摘要: 目的 在大鼠心肌梗死部位植入微囊化重組中華倉鼠卵巢(chinese hamster ovary, CHO ) 細胞, 觀察其分泌的血管內皮細胞生長因子(V EGF) 是否可以促進心肌梗死部位的血管新生, 改善心功能。 方法 通過質粒轉染的方法構建可以分泌V EGF 的重組CHO 細胞系, 用微囊包裹, 觀察微囊內細胞的生長及分泌情況。制備大鼠心肌梗死模型, 隨機將48 只8 周齡SD 雄性大鼠分成微囊化細胞移植組(MC2CHO 組)、單純細胞移植組(CHO 組)、空微囊移植組(MC 組) 和無血清培養基移植組(對照組) , 每組12 只。移植3 周后檢測心功能改善情況, 病理切片觀察微囊結構及囊內細胞存活情況, 注射部位微血管計數比較促血管新生效果。 結果 體外檢測可見重組CHO 細胞在微囊生長迅速, 第8 d 時培養上清中V EGF 達3 852 pgouml;m l; 移植3 周后MC2CHO 組左心室大小和心功能明顯好于其它3 組, 差異有統計學意義(P lt; 0. 05) ; 局部微血管密度MC2CHO 組較CHO 組、MC 組和對照組明顯增加(22. 3±3. 1 vs. 15. 6±2.8, 11. 4±2. 5 和13. 2±2. 7 個ouml;每高倍視野, P lt; 0. 05) ; 組織學檢查可見微囊結構完整, 內有存活且具有分泌功能的CHO 細胞。 結論 微囊化重組CHO 細胞移植可促進大鼠心肌梗死后血管新生, 改善心功能。
目的 胰島的純度和活性對胰島移植治療糖尿病的療效有很大影響。探討一種大鼠胰島分離純化的新方法，以獲得高純度、高產量、活性好的胰島。 方法 選取健康成年雄性SD 大鼠10 只，體重250 ～ 300 g，逆行膽總管灌注Ⅴ型膠原酶溶液，38℃水浴消化約15 min 后，采用兩種方法純化胰島細胞：A 組采用Ficoll 400 不連續密度梯度液，B 組采用Ficoll-Paque? PLUS 溶液。行雙硫腙（dithizone，DTZ）染色鑒定胰島并計算胰島當量（islet equivalent quantity，IEQ）、胰島純度，錐蟲藍染色檢測胰島活性。取B 組胰島用海藻酸鈉- 聚左賴氨酸- 海藻酸鈉（alginate/poly-Llysine/ alginate，APA）包裹制備胰島微囊，體外靜止葡萄糖刺激胰島素釋放實驗檢測微囊化和未微囊化胰島的生物學活性。 結果 DTZ 染色示胰島呈猩紅色，有圓形、橢圓形和不規則形，胰島邊緣清晰，大部分直徑為50 ～ 300 μm。A、B組IEQ 值分別為338.04 ± 76.61 和834.80 ± 54.00，比較差異有統計學意義（P lt; 0.05）。A、B 組胰島純度分別為88.31% ± 2.67% 和95.63% ± 1.96%，差異無統計學意義（P gt; 0.05）。A、B 組胰島活率分別為67.40% ± 5.15% 和86.05% ± 2.52%，差異有統計學意義（P lt; 0.05）。胰島APA 微囊囊形呈完整圓形，大小均勻，微囊直徑為1.5 ～ 2.0 mm，每個微囊中包裹1 ～ 3 個胰島。葡萄糖刺激釋放胰島素實驗顯示，未微囊化胰島和微囊化胰島在低糖下的胰島素分泌濃度分別為（5.53 ±1.64） ng/ mL 和（4.76 ± 0.26）ng/mL，高糖下分別為（11.95 ± 2.07）ng/mL 和（14.34 ± 3.18）ng/mL，高糖刺激下胰島素釋放量為低糖刺激的2 倍多，差異有統計學意義（P lt; 0.05）；兩組的刺激指數分別為2.16 ± 0.30 和3.01 ± 0.59，差異無統計學意義（P gt; 0.05）。 結論 Ficoll-Paque? PLUS 溶液作為純化液分離純化胰島的方法具有操作簡便、胰島產量高、純度高等優點，獲得的胰島經微囊化或未微囊化體外培養均有良好活性。
目的 對微膠囊技術及其在骨科疾病方面的應用進行綜述。 方法 廣泛查閱近年相關文獻，介紹微膠囊技術的基礎知識及其在骨科疾病上的應用。 結果 較全面地對微膠囊技術的材料、制備方法、性能評價、緩釋性能、免疫隔離和可包裹的細胞系進行了回顧，分析了其作為骨科藥物和轉基因細胞的載體，用于促進骨愈合，基因治療骨腫瘤、骨感染和骨軟骨再生的作用。 結論 微膠囊可以作為骨科藥物和轉基因細胞的載體，治療骨科相關疾病。
目的 探討微囊化神經生長因子（nerve growth factor，NGF）基因修飾的NIH3T3細胞復合組織工程真皮的可行性及其對急性創面愈合的影響。 方法 構建分泌型NGF真核表達質粒pcDNA3.1＋/NGF并導入NIH3T3細胞，篩選出穩定表達的細胞株，將此細胞包入海藻酸鈉多聚賴氨酸海藻酸鈉微囊中培養。以Ⅰ、Ⅲ型膠原為基質、人成纖維細胞和制備好的微囊為種子細胞，用組織工程皮膚培養系統構建復合微囊的組織工程真皮，體外培養1周后行羥脯氨酸（hydroxyproline，Hyp）測定，ELISA法測定其分泌功能，組織形態學觀察。以豬背部急性全層創面為模型，按移植物不同分為5組：NGF- NIH3T3微囊真皮組(A組)、NIH3T3微囊真皮組(B組)、空囊真皮組(C組)、NGF（5 ng/ml）＋膠原膜組(D組)和空白對照組(E組)，觀察創面再上皮化及愈合速度和愈合時間。 結果 轉NGF基因微囊復合組織工程真皮后體外培養6周，仍穩定分泌NGF（124.32 pg/ml），體外培養1周后，組織工程真皮中NGF-NIH3T3微囊組Hyp含量為69.68±6.20 mg/g，較空白對照組增加約2倍以上。移植治療急性創面，A組平均愈合時間為25±2 d，B組為34±3 d，C組為34±2 d，D組為33±2 d，E組為40±3 d，A組創面愈合時間平均至少縮短約10 d，提高了創面愈合的速度。 結論 將分泌NGF微囊復合組織工程真皮后可提高組織工程真皮的質量，并促進急性創面的愈合。
目的 建立能穩定分泌人內皮抑素(hES)的基因工程細胞系，觀察內皮抑素（ES）蛋白和hES的表達。方法 以hES重組質粒pcDNA3.0（pcDNA3-Endo）為模板，通過逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)擴增獲得hES基因片段，且在基因前加信號肽序列，將其定向插入真核表達載體綠色熒光蛋白（pEGFP-N1)）質粒中，獲得重組質粒pEGFP-N1-ES；利用陽離子脂質體介導將其轉染到人胚胎腎細胞(HeK-293)細胞中, G418 篩選后得到陽性克隆hES/293，采用蛋白免疫印跡(Western blot)法檢測轉染細胞上清中ES蛋白的表達；用海澡酸鈉殼聚糖(ACA)微囊包裹hES/293細胞，分別收集培養3、7、21、35 d的ACA微囊化hES/293細胞的培養上清液，Western blot法檢測包裹后培養液上清中hES的表達。結果 重組質粒pEGFP-N1-ES經限制性核對內切酶HindⅢ和限制性核酸內切酶BamHⅠ雙酶切得到4700堿基對(bp)和600 bp 2條帶；PCR擴增出600 bp條帶；測序結果與NCBI上序列比對軟件（BLAST）比對，同源性達到100%。pEGFP-N1-ES轉染HeK-293細胞，經G418 篩選后獲得陽性克隆，選取篩選的10株單克隆細胞培養上清液進行Western blot分析，在相對分子質量為20times;103 處出現蛋白條帶。在ACA微囊內hES/293細胞隨著培養時間的延長，細胞團逐漸長大，充滿整個囊內空間。培養3、7、21、35 d時，在相對分子質量為20times;103處出現蛋白條帶。結論 重組pEGFP-N1-ES真核表達載體構建正確，轉染HeK-293細胞后可有效的表達hES蛋白，并能分泌到細胞外；微囊化hES/293細胞產生的ES蛋白可以自由擴散出微囊膜外，并呈持續性表達。
本研究探討海藻酸鈉-多聚鳥氨酸-海藻酸(A-PLO-A)和海藻酸鋇-多聚鳥氨酸-海藻酸(B-PLO-A)兩種新型微囊作為細胞移植載體的效果。兩種微囊包裹小鼠肝細胞后,植入D-氨基半乳糖腹腔注射法制備的急性肝衰竭模型大鼠體內,觀察大鼠死亡率,檢測微囊內肝細胞的生長、增殖、代謝的情況,以及能否有效改善肝衰大鼠的肝功能。實驗分為A-PLO-A空微囊、B-PLO-A空微囊、移植游離的肝細胞、A-PLO-A微囊化肝細胞、B-PLO-A微囊化肝細胞五組。研究結果表明,單純的空微囊對肝衰大鼠病情無緩解作用,移植后兩個空囊移植組3 d死亡率均達到了100%。游離肝細胞組、A-PLO-A微囊化肝細胞組和B-PLO-A微囊化肝細胞組大鼠的ALT、AST、ALB水平均有所恢復,4周時微囊移植組的上述指標均優于游離肝細胞組,說明微囊化肝細胞移植有效緩解了肝臟損傷的程度,治療效果好于游離肝細胞組。微囊化肝細胞組大鼠的存活率明顯高于空囊移植組和游離肝細胞移植組;4周后回收的微囊表面光滑,無細胞包裹,無纖維化。研究結果提示基于多聚鳥氨酸的海藻酸微囊物理穩定性和生物相容性良好,適合作為肝細胞體內移植的載體。
探討微囊微環境對HepG2細胞氧化應激基因表達影響及外源性抗氧化物質干預效果。采用靜電液滴法制備微囊化細胞,real-time PCR法檢測不同培養方式下血紅素加氧酶-1(HO-1)和谷胱甘肽轉硫酶-A1(GST-A1)表達;通過MTT法檢測細胞活性、ELISA法檢測白蛋白含量,比較還原型谷胱甘肽(GSH)和N-乙酰半胱氨酸(NAC)干預后指標變化。結果顯示,培養第6 d和第16 d時,微囊細胞中HO-1基因表達水平分別為同天數下平面細胞的4.9倍和3.1倍,GST-A1表達分別為平面細胞的11.2倍和33倍(P＜0.05);添加5~10 mmol/L NAC后,微囊化細胞活性較對照組增加40%~70%,白蛋白水平增加20%~30%(P＜0.05),而GSH在10 mmol/L時可使囊內細胞活性增加20%~55%,白蛋白水平增加15%(P＜0.05)。結果提示微囊內存在氧化應激因素誘導基因表達改變,NAC和GSH能緩解其對細胞的抑制作用。
微囊泡(MVs)是指從細胞表面脫落或分泌的小圓球形膜樣結構, 含有母細胞來源脂質、蛋白和遺傳物質。近年來, MVs作為細胞間信息傳遞的新途徑正逐漸引起學者們關注。干細胞來源MVs通過細胞內化作用可轉移生物活性物質進入靶細胞, 在組織損傷模型中可重編程損傷組織細胞表型, 促進組織再生和修復。其作用機制與MVs富含生物活性脂質、抗凋亡因子、生長因子或細胞因子, 轉移mRNA和調控miRNA到損傷組織細胞, 調控靶細胞功能有關。因此, 開發干細胞來源MVs應用于組織再生和修復治療, 可作為一種安全有效的無細胞治療策略。
目的探索細胞骨架解聚劑細胞松弛素D（Cyt D）和穩定劑Jasplakinolide（Jasp）通過改構細胞骨架結構對LPS作用后網格蛋白/微囊介導的血管內皮細胞鈣黏蛋白（VE-Cad）胞吞、膜VE-Cad表達和血管通透性的影響。 方法采用CRL-2922細胞進行實驗，各組均于組別對應的時點檢測（空白對照組任意時點皆可）。①將細胞分為空白對照組、LPS-1 h組及LPS-4 h組，觀察細胞骨架。②將細胞分為LPS-1 h組、Cyt D+LPS-1 h組、LPS-4 h組及Jasp+LPS-4 h組，檢測網格蛋白/Cav1與VE-Cad共沉淀和膜VE-Cad的表達水平。③將細胞分為空白對照組、LPS-1 h組、Cyt D+LPS-1 h組、LPS-4 h組及Jasp+LPS-4 h組，檢測單層細胞的累積熒光透過率。 結果①空白對照組中肌動蛋白呈均勻散在分布，細胞骨架無明顯的聚合；LPS-1 h組中細胞骨架發生明顯的聚合，張力絲形成；LPS-4 h組中細胞骨架解聚，張力絲消失。②與LPS-1 h組比較，Cyt D+LPS-1 h組中網格蛋白與VE-Cad的共沉淀水平較低（P<0.05），Cav1與VE-Cad的共沉淀水平較高（P<0.05），且膜VE-Cad的表達水平降低（P<0.05）；與LPS-4 h組比較，Jasp+LPS-4 h組中網格蛋白與VE-Cad的共沉淀水平的差異無統計學意義（P>0.05），Cav1與VE-Cad的共沉淀水平較低（P<0.05），且膜VE-Cad的表達水平升高（P<0.05）。③與空白對照組比較，LPS-1 h組和LPS-4 h組的累積熒光透過率均較高（P<0.05）；與LPS-1 h組比較，Cyt D+LPS-1 h組的累積熒光透過率較高（P<0.05）；與LPS-4 h組比較，Jasp+LPS-4 h組的累積熒光透過率較低（P<0.05）。 結論LPS作用后細胞骨架先發生聚合然后解聚，這種改構促使VE-Cad胞吞途徑從由網格蛋白介導轉化到由微囊介導。
目的觀察探討人臍帶間充質干細胞源性微囊泡（hUMSC-MV）對高糖誘導下大鼠視網膜神經節細胞（RGC）損傷的保護作用及機制。 方法體外培養Sprague-Dawley大鼠RGC；超速離心法分離提取并鑒定hUMSC-MV；觀察hUMSC-MV與RGC的內化作用。實驗分為正常RGC對照組（A組）、高糖對照組（B組）、正常共培養組（C組）、高糖共培養組（D組）進行。A組細胞正常培養，B組細胞為33 mmol/L葡萄糖培養，C組細胞為hUMSC-MV培養，D組細胞為33 mmol/L葡萄糖、hUMSC-MV共培養。采用細胞計數CCK-8試劑盒測定各組RGC活性；采用膜聯蛋白（Annexin）Ⅴ/碘化丙啶（PI）測量各組RGC凋亡率。采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（RT-PCR）及蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測各組RGC內B-細胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bax、半胱天冬蛋白酶（Caspase）-3 mRNA和蛋白的相對表達量。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。 結果超速離心法提取的hUMSC-MV形態為單個或成簇的圓形膜性囊泡樣結構，直徑約為100～1000 nm。hUMSC-MV表面高表達CD44、CD29、CD73、CD105，陰性表達CD49f、第二型人類白血球抗原、CD34、CD45。大鼠RGC與hUMSCs-MV良好內化。CCK-8及Annexin Ⅴ/PI雙染法檢測結果顯示，B組細胞活性低于A、C、D組（F=107.92，P=0.000），B組細胞凋亡率高于A、C、D組，差異均有統計學意義（F=382.11，P=0.000）。RT-PCR及Western blot檢測結果顯示，B、D組RGC內Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA表達（F=219.79、339.198、1 071.21，P=0.000、0.000、0.000）以及Bcl-2、Bax、裂解的Caspase-3、Caspase-3蛋白表達（F=544.28、295.79、533.18、224.75，P=0.000、0.000、0.000、0.000）均高于A、C組，差異有統計學意義。進一步兩兩比較，D組RGC內Bcl-2 mRNA和蛋白表達高于B組，差異有統計學意義（P＜0.05）；B組Bax、Caspase-3 mRNA和蛋白表達以及裂解的Caspase-3蛋白表達均高于D組，差異有統計學意義（P＜0.05）。 結論hUMSC-MV可通過降低高糖誘導下大鼠RGC內Bax、Caspase-3的表達及活化，增加Bcl-2表達發揮對RGC損傷的保護作用。