGEs）在視網膜血管中的過度蓄積與糖尿病視網膜病變（DR）發生發展密切相關，其可以促進VEGF表達，增加氧化應激作用，促進視網膜毛細血管內皮細胞和周細胞凋亡等[1]。有研究發現，AGEs能降低溶酶體酶的降解能力，促進脂褐素沉積，造成RPE細胞損傷。RPE細胞參與構成視網膜外屏障，具有屏障、濾過、吞噬和分泌等作用，在維持視網膜正常的生理功能方面發揮重要作用。因此，如何干預AGEs對RPE細胞的損傷已成為近年來研究熱點。聚嘧啶束結合蛋白相關剪接因子（PSF）是一種多功能蛋白，可參與基因轉錄調控、DNA損傷修復、pre-mRNA的剪接等[2-3]。我們的前期研究發現，PSF蛋白可以通過抑制H2O2誘導的氧化應激反應造成的ROS堆積，維持RPE細胞穩態平衡，緩解RPE細胞凋亡[4]。考慮到AGEs是細胞氧化應激反應的重要誘導因素之一，本研究將PSF蛋白引入經AGEs刺激體外培養的人RPE細胞模型中，從而觀察PSF蛋白對AGEs誘導的RPE細胞的影響，以期闡明三者之間的相互作用，為DR生物學治療開發潛在新的治療靶點提供理論依據。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 主要實驗材料及分組
人RPE細胞株（ARPE-19細胞，廣州吉妮歐生物科技有限公司）。增強型綠色熒光蛋白質粒（pEGFP）-PSF真核表達質粒由本實驗室自行構建。MTT（北京索萊寶科技有限公司），AGEs溶液、2’,7’-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）（美國Sigma公司），轉染試劑脂質體2000（美國Invitrogen公司），Hoechst 33258染色劑（上海翊圣生物科技有限公司），聚偏氟乙烯膜（PVDF）膜（美國Millipore公司），增強化學發光（ECL）曝光底物、Infinite M200 Pro多功能酶標儀（美國Tecan公司），Olympus BX51正置顯微鏡、Olympus IX53熒光倒置顯微鏡（日本Olympus公司）。
實驗分為正常對照組（N組）、空白對照組（N+AGEs組）、空載體對照組（Vec+AGEs組）、PSF高表達組（PSF+AGEs組）進行。N組RPE細胞常規培養；N+AGEs組只做轉染處理但不導入任何外源性基因的RPE細胞聯合AGEs誘導；Vec+AGEs組利用轉染試劑脂質體2000將1.5 μg pcDNA空載體導入RPE細胞聯合AGEs誘導；PSF+AGEs組利用轉染試劑脂質體2000將1.5 μg pcDNA-PSF真核表達質粒導入RPE細胞聯合AGEs誘導。除N組以外，其余3組細胞進行相應的轉染處理，24 h后應用150 μg/ml的AGEs刺激72 h，經Western blot結果證實pcDNA-PSF真核表達質粒導入RPE細胞可成功高表達PSF蛋白，達到實驗要求之后進行后續實驗。
1.2 實驗方法
采用HE染色觀察PSF高表達對RPE細胞形態的影響[5]。將RPE細胞以2.5×105的密度爬片于24孔細胞培養板中預先放置的蓋玻片，待細胞匯合度約70%，依據實驗分組進行相應處理后，取出蓋玻片，置于另一個干凈24孔板中，細胞生長面向上，滴入4%多聚甲醛室溫10 min進行固定，使用破膜水進行破膜，常溫10 min，吸除后以清水沖洗2次后，將玻片取出浸泡于蘇木精染液中30～60 s左右（視蘇木精染液使用情況而調整），清水充分沖洗2次后，將玻片浸泡于1%醋酸中2～3 s，清水沖洗2次后，將玻片浸泡于0.5%氨水中2～3 s，清水沖洗2次后，將玻片浸泡于伊紅染液中30～60 s（視伊紅染液使用情況而調整），過水后，按照酒精梯度流程，每缸30 s，確保充分脫水，最終將玻片浸泡于二甲苯中1 min，取出晾干后將細胞生長面粘附于玻片上固定后，于熒光顯微鏡下進行觀察。
采用Hoechst 33258染色觀察PSF高表達對RPE細胞凋亡的影響。接種RPE細胞于200 μl培養體系的96孔細胞板中，待細胞匯合度約70%，轉染24 h，AGEs誘導72 h后棄培養液，PBS漂洗3次，每次1 min，加入4%多聚甲醛50 μl進行固定10 min后，PBS漂洗3次，每次5 min，每孔加入Hoechst 33258染液（0.5 μg/ml）30 μl，染色15 min后，吸去染液，PBS洗3次，每次5 min，熒光顯微鏡下觀察、拍照。
DCFH-DA法檢測PSF高表達對AGEs誘導的RPE細胞ROS表達的影響。接種RPE細胞于200 μl培養體系的96孔細胞板中，轉染24 h后棄去培養液，給予AGEs處理72 h，PBS洗1次，加入30 μl終濃度為5 μmol/L DCFH-DA避光孵育30 min。DCFH-DA孵育結束后，使用PBS清洗2次，置于熒光顯微鏡下拍照并經酶聯免疫檢測儀在488 nm波長下測定各孔細胞吸光度[A，舊稱光密度（OD）]值。以A值反映各組細胞的ROS產量，每組設3個副孔，實驗重復3次。
采用MTT比色法檢測PSF高表達對RPE細胞生存力的影響[6]。接種RPE細胞于200 μl培養體系的96孔細胞板中，待細胞匯合度約70%。將細胞分為正常組[AGEs-PSF-原卟啉鋅（ZnPP）-]、AGEs處理組（AGEs+PSF-ZnPP-）、PSF高表達組（AGEs+PSF+ZnPP-）及ZnPP處理組（AGEs+PSF+ZnPP+）。按照實驗分組進行相應轉染，孵育24 h后，10 μmol/L的ZnPP處理2 h，150 μg/ml AGEs誘導72 h后每孔加入150 μl DMSO，經酶聯免疫檢測儀在490 nm波長下測定各孔細胞A值。每組設定3個副孔，實驗共重復進行3次。
采用Western blot檢測PSF高表達對血紅素氧合酶1（HO-1）表達的影響[7]。按6×105個/孔接種細胞于1 ml培養體系的6孔細胞培養板中，待細胞匯合度約70%，一組細胞轉染等量的PSF真核表達質粒，轉染24 h后，棄去培養液，給予AGEs處理并分別于0、24、48、72 h收集各組全細胞提取物；另一組細胞分別轉染遞增量的PSF真核表達質粒，質量梯度為0.0、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 μg，轉染24 h后，棄去培養液，給予AGEs處理72 h后收集各組全細胞提取物，測定蛋白濃度，經SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白復合物，將蛋白復合物轉至PVDF膜。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜，1倍TBST洗膜3次，10 min/次；HRP標記的二抗繼續孵育1 h，1倍TBST洗膜3次，10 min/次；最后加入ECL曝光底物，進行曝光并拍照，以GAPDH為內參照檢測各組細胞中HO-1的不同表達水平并通過圖像分析軟件ImageJ進行定量灰度分析。
1.3 統計學方法
采用SPSS18.0軟件行統計學分析，實驗數據以均數±標準差（
±s）表示。組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
光學顯微鏡觀察發現，N組細胞形態飽滿，細胞質豐富，染色均一；N+AGEs組、Vec+AGEs組細胞體積縮小，細胞質致密濃縮、嗜酸性染色增強；PSF+AGEs組細胞形態尚飽滿，細胞質染色較均勻，偶見體積縮小（圖1）。
圖1
各組細胞光學顯微鏡像。1A~1D分別示N組、N+AGEs組、Vec+ AGEs組、PSF+ AGEs組。N組細胞形態飽滿，細胞核呈圓形；N+AGEs組、Vec+AGEs組細胞體積縮小，細胞質致密濃縮、嗜酸性染色增強（黑箭頭）；PSF+AGEs組細胞形態尚飽滿，細胞質染色較均勻，偶見體積縮小（黑箭頭） HE 標尺：100 μm
熒光顯微鏡觀察發現，N組細胞核呈圓形，染色均一；N+AGEs組、Vec+AGEs組細胞核致密濃染，皺縮變小，或呈碎塊狀；PSF+AGEs組部分細胞核邊集呈新月狀，且其細胞核碎裂減少（圖2）。
圖2
各組細胞熒光顯微鏡像。2A~2D分別示N組、N+AGEs組、Vec+ AGEs組、PSF+ AGEs組。N組細胞核染色均一，形態完整；N+AGEs組、Vec+AGEs組細胞核濃縮固縮、碎裂，熒光增強（白箭頭）；PSF+AGEs組部分細胞核邊集呈新月狀，且細胞核碎裂減少（白箭頭）Hoechst 33258 標尺：100 μm
熒光顯微鏡觀察發現，N組細胞核染色均一，形態完整；N+AGEs組、Vec+AGEs組細胞核濃縮固縮、碎裂，熒光增強；PSF+AGEs組部分細胞核邊集呈新月狀，且細胞核碎裂減少（圖3）。DCFH-DA法檢測結果顯示，N+AGEs組、Vec+AGEs組、PSF+AGEs組細胞中ROS產量分別為8605.22±576.14、8827.44±892.62、3486.11±552.31。4組細胞中ROS產量比較，差異有統計學意義（F=11.94，P＜0.05）。與N+AGEs組、Vec+AGEs組比較，PSF+AGEs組細胞中ROS產量下降，差異有統計學意義（P=0.000、0.000）（圖4）。
圖3
各組細胞熒光顯微鏡像。3A~3D分別示N組、N+AGEs組、Vec+ AGEs組、PSF+ AGEs組。N組細胞核染色均一，形態完整；N+AGEs組、Vec+AGEs組細胞核濃縮固縮、碎裂，熒光增強（白箭頭）；PSF+AGEs組部分細胞核邊集呈新月狀，熒光減弱，且細胞核碎裂減少 DCFH-DA 標尺：100 μm
圖4
各組細胞中ROS產量比較。*P＜0.05
MTT比色法檢測結果顯示，正常組、AGEs處理組、PSF高表達組及ZnPP處理組細胞生存力分別為1.04±0.10、0.63±0.09、0.94±0.10、0.67±0.11。4組間比較，差異有統計學意義（F=33.26，P=0.000）（圖5）。
圖5
各組細胞生存力比較。*P＜0.05
Western blot檢測結果顯示，PSF蛋白以時間依賴性的方式上調HO-1的表達水平。在PSF蛋白作用0、24、48、72 h，HO-1相對表達水平依次為0.37±0.01、0.84±0.06、0.96±0.05、1.00±0.02。不同PSF蛋白作用時間的HO-1相對表達水平比較，差異有統計學意義（F=164.91，P＜0.05）。PSF蛋白作用24、48、72 h的HO-1相對表達水平較0 h明顯升高，差異有統計學意義（P=0.000、0.000、0.000）（圖6）。
圖6
不同PSF蛋白作用時間HO-1相對表達水平比較。*P＜0.05
Western blot檢測結果顯示，PSF蛋白以劑量依賴性的方式上調HO-1的表達水平。0.0、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 μg PSF蛋白作用下，HO-1相對表達水平依次為0.62±0.01、0.90±0.01、1.03±0.03、1.07±0.04、1.16±0.04、1.10±0.04。不同劑量PSF蛋白作用的HO-1相對表達水平比較，差異有統計學意義（F=104.82，P＜0.05）。0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 μg PSF蛋白作用下的HO-1相對表達水平較0.0 μg明顯升高，差異有統計學意義（P=0.000、0.000、0.000、0.000、0.000）（圖7）。
圖7
不同劑量PSF蛋白作用下HO-1相對表達水平比較。*P＜0.05
3 討論
AGEs堆積是DR的主要致病因素，沉積在組織細胞上的AGEs能刺激其受體表達增加，兩者結合相互作用增加細胞內氧化應激水平，引起一系列組織病理學改變[4, 8-11]。鑒于此，本研究選用AGEs作為誘導劑處理RPE細胞，以期在一定程度上模擬糖尿病患者眼部的微環境特征[12-14]。
RPE細胞的異常病理變化在多種視網膜疾病的發生發展過程中發揮重要作用[15]。用AGEs處理過的培養基來培養人RPE細胞，可導致AGEs受體（RAGE）的蛋白和mRNA表達增加。不僅如此，上調RAGE信使核糖核酸的表達，可促進周細胞內ROS的形成，從而加劇AGEs對視網膜的破壞作用。因此，保護RPE細胞免受AGEs損傷或可成為延緩和治療DR的一條重要途徑。
PSF是由707個氨基酸殘基組成，相對分子質量為76×103的多功能蛋白，可在多種信號通路中發揮轉錄抑制因子的作用。其不僅可參與基因轉錄調控、DNA損傷修復、pre-mRNA剪接加工，而且是視網膜新生血管形成及視神經再生中重要的調控因子[2, 16-17]，因此近年來PSF成為眼科學研究領域的又一新型熱點蛋白。我們的前期研究結果顯示，PSF可以抑制氧誘導視網膜病變小鼠視網膜新生血管形成，下調VEGF表達，從而抑制新生血管增生[18]。在此基礎之上進一步明確了胰島素生長因子-1刺激后PSF可通過調控體外培養的RPE細胞磷酸酰肌醇3激酶/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶信號通路的活化程度來影響VEGF的表達[18-19]。
基于此，本研究將PSF引入人RPE細胞模型中，并利用AGEs作為誘導劑刺激RPE細胞，目的在于觀察PSF高表達對AGEs作用下RPE細胞的保護作用。我們首先選擇的是比較直觀的HE染色及Hoechst 33258染色去觀察AGEs刺激狀態下RPE細胞的形態學改變以及PSF高表達對其產生的影響，結果顯示正常培養的RPE細胞形態飽滿，細胞質染色均一，細胞核淡染；而AGEs刺激可誘導細胞出現體積變小，細胞質濃縮，細胞核致密濃染甚至碎裂等一系列凋亡相關形態學改變；相比之下，PSF高表達組細胞形態尚飽滿，細胞質相對豐富，細胞核形態比較穩定。除此之外，我們還發現，PSF可以顯著下調AGEs誘導的RPE細胞內ROS的表達水平。ROS過量會打破機體正常氧化/還原動態平衡，造成生物大分子如蛋白質、脂質、核酸等的氧化損傷[20-24]。不僅如此，ROS還是重要的細胞內信使，可以活化許多信號傳導通路，如蛋白激酶C途徑、絲裂原激活的蛋白激酶/MAP激酶途徑，這些途徑的異常活化均與糖尿病大血管并發癥的發生發展密切相關[25-28]。據此推測PSF可能通過減少ROS的積聚，幫助穩定體內氧化與抗氧化的動態平衡，從而有效緩解細胞的氧化應激損傷。
為初步探討PSF蛋白的作用機制，我們在實驗體系中引入HO-1的特異性抑制劑ZnPP。MTT量化分析發現，ZnPP可有效拮抗PSF蛋白對細胞的保護作用，下調細胞的生存力。該結果提示PSF蛋白在一定程度上是通過調控HO-1的表達來發揮對細胞的保護作用。在此基礎之上，我們進一步觀察到PSF蛋白不僅可以上調HO-1的表達，而且PSF蛋白對HO-1的表達調控還具有時間和劑量的依賴性，即伴隨PSF蛋白的作用時間延長以及作用濃度增加，PSF蛋白對HO-1的上調作用顯著提高。HO-1是機體抗氧化系統的重要組成部分，作為NF-E2相關因子2的下游基因，其具有抗炎、抗氧化及抗細胞凋亡等作用[29]。由此可見，PSF蛋白通過促進HO-1的表達，可有效拮抗AGEs誘導細胞氧化損傷和炎癥反應。
本研究結果表明，PSF通過緩解氧化損傷來有效保護AGEs誘導的RPE細胞損傷，其有望成為DR防治的潛在干預靶點。即利用生物學手段，特異性的上調細胞中PSF的表達水平，內源性提高RPE細胞的抗氧化能力，進而抑制或延緩DR的發生發展。
慢性高血糖所致的糖基化終末產物（AGEs）在視網膜血管中的過度蓄積與糖尿病視網膜病變（DR）發生發展密切相關，其可以促進VEGF表達，增加氧化應激作用，促進視網膜毛細血管內皮細胞和周細胞凋亡等[1]。有研究發現，AGEs能降低溶酶體酶的降解能力，促進脂褐素沉積，造成RPE細胞損傷。RPE細胞參與構成視網膜外屏障，具有屏障、濾過、吞噬和分泌等作用，在維持視網膜正常的生理功能方面發揮重要作用。因此，如何干預AGEs對RPE細胞的損傷已成為近年來研究熱點。聚嘧啶束結合蛋白相關剪接因子（PSF）是一種多功能蛋白，可參與基因轉錄調控、DNA損傷修復、pre-mRNA的剪接等[2-3]。我們的前期研究發現，PSF蛋白可以通過抑制H2O2誘導的氧化應激反應造成的ROS堆積，維持RPE細胞穩態平衡，緩解RPE細胞凋亡[4]。考慮到AGEs是細胞氧化應激反應的重要誘導因素之一，本研究將PSF蛋白引入經AGEs刺激體外培養的人RPE細胞模型中，從而觀察PSF蛋白對AGEs誘導的RPE細胞的影響，以期闡明三者之間的相互作用，為DR生物學治療開發潛在新的治療靶點提供理論依據。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 主要實驗材料及分組
人RPE細胞株（ARPE-19細胞，廣州吉妮歐生物科技有限公司）。增強型綠色熒光蛋白質粒（pEGFP）-PSF真核表達質粒由本實驗室自行構建。MTT（北京索萊寶科技有限公司），AGEs溶液、2’,7’-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）（美國Sigma公司），轉染試劑脂質體2000（美國Invitrogen公司），Hoechst 33258染色劑（上海翊圣生物科技有限公司），聚偏氟乙烯膜（PVDF）膜（美國Millipore公司），增強化學發光（ECL）曝光底物、Infinite M200 Pro多功能酶標儀（美國Tecan公司），Olympus BX51正置顯微鏡、Olympus IX53熒光倒置顯微鏡（日本Olympus公司）。
實驗分為正常對照組（N組）、空白對照組（N+AGEs組）、空載體對照組（Vec+AGEs組）、PSF高表達組（PSF+AGEs組）進行。N組RPE細胞常規培養；N+AGEs組只做轉染處理但不導入任何外源性基因的RPE細胞聯合AGEs誘導；Vec+AGEs組利用轉染試劑脂質體2000將1.5 μg pcDNA空載體導入RPE細胞聯合AGEs誘導；PSF+AGEs組利用轉染試劑脂質體2000將1.5 μg pcDNA-PSF真核表達質粒導入RPE細胞聯合AGEs誘導。除N組以外，其余3組細胞進行相應的轉染處理，24 h后應用150 μg/ml的AGEs刺激72 h，經Western blot結果證實pcDNA-PSF真核表達質粒導入RPE細胞可成功高表達PSF蛋白，達到實驗要求之后進行后續實驗。
1.2 實驗方法
采用HE染色觀察PSF高表達對RPE細胞形態的影響[5]。將RPE細胞以2.5×105的密度爬片于24孔細胞培養板中預先放置的蓋玻片，待細胞匯合度約70%，依據實驗分組進行相應處理后，取出蓋玻片，置于另一個干凈24孔板中，細胞生長面向上，滴入4%多聚甲醛室溫10 min進行固定，使用破膜水進行破膜，常溫10 min，吸除后以清水沖洗2次后，將玻片取出浸泡于蘇木精染液中30～60 s左右（視蘇木精染液使用情況而調整），清水充分沖洗2次后，將玻片浸泡于1%醋酸中2～3 s，清水沖洗2次后，將玻片浸泡于0.5%氨水中2～3 s，清水沖洗2次后，將玻片浸泡于伊紅染液中30～60 s（視伊紅染液使用情況而調整），過水后，按照酒精梯度流程，每缸30 s，確保充分脫水，最終將玻片浸泡于二甲苯中1 min，取出晾干后將細胞生長面粘附于玻片上固定后，于熒光顯微鏡下進行觀察。
采用Hoechst 33258染色觀察PSF高表達對RPE細胞凋亡的影響。接種RPE細胞于200 μl培養體系的96孔細胞板中，待細胞匯合度約70%，轉染24 h，AGEs誘導72 h后棄培養液，PBS漂洗3次，每次1 min，加入4%多聚甲醛50 μl進行固定10 min后，PBS漂洗3次，每次5 min，每孔加入Hoechst 33258染液（0.5 μg/ml）30 μl，染色15 min后，吸去染液，PBS洗3次，每次5 min，熒光顯微鏡下觀察、拍照。
DCFH-DA法檢測PSF高表達對AGEs誘導的RPE細胞ROS表達的影響。接種RPE細胞于200 μl培養體系的96孔細胞板中，轉染24 h后棄去培養液，給予AGEs處理72 h，PBS洗1次，加入30 μl終濃度為5 μmol/L DCFH-DA避光孵育30 min。DCFH-DA孵育結束后，使用PBS清洗2次，置于熒光顯微鏡下拍照并經酶聯免疫檢測儀在488 nm波長下測定各孔細胞吸光度[A，舊稱光密度（OD）]值。以A值反映各組細胞的ROS產量，每組設3個副孔，實驗重復3次。
采用MTT比色法檢測PSF高表達對RPE細胞生存力的影響[6]。接種RPE細胞于200 μl培養體系的96孔細胞板中，待細胞匯合度約70%。將細胞分為正常組[AGEs-PSF-原卟啉鋅（ZnPP）-]、AGEs處理組（AGEs+PSF-ZnPP-）、PSF高表達組（AGEs+PSF+ZnPP-）及ZnPP處理組（AGEs+PSF+ZnPP+）。按照實驗分組進行相應轉染，孵育24 h后，10 μmol/L的ZnPP處理2 h，150 μg/ml AGEs誘導72 h后每孔加入150 μl DMSO，經酶聯免疫檢測儀在490 nm波長下測定各孔細胞A值。每組設定3個副孔，實驗共重復進行3次。
采用Western blot檢測PSF高表達對血紅素氧合酶1（HO-1）表達的影響[7]。按6×105個/孔接種細胞于1 ml培養體系的6孔細胞培養板中，待細胞匯合度約70%，一組細胞轉染等量的PSF真核表達質粒，轉染24 h后，棄去培養液，給予AGEs處理并分別于0、24、48、72 h收集各組全細胞提取物；另一組細胞分別轉染遞增量的PSF真核表達質粒，質量梯度為0.0、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 μg，轉染24 h后，棄去培養液，給予AGEs處理72 h后收集各組全細胞提取物，測定蛋白濃度，經SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白復合物，將蛋白復合物轉至PVDF膜。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜，1倍TBST洗膜3次，10 min/次；HRP標記的二抗繼續孵育1 h，1倍TBST洗膜3次，10 min/次；最后加入ECL曝光底物，進行曝光并拍照，以GAPDH為內參照檢測各組細胞中HO-1的不同表達水平并通過圖像分析軟件ImageJ進行定量灰度分析。
1.3 統計學方法
采用SPSS18.0軟件行統計學分析，實驗數據以均數±標準差（±s）表示。組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
光學顯微鏡觀察發現，N組細胞形態飽滿，細胞質豐富，染色均一；N+AGEs組、Vec+AGEs組細胞體積縮小，細胞質致密濃縮、嗜酸性染色增強；PSF+AGEs組細胞形態尚飽滿，細胞質染色較均勻，偶見體積縮小（圖1）。
圖1
各組細胞光學顯微鏡像。1A~1D分別示N組、N+AGEs組、Vec+ AGEs組、PSF+ AGEs組。N組細胞形態飽滿，細胞核呈圓形；N+AGEs組、Vec+AGEs組細胞體積縮小，細胞質致密濃縮、嗜酸性染色增強（黑箭頭）；PSF+AGEs組細胞形態尚飽滿，細胞質染色較均勻，偶見體積縮小（黑箭頭） HE 標尺：100 μm
熒光顯微鏡觀察發現，N組細胞核呈圓形，染色均一；N+AGEs組、Vec+AGEs組細胞核致密濃染，皺縮變小，或呈碎塊狀；PSF+AGEs組部分細胞核邊集呈新月狀，且其細胞核碎裂減少（圖2）。
圖2
各組細胞熒光顯微鏡像。2A~2D分別示N組、N+AGEs組、Vec+ AGEs組、PSF+ AGEs組。N組細胞核染色均一，形態完整；N+AGEs組、Vec+AGEs組細胞核濃縮固縮、碎裂，熒光增強（白箭頭）；PSF+AGEs組部分細胞核邊集呈新月狀，且細胞核碎裂減少（白箭頭）Hoechst 33258 標尺：100 μm
熒光顯微鏡觀察發現，N組細胞核染色均一，形態完整；N+AGEs組、Vec+AGEs組細胞核濃縮固縮、碎裂，熒光增強；PSF+AGEs組部分細胞核邊集呈新月狀，且細胞核碎裂減少（圖3）。DCFH-DA法檢測結果顯示，N+AGEs組、Vec+AGEs組、PSF+AGEs組細胞中ROS產量分別為8605.22±576.14、8827.44±892.62、3486.11±552.31。4組細胞中ROS產量比較，差異有統計學意義（F=11.94，P＜0.05）。與N+AGEs組、Vec+AGEs組比較，PSF+AGEs組細胞中ROS產量下降，差異有統計學意義（P=0.000、0.000）（圖4）。
圖3
各組細胞熒光顯微鏡像。3A~3D分別示N組、N+AGEs組、Vec+ AGEs組、PSF+ AGEs組。N組細胞核染色均一，形態完整；N+AGEs組、Vec+AGEs組細胞核濃縮固縮、碎裂，熒光增強（白箭頭）；PSF+AGEs組部分細胞核邊集呈新月狀，熒光減弱，且細胞核碎裂減少 DCFH-DA 標尺：100 μm
圖4
各組細胞中ROS產量比較。*P＜0.05
MTT比色法檢測結果顯示，正常組、AGEs處理組、PSF高表達組及ZnPP處理組細胞生存力分別為1.04±0.10、0.63±0.09、0.94±0.10、0.67±0.11。4組間比較，差異有統計學意義（F=33.26，P=0.000）（圖5）。
圖5
各組細胞生存力比較。*P＜0.05
Western blot檢測結果顯示，PSF蛋白以時間依賴性的方式上調HO-1的表達水平。在PSF蛋白作用0、24、48、72 h，HO-1相對表達水平依次為0.37±0.01、0.84±0.06、0.96±0.05、1.00±0.02。不同PSF蛋白作用時間的HO-1相對表達水平比較，差異有統計學意義（F=164.91，P＜0.05）。PSF蛋白作用24、48、72 h的HO-1相對表達水平較0 h明顯升高，差異有統計學意義（P=0.000、0.000、0.000）（圖6）。
圖6
不同PSF蛋白作用時間HO-1相對表達水平比較。*P＜0.05
Western blot檢測結果顯示，PSF蛋白以劑量依賴性的方式上調HO-1的表達水平。0.0、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 μg PSF蛋白作用下，HO-1相對表達水平依次為0.62±0.01、0.90±0.01、1.03±0.03、1.07±0.04、1.16±0.04、1.10±0.04。不同劑量PSF蛋白作用的HO-1相對表達水平比較，差異有統計學意義（F=104.82，P＜0.05）。0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 μg PSF蛋白作用下的HO-1相對表達水平較0.0 μg明顯升高，差異有統計學意義（P=0.000、0.000、0.000、0.000、0.000）（圖7）。
圖7
不同劑量PSF蛋白作用下HO-1相對表達水平比較。*P＜0.05
3 討論
AGEs堆積是DR的主要致病因素，沉積在組織細胞上的AGEs能刺激其受體表達增加，兩者結合相互作用增加細胞內氧化應激水平，引起一系列組織病理學改變[4, 8-11]。鑒于此，本研究選用AGEs作為誘導劑處理RPE細胞，以期在一定程度上模擬糖尿病患者眼部的微環境特征[12-14]。
RPE細胞的異常病理變化在多種視網膜疾病的發生發展過程中發揮重要作用[15]。用AGEs處理過的培養基來培養人RPE細胞，可導致AGEs受體（RAGE）的蛋白和mRNA表達增加。不僅如此，上調RAGE信使核糖核酸的表達，可促進周細胞內ROS的形成，從而加劇AGEs對視網膜的破壞作用。因此，保護RPE細胞免受AGEs損傷或可成為延緩和治療DR的一條重要途徑。
PSF是由707個氨基酸殘基組成，相對分子質量為76×103的多功能蛋白，可在多種信號通路中發揮轉錄抑制因子的作用。其不僅可參與基因轉錄調控、DNA損傷修復、pre-mRNA剪接加工，而且是視網膜新生血管形成及視神經再生中重要的調控因子[2, 16-17]，因此近年來PSF成為眼科學研究領域的又一新型熱點蛋白。我們的前期研究結果顯示，PSF可以抑制氧誘導視網膜病變小鼠視網膜新生血管形成，下調VEGF表達，從而抑制新生血管增生[18]。在此基礎之上進一步明確了胰島素生長因子-1刺激后PSF可通過調控體外培養的RPE細胞磷酸酰肌醇3激酶/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶信號通路的活化程度來影響VEGF的表達[18-19]。
基于此，本研究將PSF引入人RPE細胞模型中，并利用AGEs作為誘導劑刺激RPE細胞，目的在于觀察PSF高表達對AGEs作用下RPE細胞的保護作用。我們首先選擇的是比較直觀的HE染色及Hoechst 33258染色去觀察AGEs刺激狀態下RPE細胞的形態學改變以及PSF高表達對其產生的影響，結果顯示正常培養的RPE細胞形態飽滿，細胞質染色均一，細胞核淡染；而AGEs刺激可誘導細胞出現體積變小，細胞質濃縮，細胞核致密濃染甚至碎裂等一系列凋亡相關形態學改變；相比之下，PSF高表達組細胞形態尚飽滿，細胞質相對豐富，細胞核形態比較穩定。除此之外，我們還發現，PSF可以顯著下調AGEs誘導的RPE細胞內ROS的表達水平。ROS過量會打破機體正常氧化/還原動態平衡，造成生物大分子如蛋白質、脂質、核酸等的氧化損傷[20-24]。不僅如此，ROS還是重要的細胞內信使，可以活化許多信號傳導通路，如蛋白激酶C途徑、絲裂原激活的蛋白激酶/MAP激酶途徑，這些途徑的異常活化均與糖尿病大血管并發癥的發生發展密切相關[25-28]。據此推測PSF可能通過減少ROS的積聚，幫助穩定體內氧化與抗氧化的動態平衡，從而有效緩解細胞的氧化應激損傷。
為初步探討PSF蛋白的作用機制，我們在實驗體系中引入HO-1的特異性抑制劑ZnPP。MTT量化分析發現，ZnPP可有效拮抗PSF蛋白對細胞的保護作用，下調細胞的生存力。該結果提示PSF蛋白在一定程度上是通過調控HO-1的表達來發揮對細胞的保護作用。在此基礎之上，我們進一步觀察到PSF蛋白不僅可以上調HO-1的表達，而且PSF蛋白對HO-1的表達調控還具有時間和劑量的依賴性，即伴隨PSF蛋白的作用時間延長以及作用濃度增加，PSF蛋白對HO-1的上調作用顯著提高。HO-1是機體抗氧化系統的重要組成部分，作為NF-E2相關因子2的下游基因，其具有抗炎、抗氧化及抗細胞凋亡等作用[29]。由此可見，PSF蛋白通過促進HO-1的表達，可有效拮抗AGEs誘導細胞氧化損傷和炎癥反應。
本研究結果表明，PSF通過緩解氧化損傷來有效保護AGEs誘導的RPE細胞損傷，其有望成為DR防治的潛在干預靶點。即利用生物學手段，特異性的上調細胞中PSF的表達水平，內源性提高RPE細胞的抗氧化能力，進而抑制或延緩DR的發生發展。
