目的 建立能穩定分泌人內皮抑素(hES)的基因工程細胞系，觀察內皮抑素（ES）蛋白和hES的表達。方法 以hES重組質粒pcDNA3.0（pcDNA3-Endo）為模板，通過逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)擴增獲得hES基因片段，且在基因前加信號肽序列，將其定向插入真核表達載體綠色熒光蛋白（pEGFP-N1)）質粒中，獲得重組質粒pEGFP-N1-ES；利用陽離子脂質體介導將其轉染到人胚胎腎細胞(HeK-293)細胞中, G418 篩選后得到陽性克隆hES/293，采用蛋白免疫印跡(Western blot)法檢測轉染細胞上清中ES蛋白的表達；用海澡酸鈉殼聚糖(ACA)微囊包裹hES/293細胞，分別收集培養3、7、21、35 d的ACA微囊化hES/293細胞的培養上清液，Western blot法檢測包裹后培養液上清中hES的表達。結果 重組質粒pEGFP-N1-ES經限制性核對內切酶HindⅢ和限制性核酸內切酶BamHⅠ雙酶切得到4700堿基對(bp)和600 bp 2條帶；PCR擴增出600 bp條帶；測序結果與NCBI上序列比對軟件（BLAST）比對，同源性達到100%。pEGFP-N1-ES轉染HeK-293細胞，經G418 篩選后獲得陽性克隆，選取篩選的10株單克隆細胞培養上清液進行Western blot分析，在相對分子質量為20 times;103 處出現蛋白條帶。在ACA微囊內hES/293細胞隨著培養時間的延長，細胞團逐漸長大，充滿整個囊內空間。培養3、7、21、35 d時，在相對分子質量為20 times;103處出現蛋白條帶。結論 重組pEGFP-N1-ES真核表達載體構建正確，轉染HeK-293細胞后可有效的表達hES蛋白，并能分泌到細胞外；微囊化hES/293細胞產生的ES蛋白可以自由擴散出微囊膜外，并呈持續性表達。
引用本文： 蔡善君,詹文芳,劉銳,謝兵,李紅,宿罡. 分泌人內皮抑素的微囊化基因工程細胞系的構建. 中華眼底病雜志, 2010, 26(4): 367-371. doi: 復制