引用本文： 張曄, 張連陽, 譚浩, 孫士錦, 李陽. 細胞骨架改構在LPS作用后VE-Cad胞吞途徑轉化中的作用. 中國普外基礎與臨床雜志, 2015, 22(3): 269-273. doi: 10.7507/1007-9424.20150073 復制
血管通透性增高即血管滲漏表現為血管對液體、血漿蛋白及大分子物質的通透性增高，導致難以糾正的組織水腫和內環境紊亂加劇，引起腹腔積液、腸壁水腫、繼發性腹內高壓、腹腔間隙綜合征、腸道細菌移位、多器官功能障礙等合并癥發生，甚至導致患者死亡[1-5]。研究血管通透性增高的發生機理有助于維持體內液體平衡，改善療效和提高生存率。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的血管通透性增高是嚴重腹部創傷后重要的病理學改變。本課題組前期對其發生機理進行了系列研究，發現血管內皮細胞鈣黏蛋白（vascular endothelial cadherin，VE-cad）在質膜上的表達下調是LPS誘導的血管通透性增高的重要原因；在LPS處理的不同時期，VE-cad的胞吞由不同的途徑介導，在早期（1 h）由網格蛋白介導，在后期（4 h后）由微囊介導，兩者共同調節LPS誘導的血管通透性增高。然而，為什么LPS處理后會出現這兩種胞吞方式？它們是如何進行轉化的？目前尚不清楚。基礎研究[6-9]提示，細胞骨架的改構可能在胞吞方式的變化中起重要作用。因此，本實驗采用免疫共沉淀和單層細胞通透性檢測技術，觀察LPS作用后細胞骨架形態的變化，細胞骨架解聚劑和穩定劑對LPS作用后網格蛋白/微囊介導的VE-Cad胞吞、VE-Cad膜表達和血管通透性的影響，以期從細胞骨架改構方面來探討LPS作用后胞吞途徑轉化的原因。
1 材料和方法
1.1 主要試劑和設備
本實驗所采用的細胞為CRL-2922人血管內皮細胞株，購自美國標準菌庫（ATCC）。主要試劑：VE-cad、網格蛋白及小窩蛋白1（caveolin-1，Cav1，微囊主要的蛋白成分）抗體均購自Santa Cruz Biotechnology公司，異硫氰酸熒光素標記的牛血清白蛋白（FITC-BSA）、FITC-次毒蕈環肽、蛋白G-瓊脂糖和LPS均購自Sigma公司，15%胎牛血清購自Gibco公司，培養小室購自Corning公司，DMEM培養基（Dulbecco’s modified Eagle’s培養基）購自HyClone公司，質膜蛋白提取試劑盒購自Abcam公司，細胞骨架解聚劑細胞松弛素D（cytochalasin D，Cyt D）和細胞骨架穩定劑Jasplakinolide（Jasp）均購自Enzo公司。設備：Leica TCS-SP共聚焦顯微鏡（Wetzlar公司，德國）。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養以及接種
將CRL-2922細胞置于含有15%胎牛血清、4 500 mg/L葡萄糖、4 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素以及100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養基中進行培養，當細胞生長至融合時進行實驗。用于免疫共沉淀和免疫印跡的細胞接種在25 mL培養瓶中，用于單層細胞通透性檢測的細胞接種在培養小室的半透膜上[10-11]。
1.2.2 LPS作用后細胞骨架形態的變化
實驗分為空白對照組、LPS-1 h組及LPS-4 h組，LPS-1 h組及LPS-4 h組用終濃度為10 μg/mL的LPS分別作用1 h和4 h后觀察細胞骨架形態，空白對照組任何時刻檢測皆可。檢測方法：取生長至融合的細胞，先用4%多聚甲醛固定30 min（37 ℃），再用0.3% Triton X-100和1% BSA透化30 min；再加入FITC-次毒蕈環肽孵育30 min（37 ℃）；最后以PBS緩沖液洗滌3次[12-13]。在Leica TCS-SP共聚焦顯微鏡下觀察細胞骨架形態變化。
1.2.3 細胞骨架解聚劑和穩定劑對LPS作用后網格
蛋白/微囊介導的VE-Cad胞吞和膜VE-Cad表達的影響 實驗分為LPS-1 h組、Cyt D+LPS-1 h組、LPS-4 h組及Jasp+LPS-4 h組。Cyt D+LPS-1 h組加入Cyt D（終濃度為2 μmol/L），Jasp+LPS-4 h組加入Jasp（終濃度為1 μmol/L），LPS的終濃度同上。實驗重復4次。分別于相應時點檢測網格蛋白/Cav1與VE-Cad的共沉淀和膜VE-Cad的表達水平。①網格蛋白/Cav1與VE-Cad的共沉淀：按常規方法收集細胞和提取細胞總蛋白，蛋白裂解液中分別加入VE-cad抗體（1∶50稀釋）和蛋白G-瓊脂糖4 ℃過夜，洗滌沉淀并煮沸分離后，采用Western blot法檢測網格蛋白/Cav1（1∶200稀釋）的表達，洗膜后檢測VE-cad的表達[14-15]，以網格蛋白或Cav1與VE-cad條帶光密度值的比值反映共沉淀水平。②膜VE-Cad的表達：收集細胞，采用質膜蛋白提取試劑盒提取胞漿和質膜蛋白（操作按試劑盒說明書進行），以Western blot法檢測質膜中VE-Cad的表達水平，以膜VE-Cad與β-actin光密度值的比值反映膜VE-Cad的表達水平。
1.2.4 細胞骨架解聚劑和穩定劑對LPS作用后血管通透性的影響
實驗分為空白對照組、LPS-1 h組、Cyt D+LPS-1 h組、LPS-4 h組及Jasp+LPS-4 h組，各物質的終濃度同上。分別于相應時點檢測單層細胞通透性（空白對照組任何時刻檢測皆可），實驗重復4次。檢測方法：取細胞生長融合的培養小室，在培養小室的上腔液中加入FITC-BSA作為示蹤劑后，在下腔液中取樣檢測熒光強度，每15分鐘取樣1次，共8次，以累積熒光透過率反映血管通透性，計算方法參考文獻[16-17]。
1.3 統計學方法
采用SPSS 10.0統計軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（
2 結果
2.1 LPS作用后細胞骨架形態的變化
空白對照組的CRL-2922細胞中肌動蛋白呈均勻散在分布，細胞骨架無明顯的聚合；LPS作用1 h時，肌動蛋白聚集呈點片狀，發生明顯聚合，可見細胞中有細長的張力絲形成；LPS作用4 h時，肌動蛋白重新顯示出散在分布的趨勢，細胞骨架解聚，張力絲幾近消失（圖 1）。
圖1
示3組CRL-2922細胞的細胞骨架形態觀察結果（共聚焦顯微鏡）。1A：空白對照組；1B：LPS-1 h組；1C：LPS-4 h組 ? ?圖 2 示
2.2 網格蛋白/Cav1與VE-Cad共沉淀和膜VE-Cad
的表達結果與LPS-1 h組比較，Cyt D+LPS-1 h組細胞網格蛋白和VE-Cad的共沉淀水平較低（P<0.05），Cav1與VE-Cad的共沉淀水平較高（P<0.05），且膜VE-Cad的表達水平降低（P<0.05）；與LPS-4 h組比較，Jasp+LPS-4 h組細胞網格蛋白和VE-Cad的共沉淀水平的差異無統計學意義（P>0.05），而Cav1與VE-Cad的共沉淀水平較低（P<0.05），且膜VE-Cad的表達水平升高（P<0.05），見圖 2和圖 3。提示在LPS作用前期（1 h時），Cyt D可抑制網格蛋白與VE-Cad的共定位，增高Cav1與VE-Cad的共定位，降低膜VE-Cad的表達；在LPS作用后期（4 h時），Jasp可抑制Cav1與VE-Cad的共定位，同時上調了膜VE-Cad的表達。
2.3 血管通透性檢測結果
與空白對照組比較，LPS-1 h組和LPS-4 h組的累積熒光透過率均較高（P<0.05）；與LPS-1 h組比較，Cyt D+LPS-1 h組的累積熒光透過率較高（P<0.05）；與LPS-4 h組比較，Jasp+LPS-4 h組的累積熒光透過率較低（P<0.05），見圖 4。提示在LPS作用前期（1 h時），Cyt D可增強血管通透性；在LPS作用后期（4 h時），Jasp可抑制血管通透性。
圖2
示5組單層細胞的累積熒光透過率結果。與正常對照組比較，# P<0.05；與LPS-1 h組比較，* P<0.05；與LPS-4 h組比較，△P<0.05
3 討論
基礎研究[6-9]表明，細胞骨架的改構可能在胞吞方式的變化中起重要作用。Engqvist-Goldstein等[6]報道，通過遺傳學或化學的方法破壞酵母皮質肌動蛋白細胞骨架后，可以抑制網格蛋白介導的胞吞功能。Yarar等[7]發現，細胞骨架解聚劑latrunculin A可使包被網格蛋白的小泡的形成數量降低80%。此外，latrunculin A可引起大量的微囊陽性的膜結構快速進入細胞[8]。Shen等[9]發現，在Madin-Darby犬腎細胞中，latrunculin A引起微囊胞吞緊密連接中的重要組成蛋白即咬合蛋白，最終導致緊密連接結構和功能的破壞。因此筆者推測，細胞骨架改構可能是LPS作用后胞吞途徑轉化的重要原因，并通過本實驗進行驗證。結果提示，與LPS-1 h組比較，Cyt D+LPS-1 h組細胞網格蛋白和VE-Cad的共沉淀水平較低，Cav1與VE-Cad的共沉淀水平較高，膜VE-Cad的表達水平降低，血管通透性升高；與LPS-4 h組比較，Cav1與VE-Cad的共沉淀水平較低，膜VE-Cad的表達水平升高，血管通透性下降。提示LPS作用后細胞骨架先發生聚合，然后解聚，這種改構促使VE-Cad胞吞途徑從由網格蛋白介導轉化為由微囊介導。
目前認為，LPS引起血管通透性增高的途徑主要有兩種：細胞間途徑和跨細胞途徑。①細胞間途徑：LPS通過刺激內皮細胞張力絲形成并收縮，導致細胞間黏附連接破壞、細胞間隙增大和血管通透性增高[18]；②跨細胞途徑：LPS通過微囊對大分子物質的直接胞吞，導致血管通透性增高[19]。最近的研究[20]認為，細胞間途徑開放是血管通透性增高的主要原因，而細胞間途徑開放主要由內皮細胞張力絲形成并收縮引起[21]。結合本實驗結果和前期結果，可以認為，在LPS作用后期（4 h后），盡管此時已發生細胞骨架的解聚，通過張力絲收縮而導致的細胞間途徑開放作用減弱，但其可以通過促使微囊介導的VE-cad胞吞，加重膜VE-cad的表達丟失，從而維持細胞間隙增大和細胞間途徑開放，導致持續的血管通透性增高。但是，細胞骨架引起網格蛋白和微囊介導這兩種胞吞方式轉化的機理如何，尚不清楚。可能與細胞骨架的結構（調節胞吞裝置在質膜中的定位）及其機械功能（操控囊泡從質膜分離、內陷和進入胞漿）有關[22-25]，尚待進一步研究。
血管通透性增高即血管滲漏表現為血管對液體、血漿蛋白及大分子物質的通透性增高，導致難以糾正的組織水腫和內環境紊亂加劇，引起腹腔積液、腸壁水腫、繼發性腹內高壓、腹腔間隙綜合征、腸道細菌移位、多器官功能障礙等合并癥發生，甚至導致患者死亡[1-5]。研究血管通透性增高的發生機理有助于維持體內液體平衡，改善療效和提高生存率。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的血管通透性增高是嚴重腹部創傷后重要的病理學改變。本課題組前期對其發生機理進行了系列研究，發現血管內皮細胞鈣黏蛋白（vascular endothelial cadherin，VE-cad）在質膜上的表達下調是LPS誘導的血管通透性增高的重要原因；在LPS處理的不同時期，VE-cad的胞吞由不同的途徑介導，在早期（1 h）由網格蛋白介導，在后期（4 h后）由微囊介導，兩者共同調節LPS誘導的血管通透性增高。然而，為什么LPS處理后會出現這兩種胞吞方式？它們是如何進行轉化的？目前尚不清楚。基礎研究[6-9]提示，細胞骨架的改構可能在胞吞方式的變化中起重要作用。因此，本實驗采用免疫共沉淀和單層細胞通透性檢測技術，觀察LPS作用后細胞骨架形態的變化，細胞骨架解聚劑和穩定劑對LPS作用后網格蛋白/微囊介導的VE-Cad胞吞、VE-Cad膜表達和血管通透性的影響，以期從細胞骨架改構方面來探討LPS作用后胞吞途徑轉化的原因。
1 材料和方法
1.1 主要試劑和設備
本實驗所采用的細胞為CRL-2922人血管內皮細胞株，購自美國標準菌庫（ATCC）。主要試劑：VE-cad、網格蛋白及小窩蛋白1（caveolin-1，Cav1，微囊主要的蛋白成分）抗體均購自Santa Cruz Biotechnology公司，異硫氰酸熒光素標記的牛血清白蛋白（FITC-BSA）、FITC-次毒蕈環肽、蛋白G-瓊脂糖和LPS均購自Sigma公司，15%胎牛血清購自Gibco公司，培養小室購自Corning公司，DMEM培養基（Dulbecco’s modified Eagle’s培養基）購自HyClone公司，質膜蛋白提取試劑盒購自Abcam公司，細胞骨架解聚劑細胞松弛素D（cytochalasin D，Cyt D）和細胞骨架穩定劑Jasplakinolide（Jasp）均購自Enzo公司。設備：Leica TCS-SP共聚焦顯微鏡（Wetzlar公司，德國）。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養以及接種
將CRL-2922細胞置于含有15%胎牛血清、4 500 mg/L葡萄糖、4 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素以及100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養基中進行培養，當細胞生長至融合時進行實驗。用于免疫共沉淀和免疫印跡的細胞接種在25 mL培養瓶中，用于單層細胞通透性檢測的細胞接種在培養小室的半透膜上[10-11]。
1.2.2 LPS作用后細胞骨架形態的變化
實驗分為空白對照組、LPS-1 h組及LPS-4 h組，LPS-1 h組及LPS-4 h組用終濃度為10 μg/mL的LPS分別作用1 h和4 h后觀察細胞骨架形態，空白對照組任何時刻檢測皆可。檢測方法：取生長至融合的細胞，先用4%多聚甲醛固定30 min（37 ℃），再用0.3% Triton X-100和1% BSA透化30 min；再加入FITC-次毒蕈環肽孵育30 min（37 ℃）；最后以PBS緩沖液洗滌3次[12-13]。在Leica TCS-SP共聚焦顯微鏡下觀察細胞骨架形態變化。
1.2.3 細胞骨架解聚劑和穩定劑對LPS作用后網格
蛋白/微囊介導的VE-Cad胞吞和膜VE-Cad表達的影響 實驗分為LPS-1 h組、Cyt D+LPS-1 h組、LPS-4 h組及Jasp+LPS-4 h組。Cyt D+LPS-1 h組加入Cyt D（終濃度為2 μmol/L），Jasp+LPS-4 h組加入Jasp（終濃度為1 μmol/L），LPS的終濃度同上。實驗重復4次。分別于相應時點檢測網格蛋白/Cav1與VE-Cad的共沉淀和膜VE-Cad的表達水平。①網格蛋白/Cav1與VE-Cad的共沉淀：按常規方法收集細胞和提取細胞總蛋白，蛋白裂解液中分別加入VE-cad抗體（1∶50稀釋）和蛋白G-瓊脂糖4 ℃過夜，洗滌沉淀并煮沸分離后，采用Western blot法檢測網格蛋白/Cav1（1∶200稀釋）的表達，洗膜后檢測VE-cad的表達[14-15]，以網格蛋白或Cav1與VE-cad條帶光密度值的比值反映共沉淀水平。②膜VE-Cad的表達：收集細胞，采用質膜蛋白提取試劑盒提取胞漿和質膜蛋白（操作按試劑盒說明書進行），以Western blot法檢測質膜中VE-Cad的表達水平，以膜VE-Cad與β-actin光密度值的比值反映膜VE-Cad的表達水平。
1.2.4 細胞骨架解聚劑和穩定劑對LPS作用后血管通透性的影響
實驗分為空白對照組、LPS-1 h組、Cyt D+LPS-1 h組、LPS-4 h組及Jasp+LPS-4 h組，各物質的終濃度同上。分別于相應時點檢測單層細胞通透性（空白對照組任何時刻檢測皆可），實驗重復4次。檢測方法：取細胞生長融合的培養小室，在培養小室的上腔液中加入FITC-BSA作為示蹤劑后，在下腔液中取樣檢測熒光強度，每15分鐘取樣1次，共8次，以累積熒光透過率反映血管通透性，計算方法參考文獻[16-17]。
1.3 統計學方法
采用SPSS 10.0統計軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（
2 結果
2.1 LPS作用后細胞骨架形態的變化
空白對照組的CRL-2922細胞中肌動蛋白呈均勻散在分布，細胞骨架無明顯的聚合；LPS作用1 h時，肌動蛋白聚集呈點片狀，發生明顯聚合，可見細胞中有細長的張力絲形成；LPS作用4 h時，肌動蛋白重新顯示出散在分布的趨勢，細胞骨架解聚，張力絲幾近消失（圖 1）。
圖1
示3組CRL-2922細胞的細胞骨架形態觀察結果（共聚焦顯微鏡）。1A：空白對照組；1B：LPS-1 h組；1C：LPS-4 h組 ? ?圖 2 示
2.2 網格蛋白/Cav1與VE-Cad共沉淀和膜VE-Cad
的表達結果與LPS-1 h組比較，Cyt D+LPS-1 h組細胞網格蛋白和VE-Cad的共沉淀水平較低（P<0.05），Cav1與VE-Cad的共沉淀水平較高（P<0.05），且膜VE-Cad的表達水平降低（P<0.05）；與LPS-4 h組比較，Jasp+LPS-4 h組細胞網格蛋白和VE-Cad的共沉淀水平的差異無統計學意義（P>0.05），而Cav1與VE-Cad的共沉淀水平較低（P<0.05），且膜VE-Cad的表達水平升高（P<0.05），見圖 2和圖 3。提示在LPS作用前期（1 h時），Cyt D可抑制網格蛋白與VE-Cad的共定位，增高Cav1與VE-Cad的共定位，降低膜VE-Cad的表達；在LPS作用后期（4 h時），Jasp可抑制Cav1與VE-Cad的共定位，同時上調了膜VE-Cad的表達。
2.3 血管通透性檢測結果
與空白對照組比較，LPS-1 h組和LPS-4 h組的累積熒光透過率均較高（P<0.05）；與LPS-1 h組比較，Cyt D+LPS-1 h組的累積熒光透過率較高（P<0.05）；與LPS-4 h組比較，Jasp+LPS-4 h組的累積熒光透過率較低（P<0.05），見圖 4。提示在LPS作用前期（1 h時），Cyt D可增強血管通透性；在LPS作用后期（4 h時），Jasp可抑制血管通透性。
圖2
示5組單層細胞的累積熒光透過率結果。與正常對照組比較，# P<0.05；與LPS-1 h組比較，* P<0.05；與LPS-4 h組比較，△P<0.05
3 討論
基礎研究[6-9]表明，細胞骨架的改構可能在胞吞方式的變化中起重要作用。Engqvist-Goldstein等[6]報道，通過遺傳學或化學的方法破壞酵母皮質肌動蛋白細胞骨架后，可以抑制網格蛋白介導的胞吞功能。Yarar等[7]發現，細胞骨架解聚劑latrunculin A可使包被網格蛋白的小泡的形成數量降低80%。此外，latrunculin A可引起大量的微囊陽性的膜結構快速進入細胞[8]。Shen等[9]發現，在Madin-Darby犬腎細胞中，latrunculin A引起微囊胞吞緊密連接中的重要組成蛋白即咬合蛋白，最終導致緊密連接結構和功能的破壞。因此筆者推測，細胞骨架改構可能是LPS作用后胞吞途徑轉化的重要原因，并通過本實驗進行驗證。結果提示，與LPS-1 h組比較，Cyt D+LPS-1 h組細胞網格蛋白和VE-Cad的共沉淀水平較低，Cav1與VE-Cad的共沉淀水平較高，膜VE-Cad的表達水平降低，血管通透性升高；與LPS-4 h組比較，Cav1與VE-Cad的共沉淀水平較低，膜VE-Cad的表達水平升高，血管通透性下降。提示LPS作用后細胞骨架先發生聚合，然后解聚，這種改構促使VE-Cad胞吞途徑從由網格蛋白介導轉化為由微囊介導。
目前認為，LPS引起血管通透性增高的途徑主要有兩種：細胞間途徑和跨細胞途徑。①細胞間途徑：LPS通過刺激內皮細胞張力絲形成并收縮，導致細胞間黏附連接破壞、細胞間隙增大和血管通透性增高[18]；②跨細胞途徑：LPS通過微囊對大分子物質的直接胞吞，導致血管通透性增高[19]。最近的研究[20]認為，細胞間途徑開放是血管通透性增高的主要原因，而細胞間途徑開放主要由內皮細胞張力絲形成并收縮引起[21]。結合本實驗結果和前期結果，可以認為，在LPS作用后期（4 h后），盡管此時已發生細胞骨架的解聚，通過張力絲收縮而導致的細胞間途徑開放作用減弱，但其可以通過促使微囊介導的VE-cad胞吞，加重膜VE-cad的表達丟失，從而維持細胞間隙增大和細胞間途徑開放，導致持續的血管通透性增高。但是，細胞骨架引起網格蛋白和微囊介導這兩種胞吞方式轉化的機理如何，尚不清楚。可能與細胞骨架的結構（調節胞吞裝置在質膜中的定位）及其機械功能（操控囊泡從質膜分離、內陷和進入胞漿）有關[22-25]，尚待進一步研究。
