為了探討Survivin負性突變體T34A對乳腺癌細胞MCF-7增殖與凋亡的影響,本文分別采用生理鹽水、空載體質粒(PORF-9-null)及Survivin-T34A與MCF-7細胞共培養,觀察體外MCF-7細胞的增殖及凋亡情況;建立乳腺癌裸鼠模型,體內實驗檢測Survivin-T34A對乳腺癌的抑制作用。結果表明轉染了Survivin-T34A的細胞增殖率明顯低于PORF-9-null組,電鏡下觀察可見細胞凋亡增多,流式細胞術檢測顯示其凋亡率明顯高于空載體組。瘤內注射Survivin-T34A組的抑瘤效果明顯,抑制率達47.1%。本研究提示Survivin-T34A負性突變體能夠有效地抑制乳腺癌細胞的增殖,并促進其凋亡,從而發揮抗腫瘤作用。
引用本文： 鄧曉慧, 宋海巖, 任銘新. Survivin突變體對乳腺癌細胞的體內外作用. 生物醫學工程學雜志, 2014, 31(3): 648-651. doi: 10.7507/1001-5515.20140121 復制
引言
乳腺癌是嚴重影響婦女健康甚至危及生命的常見惡性腫瘤之一，在我國其發病率及死亡率占女性惡性腫瘤之首，而且呈逐年升高趨勢[1]。因此，尋找有效的乳腺癌治療方法，對降低我國乃至全球乳腺癌的發病、死亡具有重要意義[2]。Survivin是凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis protein,IAP)成員之一，在腫瘤組織和胚胎組織中高表達而在正常組織中不表達[3-4]，Survivin的 BIR(baculo-virus iap repeat)單元中含有對抑制凋亡有重要作用的氨基酸殘基(Pro、Trp和Cys)，通過這些殘基與caspase-3和caspase-7結合抑制caspase的活性，阻止多種凋亡信號誘導的細胞凋亡。Survivin顯性負突變體為一種結構發生變化而失去正常生物學功能的蛋白質分子，可與相應野生型蛋白進行競爭性抑制而阻斷后者的生物學功能。已有研究表明Survivin負性突變體Survivin-T34A能夠使多種腫瘤細胞發生自發性凋亡，但不影響正常組織細胞的增殖生長[5]。目前很少有該突變體治療乳腺癌的研究報道，本課題利用陽離子脂質體包裹Survivin-T34A并觀察其在體內外抑制乳腺癌細胞的增殖及誘導凋亡作用，以期為乳腺癌的臨床治療提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 材料
人乳腺癌細胞MCF-7購于美國模式培養物集存庫(ATCC)，陽離子脂質體LipofectamineTM2000(lip2000)、重組Survivin-T34A突變基因質粒及空載體質粒(PORF-9-null) DMEM培養基均購于Invitrogen公司，MTT、DMSO購于Sigma公司，胎牛血清(FCS)購于博士德生物工程有限公司，細胞周期及細胞凋亡-Hoechst試劑盒購于碧云天生物技術研究所。雌性Balb /c-nu /nu 裸鼠購自北京華阜康公司。
1.2 方法
1.2.1 體外實驗
① 細胞培養: 人乳腺癌細胞MCF-7常規培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，置于37 ℃、含5% CO2的飽和濕度無菌孵育箱中培養，2~3 d細胞貼壁80%~90%時用0.25%的胰酶消化傳代培養。② 細胞分組: 參照文獻[6]方法,取對數生長期的MCF-7細胞置于6孔板中，待細胞80%融合時開始實驗，棄培養基，隨機分為三組，即空載體組、實驗組及生理鹽水組[(NS)組]，分別加入lip2000包被的PORF-9-null質粒(5 μg，總體積1 mL)、Survivin-T34A質粒(5 μg，總體積1 mL)及生理鹽水1 mL,然后加不含血清的DMEM培養基至2 mL，繼續培養4~6 h后，換含血清的DMEM培養基繼續培養48 h。③ 細胞活性檢測: 將上述方法得到的各組細胞置于96孔板中，加入MTT(5 mg/mL)各20 μL，4 h后，吸出培養液每孔加入DMSO 150 μL，震蕩10 min，使結晶物充分溶解，用酶標儀570 nm波長下測吸光度(A)值，計算抑制率，抑制率(%)=(1-藥物組A570/對照組A570)×100%。④ 流式細胞術檢測細胞凋亡：收集三組培養后的細胞于10 mL離心管中，1 500 r/min、4 ℃離心5 min，棄上清液，用4 ℃預冷的PBS洗滌兩次離心后棄去PBS，再加入4 ℃預冷的70%乙醇固定40 min后，棄固定液，再用4 ℃預冷的PBS洗滌兩次，加入碘化丙啶(PI)，避光室溫反應30 min，用流式細胞儀檢測。⑤ 細胞凋亡-Hoechst染色：按照試劑盒操作步驟，將各組轉染后細胞置于6孔板培養48 h，取出6孔板中的蓋玻片，PBS洗滌后加入0.5 mL固定液固定10 min，PBS洗滌兩遍各 3 min，加入0.5 mL Hoechst 33258 染色液，于搖床上染色5 min后PBS 洗滌兩遍，每次3 min，抗熒光淬滅封片液封片，熒光顯微鏡下檢測細胞核。
1.2.2 體內實驗
① 乳腺癌動物模型建立：取對數生長期的乳腺癌細胞MCF-7，置于不含血清DMEM培養基中離心洗滌三次，用生理鹽水調至5×107個/mL，接種于6~8周齡的裸鼠，每只200 μL，接種1 d后嚴格按照隨機數字表將裸鼠分為三組，每組10只，接種10 d后分別給予生理鹽水、PORF-9-null(20 μg)、Survivin-T34A(20 μg)各100 μL，瘤內注射給藥，一周兩次，共給藥6次。② 腫瘤生長曲線及抑制率：出瘤后隔2~3 d用游標卡尺測量腫瘤的長徑和短徑，按公式計算腫瘤體積(腫瘤體積=寬2×長×0.52)，并以測量腫瘤生長的時間點為橫軸，以腫瘤體積為縱軸描繪腫瘤生長曲線。接種后第42 d脫頸處死裸鼠，剖其腫瘤組織，稱腫瘤重量，計算腫瘤抑制率，腫瘤抑制率(%)=(1-平均實驗組瘤重/平均NS對照組瘤重)×100%。
1.2.3 統計方法
數據以均數±標準差(
2 結果
2.1 MTT細胞活性檢測
細胞增殖率檢測顯示，轉染了Survivin-T34A的實驗組乳腺癌細胞的抑制率為46.50%，明顯高于空載體組4.9%(P＜0.05)，顯示Survivin突變體能夠使乳腺癌細胞活性降低，抑制其增殖。
2.2 細胞凋亡檢測
流式細胞儀檢測結果顯示，Survivin-T34A質粒誘導細胞凋亡，與空載體組相比明顯增高(P＜0.05)(見表 1)，用Hoechst 33258染色后，在熒光顯微鏡下觀察，可見正常細胞核呈現均勻藍染，而凋亡的細胞核呈現出致密濃染或呈碎塊狀致密濃染，顏色呈現亮白，實驗組細胞凋亡數明顯增多(見圖 1)。
表1
Survivin-T34A對乳腺癌細胞MCF-7凋亡的影響(
圖1
各組細胞凋亡染色結果
Figure1.
Results of Hoechst 33258 staining
2.3 Survivin-T34A對腫瘤的抑制作用
Survivin-T34A治療組的實體瘤體積與NS組及空載體組比較增長明顯減緩，如圖 2所示。與空載體組相比，Survivin-T34A質粒對腫瘤有明顯的抑制作用(見表 2)。
圖2
乳腺癌實體瘤生長曲線
Figure2.
Growth curves of tumor volume
表2
Survivin-T34A對裸鼠乳腺癌的抑瘤作用
Table2.
Anti-tumor effect of Survivin-T34A on breast cancer in mice
3 討論
隨著分子生物學的深入研究和應用，乳腺癌的基因治療逐漸成為生物治療中的重要探索方向并顯出很好的前景。乳腺癌的基因治療包括多種，其中以Survivin為靶點的腫瘤基因治療受到廣泛的關注。 Survivin是目前發現作用最強的凋亡抑制因子，研究證明Survivin高表達可抑制Fas、Bax、caspases、腫瘤壞死因子、抗癌藥物等誘導的細胞凋亡，逃避機體免疫系統對腫瘤細胞的識別和清除[7]。Survivin為靶點的治療主要是通過抑制Survivin的抗凋亡作用以及抑制其促細胞增殖作用，從而有效破壞腫瘤的生存發展，誘導細胞凋亡，降低其生長潛能。相關的研究主要集中在反義寡核苷酸、RNA干擾和顯性失活突變體等。
Survivin基因顯性負突變體已成為生物靶向治療研究的熱點[8]，它是一種結構發生變化而失去其正常凋亡抑制功能的蛋白質分子，可與Survivin蛋白進行競爭性抑制，從而阻斷Survivin正常的生物功能，抑制腫瘤細胞增殖和誘導凋亡，而且能夠增加腫瘤細胞對化療藥物的敏感性[9]。近年來研究證明抑制效能最高的突變體為本課題所用到的Survivin-T34A[10]，其34位上磷酸化位點缺失，促進其與細胞內野生型Survivin蛋白競爭性結合CDC2-cyclinB1,使內源性Survivin無法發揮其抑制凋亡的作用，從而引起腫瘤細胞的凋亡，達到治療效果。本實驗利用細胞和動物模型觀察了Survivin突變體對乳腺癌細胞的體內外抗瘤效果。體外實驗將Survivin-T34A及PORF-9-null質粒轉染乳腺癌細胞MCF-7，運用MTT及流式細胞術檢測到Survivin-T34A組能夠抑制MCF-7細胞的增殖，使乳腺癌細胞G0/G1期明顯增多，凋亡率較其余兩組明顯升高，說明Survivin-T34A在體外能夠誘導乳腺癌MCF-7細胞凋亡。為了進一步明確Survivin-T34A對乳腺癌細胞增殖凋亡的影響，課題組又做了Survivin-T34A體內抗瘤作用實驗，建立裸鼠乳腺癌模型，顯示Survivin-T34A能夠減緩腫瘤生長速度，與其余兩組比較抑瘤率明顯升高。
本實驗通過體外轉染細胞及體內腫瘤模型顯示了Survivin-T34A對乳腺癌細胞增殖和凋亡的影響以及體內的抑瘤作用。然而以Survivin為治療靶點的實驗還處于早期階段，能否運用于臨床，Survivin-T34A在體內如何發揮抗腫瘤的效應，其機制如何等，還有待進一步的研究。接下來我們將從凋亡通路的角度切入Survivin-T34A抗瘤機制的研究，以期為乳腺癌的基因治療、抗腫瘤藥物的開發提供思路。
引言
乳腺癌是嚴重影響婦女健康甚至危及生命的常見惡性腫瘤之一，在我國其發病率及死亡率占女性惡性腫瘤之首，而且呈逐年升高趨勢[1]。因此，尋找有效的乳腺癌治療方法，對降低我國乃至全球乳腺癌的發病、死亡具有重要意義[2]。Survivin是凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis protein,IAP)成員之一，在腫瘤組織和胚胎組織中高表達而在正常組織中不表達[3-4]，Survivin的 BIR(baculo-virus iap repeat)單元中含有對抑制凋亡有重要作用的氨基酸殘基(Pro、Trp和Cys)，通過這些殘基與caspase-3和caspase-7結合抑制caspase的活性，阻止多種凋亡信號誘導的細胞凋亡。Survivin顯性負突變體為一種結構發生變化而失去正常生物學功能的蛋白質分子，可與相應野生型蛋白進行競爭性抑制而阻斷后者的生物學功能。已有研究表明Survivin負性突變體Survivin-T34A能夠使多種腫瘤細胞發生自發性凋亡，但不影響正常組織細胞的增殖生長[5]。目前很少有該突變體治療乳腺癌的研究報道，本課題利用陽離子脂質體包裹Survivin-T34A并觀察其在體內外抑制乳腺癌細胞的增殖及誘導凋亡作用，以期為乳腺癌的臨床治療提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 材料
人乳腺癌細胞MCF-7購于美國模式培養物集存庫(ATCC)，陽離子脂質體LipofectamineTM2000(lip2000)、重組Survivin-T34A突變基因質粒及空載體質粒(PORF-9-null) DMEM培養基均購于Invitrogen公司，MTT、DMSO購于Sigma公司，胎牛血清(FCS)購于博士德生物工程有限公司，細胞周期及細胞凋亡-Hoechst試劑盒購于碧云天生物技術研究所。雌性Balb /c-nu /nu 裸鼠購自北京華阜康公司。
1.2 方法
1.2.1 體外實驗
① 細胞培養: 人乳腺癌細胞MCF-7常規培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，置于37 ℃、含5% CO2的飽和濕度無菌孵育箱中培養，2~3 d細胞貼壁80%~90%時用0.25%的胰酶消化傳代培養。② 細胞分組: 參照文獻[6]方法,取對數生長期的MCF-7細胞置于6孔板中，待細胞80%融合時開始實驗，棄培養基，隨機分為三組，即空載體組、實驗組及生理鹽水組[(NS)組]，分別加入lip2000包被的PORF-9-null質粒(5 μg，總體積1 mL)、Survivin-T34A質粒(5 μg，總體積1 mL)及生理鹽水1 mL,然后加不含血清的DMEM培養基至2 mL，繼續培養4~6 h后，換含血清的DMEM培養基繼續培養48 h。③ 細胞活性檢測: 將上述方法得到的各組細胞置于96孔板中，加入MTT(5 mg/mL)各20 μL，4 h后，吸出培養液每孔加入DMSO 150 μL，震蕩10 min，使結晶物充分溶解，用酶標儀570 nm波長下測吸光度(A)值，計算抑制率，抑制率(%)=(1-藥物組A570/對照組A570)×100%。④ 流式細胞術檢測細胞凋亡：收集三組培養后的細胞于10 mL離心管中，1 500 r/min、4 ℃離心5 min，棄上清液，用4 ℃預冷的PBS洗滌兩次離心后棄去PBS，再加入4 ℃預冷的70%乙醇固定40 min后，棄固定液，再用4 ℃預冷的PBS洗滌兩次，加入碘化丙啶(PI)，避光室溫反應30 min，用流式細胞儀檢測。⑤ 細胞凋亡-Hoechst染色：按照試劑盒操作步驟，將各組轉染后細胞置于6孔板培養48 h，取出6孔板中的蓋玻片，PBS洗滌后加入0.5 mL固定液固定10 min，PBS洗滌兩遍各 3 min，加入0.5 mL Hoechst 33258 染色液，于搖床上染色5 min后PBS 洗滌兩遍，每次3 min，抗熒光淬滅封片液封片，熒光顯微鏡下檢測細胞核。
1.2.2 體內實驗
① 乳腺癌動物模型建立：取對數生長期的乳腺癌細胞MCF-7，置于不含血清DMEM培養基中離心洗滌三次，用生理鹽水調至5×107個/mL，接種于6~8周齡的裸鼠，每只200 μL，接種1 d后嚴格按照隨機數字表將裸鼠分為三組，每組10只，接種10 d后分別給予生理鹽水、PORF-9-null(20 μg)、Survivin-T34A(20 μg)各100 μL，瘤內注射給藥，一周兩次，共給藥6次。② 腫瘤生長曲線及抑制率：出瘤后隔2~3 d用游標卡尺測量腫瘤的長徑和短徑，按公式計算腫瘤體積(腫瘤體積=寬2×長×0.52)，并以測量腫瘤生長的時間點為橫軸，以腫瘤體積為縱軸描繪腫瘤生長曲線。接種后第42 d脫頸處死裸鼠，剖其腫瘤組織，稱腫瘤重量，計算腫瘤抑制率，腫瘤抑制率(%)=(1-平均實驗組瘤重/平均NS對照組瘤重)×100%。
1.2.3 統計方法
數據以均數±標準差(
2 結果
2.1 MTT細胞活性檢測
細胞增殖率檢測顯示，轉染了Survivin-T34A的實驗組乳腺癌細胞的抑制率為46.50%，明顯高于空載體組4.9%(P＜0.05)，顯示Survivin突變體能夠使乳腺癌細胞活性降低，抑制其增殖。
2.2 細胞凋亡檢測
流式細胞儀檢測結果顯示，Survivin-T34A質粒誘導細胞凋亡，與空載體組相比明顯增高(P＜0.05)(見表 1)，用Hoechst 33258染色后，在熒光顯微鏡下觀察，可見正常細胞核呈現均勻藍染，而凋亡的細胞核呈現出致密濃染或呈碎塊狀致密濃染，顏色呈現亮白，實驗組細胞凋亡數明顯增多(見圖 1)。
表1
Survivin-T34A對乳腺癌細胞MCF-7凋亡的影響(
圖1
各組細胞凋亡染色結果
Figure1.
Results of Hoechst 33258 staining
2.3 Survivin-T34A對腫瘤的抑制作用
Survivin-T34A治療組的實體瘤體積與NS組及空載體組比較增長明顯減緩，如圖 2所示。與空載體組相比，Survivin-T34A質粒對腫瘤有明顯的抑制作用(見表 2)。
圖2
乳腺癌實體瘤生長曲線
Figure2.
Growth curves of tumor volume
表2
Survivin-T34A對裸鼠乳腺癌的抑瘤作用
Table2.
Anti-tumor effect of Survivin-T34A on breast cancer in mice
3 討論
隨著分子生物學的深入研究和應用，乳腺癌的基因治療逐漸成為生物治療中的重要探索方向并顯出很好的前景。乳腺癌的基因治療包括多種，其中以Survivin為靶點的腫瘤基因治療受到廣泛的關注。 Survivin是目前發現作用最強的凋亡抑制因子，研究證明Survivin高表達可抑制Fas、Bax、caspases、腫瘤壞死因子、抗癌藥物等誘導的細胞凋亡，逃避機體免疫系統對腫瘤細胞的識別和清除[7]。Survivin為靶點的治療主要是通過抑制Survivin的抗凋亡作用以及抑制其促細胞增殖作用，從而有效破壞腫瘤的生存發展，誘導細胞凋亡，降低其生長潛能。相關的研究主要集中在反義寡核苷酸、RNA干擾和顯性失活突變體等。
Survivin基因顯性負突變體已成為生物靶向治療研究的熱點[8]，它是一種結構發生變化而失去其正常凋亡抑制功能的蛋白質分子，可與Survivin蛋白進行競爭性抑制，從而阻斷Survivin正常的生物功能，抑制腫瘤細胞增殖和誘導凋亡，而且能夠增加腫瘤細胞對化療藥物的敏感性[9]。近年來研究證明抑制效能最高的突變體為本課題所用到的Survivin-T34A[10]，其34位上磷酸化位點缺失，促進其與細胞內野生型Survivin蛋白競爭性結合CDC2-cyclinB1,使內源性Survivin無法發揮其抑制凋亡的作用，從而引起腫瘤細胞的凋亡，達到治療效果。本實驗利用細胞和動物模型觀察了Survivin突變體對乳腺癌細胞的體內外抗瘤效果。體外實驗將Survivin-T34A及PORF-9-null質粒轉染乳腺癌細胞MCF-7，運用MTT及流式細胞術檢測到Survivin-T34A組能夠抑制MCF-7細胞的增殖，使乳腺癌細胞G0/G1期明顯增多，凋亡率較其余兩組明顯升高，說明Survivin-T34A在體外能夠誘導乳腺癌MCF-7細胞凋亡。為了進一步明確Survivin-T34A對乳腺癌細胞增殖凋亡的影響，課題組又做了Survivin-T34A體內抗瘤作用實驗，建立裸鼠乳腺癌模型，顯示Survivin-T34A能夠減緩腫瘤生長速度，與其余兩組比較抑瘤率明顯升高。
本實驗通過體外轉染細胞及體內腫瘤模型顯示了Survivin-T34A對乳腺癌細胞增殖和凋亡的影響以及體內的抑瘤作用。然而以Survivin為治療靶點的實驗還處于早期階段，能否運用于臨床，Survivin-T34A在體內如何發揮抗腫瘤的效應，其機制如何等，還有待進一步的研究。接下來我們將從凋亡通路的角度切入Survivin-T34A抗瘤機制的研究，以期為乳腺癌的基因治療、抗腫瘤藥物的開發提供思路。
