本文應用免疫酶組織化學及免疫熒光雙標技術,將30只健康雄性SD大鼠分為一個對照組和5個實驗組[即癲癇持續狀態(SE)發作后1、6、24、48和72 h組],研究磷酸化DARPP-32(p-DARPP-32)在PTZ誘導的癲癇發作大鼠前腦區域的表達(動態變化)和分布,并計算p-DARPP-32陽性表的神經元細胞數,以及與非磷酸化DARPP-32在大鼠前腦神經元的共存情況。結果表明,PTZ誘導大鼠SE發作1 h和6 h時,p-DARPP-32在大鼠前腦神經元的表達達到高峰,24 h后開始逐漸下降;p-DARPP-32在大鼠前腦皮層、海馬及紋狀體神經元的胞質、胞核中有明顯表達。免疫熒光雙標記顯示,p-DARPP-32與DARPP-32在上述區域出現高比例的共存。本研究提示p-DARPP-32在癲癇發作中可能起著重要作用。
引用本文： 王偉文, 廖曉陽, 楊正輝, 林航, 王慶松, 吳俞憲, 劉榆. 磷酸化DARPP-32在戊四氮誘導大鼠癲癇模型中的表達及其作用的研究. 生物醫學工程學雜志, 2014, 31(3): 637-641. doi: 10.7507/1001-5515.20140119 復制
引言
癲癇是大腦神經元異常放電導致短暫腦功能障礙的一種疾病。癲癇發作與腦內各種生物化學物質如單胺類遞質、氨基酸類遞質和環核苷酸類遞質等密切相關。其中單胺類中的多巴胺遞質起著重要作用[1-4]。紋狀體是與癲癇發作密切相關的主要結構之一，多巴胺和cAMP調節的磷蛋白(dopamine and CAMP-regulated phosphoprotein，DARPP-32)是腦內新紋狀體等重要核團內存在的一種具有信息調節與整合作用的蛋白質。多巴胺等神經遞質與相應受體結合后,使DARPP-32發生磷酸化改變,繼而影響磷酸酯酶的活性,導致神經元的生理功能及其控制的行為發生改變[5-6]。本研究應用免疫酶組化及熒光雙標技術對戊四氮(pentylenetetrazol，PTZ)誘導的大鼠癲癇發作后磷酸化DARPP-32(p-DARPP-32)在大腦內的表達、分布及時程動態變化進行研究，并對磷酸化與非磷酸化DARPP-32在大鼠前腦神經元的共存情況進行分析，以進一步探討p-DARPP-32在大鼠癲癇模型中的調控作用，報告如下。
1 材料和方法
1.1 實驗材料
1.1.1 實驗動物
二級(清潔級)健康雄性SD大鼠30只(體重240~300 g),購于四川大學華西醫院實驗動物中心,置于同一實驗室中,分籠飼養,動物室溫20~26℃,均自由飲水和攝食。
1.1.2 實驗試劑
免疫組織化學一抗為兔抗p-DARPP-32,1∶150(購自Cell Signaling公司)；二抗驢抗兔生物素標記的IgG,1∶400(購自Check公司)。免疫熒光雙標記一抗為山羊抗DARPP-32，1∶100(購自Santa Cruz,USA公司)和兔抗p-DARPP-32,1∶100(購自Cell Signaling公司)抗體混合物，二抗為連接TRITC熒光素的驢抗山羊IgG (1∶300，購自TRITC，Chemicon公司)和連接著FITC熒光素的驢抗兔IgG (1∶300，購自FITC，Vector)抗體混合物。
1.1.3 實驗儀器
顯微鏡由日本奧林巴斯公司生產。
1.2 方法
1.2.1 實驗動物分組
研究動物按體重配對被分為一個對照組(n=5)和5個實驗組(n=5)。 實驗組分為PTZ 1h組、PTZ 6h組、 PTZ 24h組、PTZ 48h組和PTZ 72h組，動物分別在PTZ誘發癲癇持續發作(status epilepticus,SE)1、6、24、48、72 h后被處死；對照組動物接受同樣體積和次數的生理鹽水注射，在注射后1 h處死。
1.2.2 癲癇動物模型制備
各實驗組大鼠均接受重復低劑量的PTZ腹腔注射以最終達到SE。重復PTZ腹腔注射方案：首劑給予20 mg/kg PTZ，然后每間隔10 min腹腔注射10 mg/kg PTZ直至SE發生。全身性SE發作的特征是：動物出現連續的跌倒強直發作期(10~15 s)，而后反復出現幾分鐘的頭和肢體的陣攣性發作[7]。
1.2.3 切片制備
實驗組動物在SE發作后被放回溫暖、安靜環境中飼養，分別經1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射深度系統麻醉后，在相應的時間被處死[8]。處死后動物立即予以左心室至升主動脈插管，含40 g/L多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸緩沖液(PB，pH 7.4)灌流固定，冰凍切片機上行全腦組織連續冠狀切片，30 μm厚的組織切片。
1.2.4 免疫組織化學染色
采用ABC法，首先一抗(兔抗p-DARPP-32) 4℃孵育48 h；其次二抗(驢抗兔生物素標記的IgG)室溫孵育4 h；最后ABC復合物(Vector,1∶400)室溫下孵育2 h，DAB棕色顯色，切片、晾干、脫水、透明后封片。在Olympus BX-60顯微鏡下分析觀察結果，并采集圖像。
1.2.5 免疫熒光雙標記
實驗步驟為一抗山羊抗DARPP-32和兔抗p-DARPP-32抗體混合物4℃孵育48 h，二抗連接TRITC熒光素的驢抗山羊IgG和連接FITC熒光素的驢抗兔IgG抗體混合物。室溫下避光孵育2 h，漂洗后腦片被裱在載玻片上，80%甘油封片，用正常血清代替一抗設立對照實驗。
1.3 數據分析
免疫組化陽性染色細胞判讀：p-DARPP32免疫組化染色的陽性細胞在顯微鏡下可見，但陰性細胞在顯微鏡下不可見，故以陽性細胞數而不是陽性細胞比例進行比較研究。p-DARPP32與非磷酸化DARPP32抗原染色陽性部位在前腦如皮層的分布一致，p-DARPP32主要分布在胞質、胞核中，非磷酸化DARPP32還表達在胞膜上[9]。免疫酶組織化學染色半定量分析中，位于大鼠皮層、海馬和紋狀體等區域SE發作后不同時段的p-DARPP-32陽性神經元被計數，每只大鼠每個區域挑選6~8張切片(雙側)用以計數,每張切片選10個視野，每個視野的細胞數量用均數±標準差(
2 結果
2.1 PTZ誘發SE 發作后不同時間點，p-DARPP-32在大鼠大腦內的表達
在大鼠皮層、海馬和紋狀體區域，PTZ 1h組陽性表達p-DARPP-32神經元數量較對照組明顯增加且差異有統計學意義(P＜0.05)；PTZ 6h組陽性表達p-DARPP-32神經元數量較PTZ 1h組減少但差異無統計學意義(P＞0.05)；PTZ 24h組、PTZ 48h組和PTZ 72h組p-DARPP-32神經元數量隨時間延長進一步減少，均低于PTZ 6h組，但仍高于對照組(P＜0.05)。即PTZ誘發SE發作后1~6 h，p-DARPP-32在前腦神經元的表達達到了最高峰，其后隨時間下降，如表 1所示。
表1
PTZ誘導SE發作后不同時間點，p-DARPP-32在大鼠不同腦區表達(細胞數)
Table1.
Positive expression of p-DARPP-32 in cerebral cortex,hippocampus and neostriatum of rat brain at different time points after the onset of SE (Somas)
2.2 PTZ誘發SE發作1 h后，p-DARPP-32陽性表達神經元在大鼠前腦的分布定位
本研究選擇PTZ誘發SE發作后1 h即p-DARPP-32陽性表達最高峰時觀察p-DARPP-32在大鼠前腦的分布(見圖 1)。結果顯示在大腦皮層，陽性p-DARPP-32神經元主要分布于Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ層，和非磷酸化DARPP-32的表達分布位置基本一致，但在胞體中的表達部位略有差異。在海馬，陽性p-DARPP-32神經元主要密集分布于CA2、CA3區，散在分布于CA1、CA4及齒狀回亞區，主要表達在胞質及胞核中。在紋狀體，陽性p-DARPP-32神經元主要分布在中間棘神經元的胞質和胞核中。
圖1
PTZ誘導SE發作1 h后，陽性p-DARPP-32神經元在皮層、海馬及紋狀體區域的分布
箭頭所指示處為p-DARPP-32陽性神經元
Figure1. Distribution of p-DARPP-32 immunoreactive cell in cerebral cortex,hippocampus and neostriatum after 1 h following SE induced by PTZp-DARPP-32 immunoreactive neurons were representatively indicated by arrowheads
2.3 PTZ誘發SE發作1 h后，p-DARPP-32和DARPP-32在前腦神經元的共存情況
本研究顯示SE發作后1 h，在額、頂葉皮層Ⅲ、Ⅴ層(細胞膜)，海馬CA2及CA3區(胞質)以及紋狀體中間棘神經元(胞質、胞核)均同時檢測到密集的含有p-DARPP-32與DARPP-32陽性表達的神經元。p-DARPP-32與DARPP-32同時表達陽性即雙標陽性神經元的細胞數占p-DARPP-32或 DARPP-32單標陽性細胞數的比例在海馬區明顯高于紋狀體和皮質區(P＜0.001)(見表 2)，提示海馬區p-DARPP-32和DARPP-32共存的現象更為突出。
表2
SE發作1 h后，p-DARPP-32、DARPP-32單標及p-DARPP-32/DARPP-32雙標陽性神經元在大鼠腦皮層、紋狀體及海馬的比較*
Table2.
Comparison of p-DARPP-32 single-,DARPP-32 single- and p-DARPP-32/DARPP-32 double-labeled neurons in cerebral cortex,hippocampus and neostriatum of rat forebrains after 1 h following SE
3 討論
本研究結果顯示，PTZ誘發SE發作后p-DARPP-32表達具有一個動態時相變化過程，即發作后1~6 h，p-DARPP-32在前腦神經元的表達達到高峰，24 h后開始逐漸下降。本研究還顯示p-DARPP-32陽性表達區域主要在大鼠前腦皮層、海馬及紋狀體，與DARPP-32在前腦的分布基本一致，提示p-DARPP-32可能參與了PTZ誘導的SE急性發作。
已有研究報道PTZ誘導的癲癇模型中，位于前腦皮質、伏隔核及紋狀體等區域的細胞外多巴胺神經遞質濃度明顯升高，并且多巴胺遞質濃度的增加與所給PTZ劑量呈正性線性相關[9-10]。也有其它藥物誘發的癲癇動物模型實驗證實SE發作后內源性多巴胺神經遞質及其代謝產物水平在多個腦區內升高，并且多巴胺神經遞質最終激活D1/DARPP-32/PP-Ⅰ信息鏈導致DARPP-32磷酸化[11]。本研究結果顯示免疫熒光雙標陽性表達p-DARPP-32與DARPP-32的神經元在大鼠前腦皮層、海馬及紋狀體較為密集，提示除了DARPP-32外，p-DARPP-32也作為活性分子參與了PTZ誘導的癲癇急性發作，因此存在DARPP-32與p-DARPP-32共存現象。海馬區雙標陽性神經元的細胞數占p-DARPP-32或 DARPP-32單標陽性細胞數的比例高于紋狀體和皮質區，提示此區域共存的現象可能更明顯。
p-DARPP-32是蛋白磷酸脂酶-Ⅰ的強抑制劑,抑制蛋白磷酸脂酶-Ⅰ的去磷酸化過程[12]。當蛋白磷酸脂酶-Ⅰ磷酸化受抑制時，其下游NMDA、AMPA受體及左型Ca2+通道的磷酸化程度增加，生理效應增強，最終導致神經元興奮性增加以致癲癇發作[13-14]。有學者[15]發現新紋狀體中間棘神經元上多巴胺D1受體對來自GABA能中間神經元的抑制調節作用提高了皮層神經元的興奮性和產生突觸后神經元去極化的能力，這個過程是通過激活D1/DARPP-32/PP-Ⅰ信息傳遞鏈并靶定位在GABAA受體的亞基，減少突觸后GABAA受體離子流等一系列過程來實現的[6] 。本實驗顯示，SE發作后DARPP-32在癲癇傳導的好發區域(前腦皮層、海馬及紋狀體)神經元均存在著明顯的磷酸化表達，并且與非磷酸化的DARPP-32有著很高的共存率，提示DARPP-32的磷酸化可能通過紋狀體中間棘神經元、海馬神經元等位點參與了癲癇的調控，與Flores-Hernandez等[6]研究多巴胺D1受體對GABAA受體離子流調控路徑的結果基本吻合。
綜上所述，PTZ誘發的癲癇模型中DARPP-32磷酸化存在動態變化過程，大鼠前腦皮層、海馬及紋狀體區域p-DARPP-32和DARPP-32有較高的共存率，p-DARPP-32可能通過紋狀體中間棘神經元、海馬神經元等位點參與了癲癇的調控。
引言
癲癇是大腦神經元異常放電導致短暫腦功能障礙的一種疾病。癲癇發作與腦內各種生物化學物質如單胺類遞質、氨基酸類遞質和環核苷酸類遞質等密切相關。其中單胺類中的多巴胺遞質起著重要作用[1-4]。紋狀體是與癲癇發作密切相關的主要結構之一，多巴胺和cAMP調節的磷蛋白(dopamine and CAMP-regulated phosphoprotein，DARPP-32)是腦內新紋狀體等重要核團內存在的一種具有信息調節與整合作用的蛋白質。多巴胺等神經遞質與相應受體結合后,使DARPP-32發生磷酸化改變,繼而影響磷酸酯酶的活性,導致神經元的生理功能及其控制的行為發生改變[5-6]。本研究應用免疫酶組化及熒光雙標技術對戊四氮(pentylenetetrazol，PTZ)誘導的大鼠癲癇發作后磷酸化DARPP-32(p-DARPP-32)在大腦內的表達、分布及時程動態變化進行研究，并對磷酸化與非磷酸化DARPP-32在大鼠前腦神經元的共存情況進行分析，以進一步探討p-DARPP-32在大鼠癲癇模型中的調控作用，報告如下。
1 材料和方法
1.1 實驗材料
1.1.1 實驗動物
二級(清潔級)健康雄性SD大鼠30只(體重240~300 g),購于四川大學華西醫院實驗動物中心,置于同一實驗室中,分籠飼養,動物室溫20~26℃,均自由飲水和攝食。
1.1.2 實驗試劑
免疫組織化學一抗為兔抗p-DARPP-32,1∶150(購自Cell Signaling公司)；二抗驢抗兔生物素標記的IgG,1∶400(購自Check公司)。免疫熒光雙標記一抗為山羊抗DARPP-32，1∶100(購自Santa Cruz,USA公司)和兔抗p-DARPP-32,1∶100(購自Cell Signaling公司)抗體混合物，二抗為連接TRITC熒光素的驢抗山羊IgG (1∶300，購自TRITC，Chemicon公司)和連接著FITC熒光素的驢抗兔IgG (1∶300，購自FITC，Vector)抗體混合物。
1.1.3 實驗儀器
顯微鏡由日本奧林巴斯公司生產。
1.2 方法
1.2.1 實驗動物分組
研究動物按體重配對被分為一個對照組(n=5)和5個實驗組(n=5)。 實驗組分為PTZ 1h組、PTZ 6h組、 PTZ 24h組、PTZ 48h組和PTZ 72h組，動物分別在PTZ誘發癲癇持續發作(status epilepticus,SE)1、6、24、48、72 h后被處死；對照組動物接受同樣體積和次數的生理鹽水注射，在注射后1 h處死。
1.2.2 癲癇動物模型制備
各實驗組大鼠均接受重復低劑量的PTZ腹腔注射以最終達到SE。重復PTZ腹腔注射方案：首劑給予20 mg/kg PTZ，然后每間隔10 min腹腔注射10 mg/kg PTZ直至SE發生。全身性SE發作的特征是：動物出現連續的跌倒強直發作期(10~15 s)，而后反復出現幾分鐘的頭和肢體的陣攣性發作[7]。
1.2.3 切片制備
實驗組動物在SE發作后被放回溫暖、安靜環境中飼養，分別經1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射深度系統麻醉后，在相應的時間被處死[8]。處死后動物立即予以左心室至升主動脈插管，含40 g/L多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸緩沖液(PB，pH 7.4)灌流固定，冰凍切片機上行全腦組織連續冠狀切片，30 μm厚的組織切片。
1.2.4 免疫組織化學染色
采用ABC法，首先一抗(兔抗p-DARPP-32) 4℃孵育48 h；其次二抗(驢抗兔生物素標記的IgG)室溫孵育4 h；最后ABC復合物(Vector,1∶400)室溫下孵育2 h，DAB棕色顯色，切片、晾干、脫水、透明后封片。在Olympus BX-60顯微鏡下分析觀察結果，并采集圖像。
1.2.5 免疫熒光雙標記
實驗步驟為一抗山羊抗DARPP-32和兔抗p-DARPP-32抗體混合物4℃孵育48 h，二抗連接TRITC熒光素的驢抗山羊IgG和連接FITC熒光素的驢抗兔IgG抗體混合物。室溫下避光孵育2 h，漂洗后腦片被裱在載玻片上，80%甘油封片，用正常血清代替一抗設立對照實驗。
1.3 數據分析
免疫組化陽性染色細胞判讀：p-DARPP32免疫組化染色的陽性細胞在顯微鏡下可見，但陰性細胞在顯微鏡下不可見，故以陽性細胞數而不是陽性細胞比例進行比較研究。p-DARPP32與非磷酸化DARPP32抗原染色陽性部位在前腦如皮層的分布一致，p-DARPP32主要分布在胞質、胞核中，非磷酸化DARPP32還表達在胞膜上[9]。免疫酶組織化學染色半定量分析中，位于大鼠皮層、海馬和紋狀體等區域SE發作后不同時段的p-DARPP-32陽性神經元被計數，每只大鼠每個區域挑選6~8張切片(雙側)用以計數,每張切片選10個視野，每個視野的細胞數量用均數±標準差(
2 結果
2.1 PTZ誘發SE 發作后不同時間點，p-DARPP-32在大鼠大腦內的表達
在大鼠皮層、海馬和紋狀體區域，PTZ 1h組陽性表達p-DARPP-32神經元數量較對照組明顯增加且差異有統計學意義(P＜0.05)；PTZ 6h組陽性表達p-DARPP-32神經元數量較PTZ 1h組減少但差異無統計學意義(P＞0.05)；PTZ 24h組、PTZ 48h組和PTZ 72h組p-DARPP-32神經元數量隨時間延長進一步減少，均低于PTZ 6h組，但仍高于對照組(P＜0.05)。即PTZ誘發SE發作后1~6 h，p-DARPP-32在前腦神經元的表達達到了最高峰，其后隨時間下降，如表 1所示。
表1
PTZ誘導SE發作后不同時間點，p-DARPP-32在大鼠不同腦區表達(細胞數)
Table1.
Positive expression of p-DARPP-32 in cerebral cortex,hippocampus and neostriatum of rat brain at different time points after the onset of SE (Somas)
2.2 PTZ誘發SE發作1 h后，p-DARPP-32陽性表達神經元在大鼠前腦的分布定位
本研究選擇PTZ誘發SE發作后1 h即p-DARPP-32陽性表達最高峰時觀察p-DARPP-32在大鼠前腦的分布(見圖 1)。結果顯示在大腦皮層，陽性p-DARPP-32神經元主要分布于Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ層，和非磷酸化DARPP-32的表達分布位置基本一致，但在胞體中的表達部位略有差異。在海馬，陽性p-DARPP-32神經元主要密集分布于CA2、CA3區，散在分布于CA1、CA4及齒狀回亞區，主要表達在胞質及胞核中。在紋狀體，陽性p-DARPP-32神經元主要分布在中間棘神經元的胞質和胞核中。
圖1
PTZ誘導SE發作1 h后，陽性p-DARPP-32神經元在皮層、海馬及紋狀體區域的分布
箭頭所指示處為p-DARPP-32陽性神經元
Figure1. Distribution of p-DARPP-32 immunoreactive cell in cerebral cortex,hippocampus and neostriatum after 1 h following SE induced by PTZp-DARPP-32 immunoreactive neurons were representatively indicated by arrowheads
2.3 PTZ誘發SE發作1 h后，p-DARPP-32和DARPP-32在前腦神經元的共存情況
本研究顯示SE發作后1 h，在額、頂葉皮層Ⅲ、Ⅴ層(細胞膜)，海馬CA2及CA3區(胞質)以及紋狀體中間棘神經元(胞質、胞核)均同時檢測到密集的含有p-DARPP-32與DARPP-32陽性表達的神經元。p-DARPP-32與DARPP-32同時表達陽性即雙標陽性神經元的細胞數占p-DARPP-32或 DARPP-32單標陽性細胞數的比例在海馬區明顯高于紋狀體和皮質區(P＜0.001)(見表 2)，提示海馬區p-DARPP-32和DARPP-32共存的現象更為突出。
表2
SE發作1 h后，p-DARPP-32、DARPP-32單標及p-DARPP-32/DARPP-32雙標陽性神經元在大鼠腦皮層、紋狀體及海馬的比較*
Table2.
Comparison of p-DARPP-32 single-,DARPP-32 single- and p-DARPP-32/DARPP-32 double-labeled neurons in cerebral cortex,hippocampus and neostriatum of rat forebrains after 1 h following SE
3 討論
本研究結果顯示，PTZ誘發SE發作后p-DARPP-32表達具有一個動態時相變化過程，即發作后1~6 h，p-DARPP-32在前腦神經元的表達達到高峰，24 h后開始逐漸下降。本研究還顯示p-DARPP-32陽性表達區域主要在大鼠前腦皮層、海馬及紋狀體，與DARPP-32在前腦的分布基本一致，提示p-DARPP-32可能參與了PTZ誘導的SE急性發作。
已有研究報道PTZ誘導的癲癇模型中，位于前腦皮質、伏隔核及紋狀體等區域的細胞外多巴胺神經遞質濃度明顯升高，并且多巴胺遞質濃度的增加與所給PTZ劑量呈正性線性相關[9-10]。也有其它藥物誘發的癲癇動物模型實驗證實SE發作后內源性多巴胺神經遞質及其代謝產物水平在多個腦區內升高，并且多巴胺神經遞質最終激活D1/DARPP-32/PP-Ⅰ信息鏈導致DARPP-32磷酸化[11]。本研究結果顯示免疫熒光雙標陽性表達p-DARPP-32與DARPP-32的神經元在大鼠前腦皮層、海馬及紋狀體較為密集，提示除了DARPP-32外，p-DARPP-32也作為活性分子參與了PTZ誘導的癲癇急性發作，因此存在DARPP-32與p-DARPP-32共存現象。海馬區雙標陽性神經元的細胞數占p-DARPP-32或 DARPP-32單標陽性細胞數的比例高于紋狀體和皮質區，提示此區域共存的現象可能更明顯。
p-DARPP-32是蛋白磷酸脂酶-Ⅰ的強抑制劑,抑制蛋白磷酸脂酶-Ⅰ的去磷酸化過程[12]。當蛋白磷酸脂酶-Ⅰ磷酸化受抑制時，其下游NMDA、AMPA受體及左型Ca2+通道的磷酸化程度增加，生理效應增強，最終導致神經元興奮性增加以致癲癇發作[13-14]。有學者[15]發現新紋狀體中間棘神經元上多巴胺D1受體對來自GABA能中間神經元的抑制調節作用提高了皮層神經元的興奮性和產生突觸后神經元去極化的能力，這個過程是通過激活D1/DARPP-32/PP-Ⅰ信息傳遞鏈并靶定位在GABAA受體的亞基，減少突觸后GABAA受體離子流等一系列過程來實現的[6] 。本實驗顯示，SE發作后DARPP-32在癲癇傳導的好發區域(前腦皮層、海馬及紋狀體)神經元均存在著明顯的磷酸化表達，并且與非磷酸化的DARPP-32有著很高的共存率，提示DARPP-32的磷酸化可能通過紋狀體中間棘神經元、海馬神經元等位點參與了癲癇的調控，與Flores-Hernandez等[6]研究多巴胺D1受體對GABAA受體離子流調控路徑的結果基本吻合。
綜上所述，PTZ誘發的癲癇模型中DARPP-32磷酸化存在動態變化過程，大鼠前腦皮層、海馬及紋狀體區域p-DARPP-32和DARPP-32有較高的共存率，p-DARPP-32可能通過紋狀體中間棘神經元、海馬神經元等位點參與了癲癇的調控。
