本研究探討海藻酸鈉-多聚鳥氨酸-海藻酸(A-PLO-A)和海藻酸鋇-多聚鳥氨酸-海藻酸(B-PLO-A)兩種新型微囊作為細胞移植載體的效果。兩種微囊包裹小鼠肝細胞后,植入D-氨基半乳糖腹腔注射法制備的急性肝衰竭模型大鼠體內,觀察大鼠死亡率,檢測微囊內肝細胞的生長、增殖、代謝的情況,以及能否有效改善肝衰大鼠的肝功能。實驗分為A-PLO-A空微囊、B-PLO-A空微囊、移植游離的肝細胞、A-PLO-A微囊化肝細胞、B-PLO-A微囊化肝細胞五組。研究結果表明,單純的空微囊對肝衰大鼠病情無緩解作用,移植后兩個空囊移植組3 d死亡率均達到了100%。游離肝細胞組、A-PLO-A微囊化肝細胞組和B-PLO-A微囊化肝細胞組大鼠的ALT、AST、ALB水平均有所恢復,4周時微囊移植組的上述指標均優于游離肝細胞組,說明微囊化肝細胞移植有效緩解了肝臟損傷的程度,治療效果好于游離肝細胞組。微囊化肝細胞組大鼠的存活率明顯高于空囊移植組和游離肝細胞移植組;4周后回收的微囊表面光滑,無細胞包裹,無纖維化。研究結果提示基于多聚鳥氨酸的海藻酸微囊物理穩定性和生物相容性良好,適合作為肝細胞體內移植的載體。
引用本文： 王健, 徐麗明, 湯京龍, 王碩, 王春仁. 基于多聚鳥氨酸的海藻酸微囊化肝細胞體內移植治療肝衰竭大鼠的研究. 生物醫學工程學雜志, 2014, 31(3): 642-647. doi: 10.7507/1001-5515.20140120 復制
引言
急性肝衰竭(acute liver failure,ALF)是一種嚴重危害人類健康的臨床常見疾病，ALF患者在短時間內即可出現肝細胞大量壞死，進而導致嚴重肝功能損傷，病情發展迅速，死亡率高，因此，尋找有效的ALF治療方法極為迫切。
肝組織工程研究在治療ALF方面較為有效的方案之一是微囊化肝細胞移植，微囊化技術可為外源肝細胞提供有效的免疫隔離保護，進而有利于肝細胞移植后的生存和生物學功能的發揮。早在20世紀80年代，Sun 等就將APA微囊包裹肝細胞移植治療大鼠肝衰竭，取得了預期效果[1]。近年來的微囊化肝細胞的技術與方法不斷改進，微囊材料對囊內肝細胞發揮了較明顯的免疫隔離作用，并且由于小分子營養物質可自由通過微囊，囊內肝細胞分泌的活性成分可以發揮功能，使得移植后肝衰動物的存活率明顯提高[2-4]。
微囊化細胞技術目前面臨的主要問題是如何提高微囊材料的物理穩定性和生物相容性，因此將各種新材料用于微囊制備的研究是近年來微囊研究領域的發展趨勢。本研究采用海藻酸鈉-多聚鳥氨酸-海藻酸(alginate-poly ornithine-alginate,A-PLO-A) 和海藻酸鋇-多聚鳥氨酸-海藻酸(barium alginate-poly ornithine-alginate,B-PLO-A)兩種新型微囊包裹小鼠原代肝細胞，植入急性肝衰竭大鼠體內，觀察大鼠存活率，檢測微囊內肝細胞的生長、增殖、代謝情況，檢測肝衰竭大鼠血液中谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸轉氨酶(aspartate aminotransferase，AST)和白蛋白(albumin，ALB)的濃度變化情況；此外，移植4周后回收微囊，觀察移植微囊化細胞的完整性并探討其生物相容性。
1 材料和方法
1.1 大鼠肝衰模型的建立
D-氨基半乳糖(D-galactosamine，D-gal)按1.2 g/kg 比例腹腔一次性給藥，用以誘導急性肝功能衰竭。模型的自然病程為2周，如給藥后存活超過2周者則可長期存活。D-gal誘發急性肝衰的原理是：其在肝內通過半乳糖途徑代謝，抑制核酸及糖蛋白等生物大分子的合成，誘導肝細胞凋亡、自由基產生和脂質過氧化反應等在內的多種機制綜合作用，可迅速造成大面積肝臟損傷。通常在注射后48 h內即可觀測到因大量肝細胞受損、死亡所釋放的各種肝細胞內容物。
1.2 小鼠原代肝細胞分離
斷頸處死C57BL/6小鼠。固定小鼠，噴灑75%酒精消毒后，腹壁正中切口打開腹腔。取出肝臟并將其放入裝有4 ℃含雙抗的D-Hanks 液中漂洗2次，之后在培養皿中用眼科剪將鼠肝組織剪成1 mm3左右的小塊，放入試管中，用吸管吹打，待組織沉淀后吸出上清,如此反復3次，最后一次清洗后，將試管放入離心機800 r/min離心4 min。離心后的試管取出棄上清，加入10倍肝組織體積的含0.2% Ⅳ型膠原酶的消化液，消化完全者可用吸管吹打散開，若消化不完全而吹打不開者，可繼續于37 ℃消化15 min。將肝細胞懸液取樣在光鏡下計數，用血細胞計數板計算肝細胞的產率，并用濃度為0.4%的臺盼藍拒染實驗檢測肝細胞的存活率。
1.3 微囊化肝細胞的制備
將新分離的肝細胞與2%的海藻酸鈉溶液混合，最終達到每毫升海藻酸鈉含肝細胞的數量為5×106個。用靜電微囊發生儀(NISCO VARV1，瑞典)將其分別噴入氯化鋇和氯化鈣溶液中，作用2 min，以形成海藻酸鋇(鈣)微球。吸出氯化鋇(鈣)溶液，用生理鹽水洗滌2次，再將微球分別與多聚鳥賴氨酸溶液/多聚賴氨酸反應數分鐘，形成B-PLO-A和A-PLO-A微球，再使用生理鹽水洗滌2次；之后，將兩種微膠珠與0.05%的海藻酸鈉溶液反應數分鐘，中和微膠珠表面的正電荷，再將B-PLO-A和A-PLO-A微膠珠與檸檬酸鈉溶液反應數分鐘，液化囊芯，分別制備成A-PLO-A微囊化肝細胞和B-PLO-A微囊化肝細胞。
1.4 實驗分組
將大鼠肝衰竭動物模型隨機分為5組(每組n=20)，分別進行腹腔移植實驗，包括：A-PLO-A空微囊組：移植1 mL的A-PLO-A空微囊；B-PLO-A空微囊組：移植1 mL的B-PLO-A空微囊；移植游離肝細胞組：移植1 mL游離的小鼠原代肝細胞；A-PLO-A微囊化肝細胞組：移植1 mL A-PLO-A微囊化肝細胞；B-PLO-A微囊化肝細胞組：移植1 mL B-PLO-A微囊化肝細胞。
1.5 動物死亡率的檢測以及肝功能檢測
以上5組動物每天觀察記錄死亡情況和死亡時間。并在移植術后的1、3、5 d及1、2、3、4周眼眥靜脈取血測定血液中的肝臟生化指標。使用分光光度計測定并計算ALT、AST和ALB的含量。
1.6 統計學處理
實驗數據以均數±標準差(
2 結果
2.1 相差顯微鏡觀察
光鏡下可見A-PLO-A和B-PLO-A空微囊以及兩種包裹了肝細胞的微囊形態完好，囊表面光滑均勻，如圖 1所示。
圖1
移植前微囊形態的相差顯微鏡觀察
(a)B-PLO-A空微囊(100×)；(b)A-PLO-A空微囊(100×)；(c)B-PLO-A微囊化肝細胞(50×)；(d)A-PLO-A微囊化肝細胞(50×)
Figure1. Phase-contrast microscope observation of the pre-transplant microcapsules(a) B-PLO-A blank microcapsules (100×); (b) A-PLO-A blank microcapsules (100×); (c) B-PLO-A microencapsulated hepatocytes (50×); (d) A-PLO-A microencapsulated hepatocyte (50×)
2.2 死亡率檢測
A-PLO-A空微囊組和B-PLO-A空微囊組大鼠移植3 d死亡率達到100% (20/20)；游離細胞組由于免疫排斥反應持續存在，死亡率呈不斷上升趨勢，3 d死亡率20%(4/20)，移植3周死亡率達到75%(15/20)，其后死亡率維持不變；A-PLO-A微囊化肝細胞組在移植后3周死亡率為35%(7/20)，其后死亡率維持不變；B-PLO-A微囊化肝細胞組在移植后3周死亡率為30%(6/20)，其后死亡率維持不變，如圖 2所示。
圖2
死亡率統計
Figure2.
Mortality statistics
2.3 肝功能檢測
2.3.1 ALT變化
A-PLO-A和B-PLO-A空微囊組的肝衰大鼠ALT水平3 d內持續升高，直至大鼠全部死亡；游離肝細胞組大鼠ALT水平從第5 d開始逐漸下降，第14 d達到最低，隨后有升高的趨勢；A-PLO-A微囊化肝細胞組、B-PLO-A微囊化肝細胞組ALT濃度水平均在移植3 d~4周內持續下降，在各時間點A-PLO-A微囊化肝細胞組、B-PLO-A微囊化肝細胞組ALT水平與游離肝細胞組相比差異均有統計學意義(P＜0.05)，但A-PLO-A微囊化肝細胞組和B-PLO-A微囊化肝細胞組之間差異無統計學意義(P＞0.05)。上述結果表明，與游離肝細胞移植相比，A-PLO-A微囊化肝細胞、B-PLO-A微囊化肝細胞移植4周內均能有效地降低肝衰大鼠ALT的水平，如圖 3所示。
圖3
移植各組ALT 變化
*各時間點不同移植組間比較
*comparing among the different transplant groups at each time point,
2.3.2 AST變化
A-PLO-A和B-PLO-A空微囊組的肝衰大鼠AST水平3 d內持續升高，直至大鼠全部死亡；游離肝細胞組肝衰大鼠AST水平從第3 d開始逐漸下降，第14 d達到最低，隨后有升高的趨勢；A-PLO-A微囊化肝細胞組、B-PLO-A微囊化肝細胞組AST濃度水平均在移植3 d~4周內持續下降，在各時間點A-PLO-A微囊化肝細胞組、B-PLO-A微囊化肝細胞組AST水平與游離肝細胞組相比差異均有統計學意義(P＜0.05)，而A-PLO-A微囊化肝細胞組和B-PLO-A微囊化肝細胞組之間差異無統計學意義(P＞0.05)。上述結果表明，與游離肝細胞移植相比，A-PLO-A微囊化肝細胞、B-PLO-A微囊化肝細胞移植4周內均能有效地降低肝衰大鼠AST的水平，如圖 4所示。
圖4
移植各組AST 變化
*各時間點不同移植組間比較，
* comparing among the different transplant groups at each time point,
2.3.3 ALB變化
A-PLO-A和B-PLO-A空微囊組的肝衰大鼠ALB水平3 d內持續下降，直至大鼠全部死亡；游離肝細胞組肝衰大鼠ALB水平從第3 d開始逐漸升高，第21 d達到最高，隨后有下降的趨勢；A-PLO-A微囊化肝細胞組、B-PLO-A微囊化肝細胞組ALB濃度水平均在移植3 d~4周內持續升高，其中，在各時間點A-PLO-A微囊化肝細胞組、B-PLO-A微囊化肝細胞組ALB水平與游離肝細胞組相比差異均有統計學意義(P＜0.05)，而A-PLO-A微囊化肝細胞組和B-PLO-A微囊化肝細胞組之間差異無統計學意義(P＞0.05)。上述結果表明，與游離肝細胞移植相比，A-PLO-A微囊化肝細胞、B-PLO-A微囊化肝細胞移植4周內均能有效地提高肝衰大鼠的ALB水平，如圖 5所示。
圖5
移植各組ALB 變化
*各時間點不同移植組間比較，
* comparing among the different transplant groups at each time point,
2.4 顯微鏡觀察移植后回收的微囊
在移植4周后，打開各微囊化肝細胞移植組大鼠腹腔，可見大鼠腹腔內表面及腹腔臟器表面光滑，無明顯的異常結節；回收的微囊體積占植入微囊體積的90%以上，微囊表面光滑，無明顯細胞包繞，無纖維化現象，如圖 6所示。
圖6
顯微鏡觀察移植后回收的微囊(100×)
Figure6.
Microscope to observe the microcapsules recovery after transplantation (100×)
3 討論
ALF作為一種臨床高發的嚴重肝病，病程發展快，死亡率高。目前治療ALF最有效的方法是原位肝移植(orthotopic liver transplantation，OLT)，但是由于供體缺乏、治療費用高昂、需要終生服用免疫抑制劑等問題，其臨床應用還存在很大的局限性。目前利用肝細胞移植來替代原位肝臟移植，在治療ALF上也取得了一定進展，但是肝細胞對植入宿主體內后的生存環境有較高的要求。因此，迫切需要新的技術和方法來提高ALF的治療水平。
伴隨組織工程學的蓬勃發展，越來越多組織工程技術應用于肝臟疾病的治療，肝組織工程學應運而生。肝組織工程學面臨的一大難題就是肝細胞的來源。自體肝細胞不宜大量體外擴增，外源性肝細胞雖然可以大量獲得，卻無法避免宿主免疫排斥反應造成的破壞。細胞微囊化技術由于可對包裹其中的各種細胞進行有效保護，在一定程度上可避免細胞體內移植后引發的免疫排斥反應。因此，以微囊化肝細胞為基礎的生物型人工肝研究目前已經成為肝組織工程學的重要組成部分之一。
微囊制備材料是微囊化人造細胞性能優劣的物質基礎，各國學者通過提高海藻酸鹽純度、觀察海藻酸化學構成對微囊性能的影響和尋找新型替代材料，來研發物理性能、生物相容性更好，更為穩定可靠的微囊材料。海藻酸鈉-多聚賴氨酸-海藻酸鈉(alginate-poly-L-lysine-alginate，A-PLL-A)微囊化制備技術是迄今為止研究最深入、應用最廣泛的微囊制備技術，被廣泛應用于各類細胞的包裹。研究表明微囊的穩定性很大程度上依靠其囊膜上多聚陽離子與海藻酸的結合效率[5]。由于PLL與海藻酸的結合效率不足，導致微囊表面有暴露的PLL基團，因此影響了材料的穩定性。多聚鳥氨酸(poly-L-ornithine，PLO)是一種表面帶有陽離子的氨基酸，近年來的研究表明，與PLL相比，PLO與海藻酸鹽結合后，兩者之間形成的化學鍵更短，增強了彼此之間的結合效率，如用PLO取代PLL來制備微囊材料，可在一定程度上提高材料穩定性,所制備的微囊變形率較小，具有更好的機械性能[6]。目前國外文獻報道采用PLO材料制備的微囊,主要為包裹胰島細胞治療糖尿病的研究[7-8]，基于PLO的海藻酸微囊包裹肝細胞體外移植治療急性肝衰的研究目前國內外尚未見報道。
本研究主要探討A-PLO-A 和B-PLO-A兩種新型微囊包裹小鼠肝細胞后，植入D-gal腹腔注射法急性肝衰竭模型大鼠體內，觀察大鼠存活率，微囊內肝細胞的生長、增殖、代謝的情況，以及微囊化肝細胞能否有效改善肝衰大鼠的肝功能。
實驗結果表明，單純的空微囊對肝衰大鼠病情的恢復沒有作用，兩個單純的空微囊移植組動物的死亡率在移植后3 d達到100%。游離肝細胞組、A-PLO-A微囊化肝細胞組和B-PLO-A微囊化肝細胞組的大鼠ALT、AST在血液中的濃度均較移植初有所降低，但術后4周，微囊化肝細胞移植組的上述兩指標均顯著低于游離肝細胞組，說明微囊化肝細胞移植組有效緩解了肝臟損傷的程度，治療效果好于游離肝細胞組。游離肝細胞組肝衰大鼠ALB水平從第3 d開始逐漸升高，第21 d 達到最高，隨后有下降的趨勢；A-PLO-A微囊化肝細胞組和B-PLO-A微囊化肝細胞組大鼠血液中的ALB濃度均逐漸升高，兩組間無明顯差異，但明顯高于游離肝細胞組。微囊化肝細胞組大鼠的存活率明顯高于空微囊移植組和游離肝細胞移植組。4周后回收的微囊表面光滑，無細胞包裹，無纖維化。說明基于PLO的海藻酸微囊物理穩定性和生物相容性良好，適合作為肝細胞體內移植的載體。同時，我們也注意到Hillberg 等[7]的研究中發現植入體內的海藻酸微囊囊外層結構的逐漸降解會導致PLO層的暴露，進而降低其生物相容性。由于相關的研究報道還較少，PLO作為微囊制備材料的評價還不夠全面，進一步的評價研究還需繼續進行。
基于PLO的海藻酸微囊的研制目的是進一步提升微囊的物理性能和生物學性能，以期研制出性能更為優良的微囊材料，同時也為今后進一步將此類型微囊應用于肝組織工程研究奠定堅實的基礎。
引言
急性肝衰竭(acute liver failure,ALF)是一種嚴重危害人類健康的臨床常見疾病，ALF患者在短時間內即可出現肝細胞大量壞死，進而導致嚴重肝功能損傷，病情發展迅速，死亡率高，因此，尋找有效的ALF治療方法極為迫切。
肝組織工程研究在治療ALF方面較為有效的方案之一是微囊化肝細胞移植，微囊化技術可為外源肝細胞提供有效的免疫隔離保護，進而有利于肝細胞移植后的生存和生物學功能的發揮。早在20世紀80年代，Sun 等就將APA微囊包裹肝細胞移植治療大鼠肝衰竭，取得了預期效果[1]。近年來的微囊化肝細胞的技術與方法不斷改進，微囊材料對囊內肝細胞發揮了較明顯的免疫隔離作用，并且由于小分子營養物質可自由通過微囊，囊內肝細胞分泌的活性成分可以發揮功能，使得移植后肝衰動物的存活率明顯提高[2-4]。
微囊化細胞技術目前面臨的主要問題是如何提高微囊材料的物理穩定性和生物相容性，因此將各種新材料用于微囊制備的研究是近年來微囊研究領域的發展趨勢。本研究采用海藻酸鈉-多聚鳥氨酸-海藻酸(alginate-poly ornithine-alginate,A-PLO-A) 和海藻酸鋇-多聚鳥氨酸-海藻酸(barium alginate-poly ornithine-alginate,B-PLO-A)兩種新型微囊包裹小鼠原代肝細胞，植入急性肝衰竭大鼠體內，觀察大鼠存活率，檢測微囊內肝細胞的生長、增殖、代謝情況，檢測肝衰竭大鼠血液中谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸轉氨酶(aspartate aminotransferase，AST)和白蛋白(albumin，ALB)的濃度變化情況；此外，移植4周后回收微囊，觀察移植微囊化細胞的完整性并探討其生物相容性。
1 材料和方法
1.1 大鼠肝衰模型的建立
D-氨基半乳糖(D-galactosamine，D-gal)按1.2 g/kg 比例腹腔一次性給藥，用以誘導急性肝功能衰竭。模型的自然病程為2周，如給藥后存活超過2周者則可長期存活。D-gal誘發急性肝衰的原理是：其在肝內通過半乳糖途徑代謝，抑制核酸及糖蛋白等生物大分子的合成，誘導肝細胞凋亡、自由基產生和脂質過氧化反應等在內的多種機制綜合作用，可迅速造成大面積肝臟損傷。通常在注射后48 h內即可觀測到因大量肝細胞受損、死亡所釋放的各種肝細胞內容物。
1.2 小鼠原代肝細胞分離
斷頸處死C57BL/6小鼠。固定小鼠，噴灑75%酒精消毒后，腹壁正中切口打開腹腔。取出肝臟并將其放入裝有4 ℃含雙抗的D-Hanks 液中漂洗2次，之后在培養皿中用眼科剪將鼠肝組織剪成1 mm3左右的小塊，放入試管中，用吸管吹打，待組織沉淀后吸出上清,如此反復3次，最后一次清洗后，將試管放入離心機800 r/min離心4 min。離心后的試管取出棄上清，加入10倍肝組織體積的含0.2% Ⅳ型膠原酶的消化液，消化完全者可用吸管吹打散開，若消化不完全而吹打不開者，可繼續于37 ℃消化15 min。將肝細胞懸液取樣在光鏡下計數，用血細胞計數板計算肝細胞的產率，并用濃度為0.4%的臺盼藍拒染實驗檢測肝細胞的存活率。
1.3 微囊化肝細胞的制備
將新分離的肝細胞與2%的海藻酸鈉溶液混合，最終達到每毫升海藻酸鈉含肝細胞的數量為5×106個。用靜電微囊發生儀(NISCO VARV1，瑞典)將其分別噴入氯化鋇和氯化鈣溶液中，作用2 min，以形成海藻酸鋇(鈣)微球。吸出氯化鋇(鈣)溶液，用生理鹽水洗滌2次，再將微球分別與多聚鳥賴氨酸溶液/多聚賴氨酸反應數分鐘，形成B-PLO-A和A-PLO-A微球，再使用生理鹽水洗滌2次；之后，將兩種微膠珠與0.05%的海藻酸鈉溶液反應數分鐘，中和微膠珠表面的正電荷，再將B-PLO-A和A-PLO-A微膠珠與檸檬酸鈉溶液反應數分鐘，液化囊芯，分別制備成A-PLO-A微囊化肝細胞和B-PLO-A微囊化肝細胞。
1.4 實驗分組
將大鼠肝衰竭動物模型隨機分為5組(每組n=20)，分別進行腹腔移植實驗，包括：A-PLO-A空微囊組：移植1 mL的A-PLO-A空微囊；B-PLO-A空微囊組：移植1 mL的B-PLO-A空微囊；移植游離肝細胞組：移植1 mL游離的小鼠原代肝細胞；A-PLO-A微囊化肝細胞組：移植1 mL A-PLO-A微囊化肝細胞；B-PLO-A微囊化肝細胞組：移植1 mL B-PLO-A微囊化肝細胞。
1.5 動物死亡率的檢測以及肝功能檢測
以上5組動物每天觀察記錄死亡情況和死亡時間。并在移植術后的1、3、5 d及1、2、3、4周眼眥靜脈取血測定血液中的肝臟生化指標。使用分光光度計測定并計算ALT、AST和ALB的含量。
1.6 統計學處理
實驗數據以均數±標準差(
2 結果
2.1 相差顯微鏡觀察
光鏡下可見A-PLO-A和B-PLO-A空微囊以及兩種包裹了肝細胞的微囊形態完好，囊表面光滑均勻，如圖 1所示。
圖1
移植前微囊形態的相差顯微鏡觀察
(a)B-PLO-A空微囊(100×)；(b)A-PLO-A空微囊(100×)；(c)B-PLO-A微囊化肝細胞(50×)；(d)A-PLO-A微囊化肝細胞(50×)
Figure1. Phase-contrast microscope observation of the pre-transplant microcapsules(a) B-PLO-A blank microcapsules (100×); (b) A-PLO-A blank microcapsules (100×); (c) B-PLO-A microencapsulated hepatocytes (50×); (d) A-PLO-A microencapsulated hepatocyte (50×)
2.2 死亡率檢測
A-PLO-A空微囊組和B-PLO-A空微囊組大鼠移植3 d死亡率達到100% (20/20)；游離細胞組由于免疫排斥反應持續存在，死亡率呈不斷上升趨勢，3 d死亡率20%(4/20)，移植3周死亡率達到75%(15/20)，其后死亡率維持不變；A-PLO-A微囊化肝細胞組在移植后3周死亡率為35%(7/20)，其后死亡率維持不變；B-PLO-A微囊化肝細胞組在移植后3周死亡率為30%(6/20)，其后死亡率維持不變，如圖 2所示。
圖2
死亡率統計
Figure2.
Mortality statistics
2.3 肝功能檢測
2.3.1 ALT變化
A-PLO-A和B-PLO-A空微囊組的肝衰大鼠ALT水平3 d內持續升高，直至大鼠全部死亡；游離肝細胞組大鼠ALT水平從第5 d開始逐漸下降，第14 d達到最低，隨后有升高的趨勢；A-PLO-A微囊化肝細胞組、B-PLO-A微囊化肝細胞組ALT濃度水平均在移植3 d~4周內持續下降，在各時間點A-PLO-A微囊化肝細胞組、B-PLO-A微囊化肝細胞組ALT水平與游離肝細胞組相比差異均有統計學意義(P＜0.05)，但A-PLO-A微囊化肝細胞組和B-PLO-A微囊化肝細胞組之間差異無統計學意義(P＞0.05)。上述結果表明，與游離肝細胞移植相比，A-PLO-A微囊化肝細胞、B-PLO-A微囊化肝細胞移植4周內均能有效地降低肝衰大鼠ALT的水平，如圖 3所示。
圖3
移植各組ALT 變化
*各時間點不同移植組間比較
*comparing among the different transplant groups at each time point,
2.3.2 AST變化
A-PLO-A和B-PLO-A空微囊組的肝衰大鼠AST水平3 d內持續升高，直至大鼠全部死亡；游離肝細胞組肝衰大鼠AST水平從第3 d開始逐漸下降，第14 d達到最低，隨后有升高的趨勢；A-PLO-A微囊化肝細胞組、B-PLO-A微囊化肝細胞組AST濃度水平均在移植3 d~4周內持續下降，在各時間點A-PLO-A微囊化肝細胞組、B-PLO-A微囊化肝細胞組AST水平與游離肝細胞組相比差異均有統計學意義(P＜0.05)，而A-PLO-A微囊化肝細胞組和B-PLO-A微囊化肝細胞組之間差異無統計學意義(P＞0.05)。上述結果表明，與游離肝細胞移植相比，A-PLO-A微囊化肝細胞、B-PLO-A微囊化肝細胞移植4周內均能有效地降低肝衰大鼠AST的水平，如圖 4所示。
圖4
移植各組AST 變化
*各時間點不同移植組間比較，
* comparing among the different transplant groups at each time point,
2.3.3 ALB變化
A-PLO-A和B-PLO-A空微囊組的肝衰大鼠ALB水平3 d內持續下降，直至大鼠全部死亡；游離肝細胞組肝衰大鼠ALB水平從第3 d開始逐漸升高，第21 d達到最高，隨后有下降的趨勢；A-PLO-A微囊化肝細胞組、B-PLO-A微囊化肝細胞組ALB濃度水平均在移植3 d~4周內持續升高，其中，在各時間點A-PLO-A微囊化肝細胞組、B-PLO-A微囊化肝細胞組ALB水平與游離肝細胞組相比差異均有統計學意義(P＜0.05)，而A-PLO-A微囊化肝細胞組和B-PLO-A微囊化肝細胞組之間差異無統計學意義(P＞0.05)。上述結果表明，與游離肝細胞移植相比，A-PLO-A微囊化肝細胞、B-PLO-A微囊化肝細胞移植4周內均能有效地提高肝衰大鼠的ALB水平，如圖 5所示。
圖5
移植各組ALB 變化
*各時間點不同移植組間比較，
* comparing among the different transplant groups at each time point,
2.4 顯微鏡觀察移植后回收的微囊
在移植4周后，打開各微囊化肝細胞移植組大鼠腹腔，可見大鼠腹腔內表面及腹腔臟器表面光滑，無明顯的異常結節；回收的微囊體積占植入微囊體積的90%以上，微囊表面光滑，無明顯細胞包繞，無纖維化現象，如圖 6所示。
圖6
顯微鏡觀察移植后回收的微囊(100×)
Figure6.
Microscope to observe the microcapsules recovery after transplantation (100×)
3 討論
ALF作為一種臨床高發的嚴重肝病，病程發展快，死亡率高。目前治療ALF最有效的方法是原位肝移植(orthotopic liver transplantation，OLT)，但是由于供體缺乏、治療費用高昂、需要終生服用免疫抑制劑等問題，其臨床應用還存在很大的局限性。目前利用肝細胞移植來替代原位肝臟移植，在治療ALF上也取得了一定進展，但是肝細胞對植入宿主體內后的生存環境有較高的要求。因此，迫切需要新的技術和方法來提高ALF的治療水平。
伴隨組織工程學的蓬勃發展，越來越多組織工程技術應用于肝臟疾病的治療，肝組織工程學應運而生。肝組織工程學面臨的一大難題就是肝細胞的來源。自體肝細胞不宜大量體外擴增，外源性肝細胞雖然可以大量獲得，卻無法避免宿主免疫排斥反應造成的破壞。細胞微囊化技術由于可對包裹其中的各種細胞進行有效保護，在一定程度上可避免細胞體內移植后引發的免疫排斥反應。因此，以微囊化肝細胞為基礎的生物型人工肝研究目前已經成為肝組織工程學的重要組成部分之一。
微囊制備材料是微囊化人造細胞性能優劣的物質基礎，各國學者通過提高海藻酸鹽純度、觀察海藻酸化學構成對微囊性能的影響和尋找新型替代材料，來研發物理性能、生物相容性更好，更為穩定可靠的微囊材料。海藻酸鈉-多聚賴氨酸-海藻酸鈉(alginate-poly-L-lysine-alginate，A-PLL-A)微囊化制備技術是迄今為止研究最深入、應用最廣泛的微囊制備技術，被廣泛應用于各類細胞的包裹。研究表明微囊的穩定性很大程度上依靠其囊膜上多聚陽離子與海藻酸的結合效率[5]。由于PLL與海藻酸的結合效率不足，導致微囊表面有暴露的PLL基團，因此影響了材料的穩定性。多聚鳥氨酸(poly-L-ornithine，PLO)是一種表面帶有陽離子的氨基酸，近年來的研究表明，與PLL相比，PLO與海藻酸鹽結合后，兩者之間形成的化學鍵更短，增強了彼此之間的結合效率，如用PLO取代PLL來制備微囊材料，可在一定程度上提高材料穩定性,所制備的微囊變形率較小，具有更好的機械性能[6]。目前國外文獻報道采用PLO材料制備的微囊,主要為包裹胰島細胞治療糖尿病的研究[7-8]，基于PLO的海藻酸微囊包裹肝細胞體外移植治療急性肝衰的研究目前國內外尚未見報道。
本研究主要探討A-PLO-A 和B-PLO-A兩種新型微囊包裹小鼠肝細胞后，植入D-gal腹腔注射法急性肝衰竭模型大鼠體內，觀察大鼠存活率，微囊內肝細胞的生長、增殖、代謝的情況，以及微囊化肝細胞能否有效改善肝衰大鼠的肝功能。
實驗結果表明，單純的空微囊對肝衰大鼠病情的恢復沒有作用，兩個單純的空微囊移植組動物的死亡率在移植后3 d達到100%。游離肝細胞組、A-PLO-A微囊化肝細胞組和B-PLO-A微囊化肝細胞組的大鼠ALT、AST在血液中的濃度均較移植初有所降低，但術后4周，微囊化肝細胞移植組的上述兩指標均顯著低于游離肝細胞組，說明微囊化肝細胞移植組有效緩解了肝臟損傷的程度，治療效果好于游離肝細胞組。游離肝細胞組肝衰大鼠ALB水平從第3 d開始逐漸升高，第21 d 達到最高，隨后有下降的趨勢；A-PLO-A微囊化肝細胞組和B-PLO-A微囊化肝細胞組大鼠血液中的ALB濃度均逐漸升高，兩組間無明顯差異，但明顯高于游離肝細胞組。微囊化肝細胞組大鼠的存活率明顯高于空微囊移植組和游離肝細胞移植組。4周后回收的微囊表面光滑，無細胞包裹，無纖維化。說明基于PLO的海藻酸微囊物理穩定性和生物相容性良好，適合作為肝細胞體內移植的載體。同時，我們也注意到Hillberg 等[7]的研究中發現植入體內的海藻酸微囊囊外層結構的逐漸降解會導致PLO層的暴露，進而降低其生物相容性。由于相關的研究報道還較少，PLO作為微囊制備材料的評價還不夠全面，進一步的評價研究還需繼續進行。
基于PLO的海藻酸微囊的研制目的是進一步提升微囊的物理性能和生物學性能，以期研制出性能更為優良的微囊材料，同時也為今后進一步將此類型微囊應用于肝組織工程研究奠定堅實的基礎。
