引用本文： 梁澤玉, 陳松, 張惟, 何廣輝, 王俊華, 高翔, 武斌. 人臍帶間充質干細胞源性微囊泡對高糖誘導下大鼠視網膜神經節細胞損傷的保護作用及機制. 中華眼底病雜志, 2018, 34(6): 568-574. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2018.06.009 復制
高糖、缺氧、高滲透壓等應激因素可通過激活視網膜神經節細胞（RGC）內活性氧/絲裂原活化蛋白激酶等相關信號通路，導致促凋亡因子Bax、Bad等與抗凋亡因子B淋巴細胞瘤（Bcl）-2基因、Bcl-x等比例失衡，活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspases），從而引起細胞內線粒體損傷，啟動級聯放大式的細胞凋亡程序，產生不可逆性的RGC損傷 [1-3]。大量基礎研究結果已證實，間充質干細胞（MSC）可通過旁分泌途徑以細胞外囊泡（EV）的形式發揮對組織直接或間接的修復作用[4-9]。EV是從細胞主動分泌的外泌體或從細胞膜表面直接出芽脫落形成的胞膜微囊泡（MV）或凋亡小體，其中MV是細胞在正常或病理狀態下從細胞膜表面出芽脫落形成的雙層胞膜結構的囊泡樣物質，直徑100～1000 nm，在細胞間通訊、凋亡、炎癥、修復等方面發揮作用[10]。現已有多項研究表明MSC-MV具有減輕組織損傷的作用[11-13]。為驗證這一結論，我們觀察探討了人臍帶MSC-MV（hUMSC-MV）對高糖誘導下大鼠RGC損傷的保護作用及機制。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 主要實驗材料及原代大鼠RGC分離培養、鑒定
出生1～3 d、體重6.5～9.0 g的Sprague-Dawley雄性大鼠32只購自天津醫科大學動物中心。hUMSC由中國醫學科學院血液學研究所惠贈。多聚L賴氨酸預包被細胞6孔培養板（德國Greiner Bio-one公司）；羥乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）、Dulbecco改良Eagle（DMEM）/F12低糖培養基、胎牛血清、Neurobasal/B27神經元培養基（美國Gibco公司）；胰蛋白酶（美國Amresco公司）；Trizol RNA逆轉錄試劑盒（美國Invitrogen公司）；苯基吲哚（DAPI）、PKH26試劑盒（美國Sigma公司）；小鼠抗大鼠Thy-1一抗（美國Chemicon公司）；羊抗鼠Brn-3a一抗、熒光素異硫氰酸酯（FITC）標記兔抗鼠IgG二抗、Cy3標記兔抗羊IgG二抗（美國Santa Cruz公司）；FITC標記抗人CD44、CD29、CD73、CD105、CD49f、第二型人類白血球抗原（HLA-DR）、CD34、CD45抗體（美國eBioscience公司）；兔抗鼠B-細胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bax、半胱天冬蛋白酶（Caspase）-3、裂解的Caspase-3一抗抗體，羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶（HRP）二抗（英國Abcam公司）。聚偏氟乙烯（PVDF）膜（美國Roche公司）；細胞計數CCK-8試劑盒、膜聯蛋白（Annexin）Ⅴ/碘化丙啶（PI）凋亡試劑盒（日本株式會社同仁化學研究所）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒（北京碧云天生物技術公司）。手術顯微鏡（德國Zeiss公司）；超速低溫離心機、流式細胞儀（美國Beckman公司）。RNA引物由天津博奧科生物公司合成。其余試劑均購自天津博奧科生物公司。
參照文獻[14]的方法分離培養原代大鼠RGC。完整分離視網膜神經上皮層置于含100 U/ml青霉素及鏈霉素的磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗，于37 ℃細胞培養箱內用0.125%胰蛋白酶消化15～20 min，加入適量含10%胎牛血清DMEM/F12培養基終止消化，輕微吹打，4 ℃ 200×g離心3 min，棄上清液后加入Neurobasal/B27神經元培養基（Neurobasal+B27+0.5 mmol/L谷氨酰胺），吹打成細胞懸液，調整細胞密度為5×105個/ml后接種于多聚賴氨酸包被的6孔細胞培養板內，每孔細胞懸液2 ml，置于37 ℃、5%CO2溫箱內培養24 h后更換新鮮Neurobasal/B27 培養基。倒置顯微鏡下觀察細胞密度及細胞貼壁情況。
采用免疫熒光法鑒定原代大鼠RGC。預冷PBS浸泡細胞3 min，4%多聚甲醛冰上固定20 min，PBS清洗3次，5 min/次，10%牛血清白蛋白室溫下封閉20 min后加入小鼠抗大鼠Thy-1一抗，兔抗大鼠Brn-3a（1：500）4 ℃過夜，PBS再次清洗3次，5 min/次，避光下加入FITC標記的兔抗小鼠熒光二抗IgG、Cy3標記的羊抗兔熒光二抗IgG（1：100），室溫孵育1 h。PBS避光搖動清洗3次，5 min/次。加入DAPI染液，室溫孵育4 min，PBS洗滌3次，5 min/次。避光晾干封片后熒光顯微鏡下觀察細胞情況。
1.2 hUMSC-MV提取、鑒定以及大鼠RGC與hUMSC-MV內化過程
參照文獻[15]的超速離心法收集hUMSC-MV。復蘇hUMSC后以細胞密度1×105個/ml接種于6孔細胞培養板，待細胞鋪滿孔底約80%后，0.25%胰蛋白酶+0.02%乙二胺四乙酸消化細胞后以1：2傳代，收集2～7代狀態良好的hUMSC上清液，4 ℃下400×g離心10 min，取上清液后再以2000×g離心20 min，取上清液轉移至超速離心管中，4 ℃下20 000 ×g離心1 h后去上清液，加入DMEM/F12培養基（1：1）及25 mmol/L HEPES緩沖液后再次4 ℃ 20 000 ×g離心1 h，得到的白色沉淀即為hUMSC-MV。500 μl PBS重懸沉淀，部分hUMSC-MV經多聚甲醛固定，剩余hUMSC-MV轉移至無菌離心管中進行后續實驗或?80 ℃冰箱中保存備用。
流式細胞儀檢測MV大小及表型。0.5 ml PBS重懸hUMSC-MV，加入FITC標記的CD44、CD29、CD73、CD105、CD49f、HLA-DR、CD34、CD45等表面分子。孔徑2 nm的載樣銅網固定于支架上，滴加20 μl hUMSC-MV懸液，室溫靜置3 min。濾紙從銅網側邊吸干液體，3%磷鎢酸溶液30 μl室溫環境下負染hUMSC-MV 5 min。濾紙吸干負染液，將銅網置于透射電子顯微鏡的樣品室內，觀察hUMSC-MV的形態并拍照。BCA試劑盒測量hUMSC-MV蛋白含量。
配置蛋白濃度為50 μg/ml的hUMSC-MV PBS重懸液1 ml，加入100 μg/ml的PKH26 4 μl，混勻后4 ℃孵育1 h，4 ℃ 10 000×g離心1 h后去上清液，加入1 ml PBS重懸。RGC棄上清液后加入1滴濃度為5 μg/ml DAPI室溫著染15 min，PBS清洗3次后加入1 ml上述PKH26標記的hUMSC-MV，繼續培養6 h，棄上清液，加入新鮮Neurobasal/B27神經元培養液。熒光顯微鏡下觀察、拍照。
1.3 實驗分組以及hUMSC-MV對高糖環境下大鼠RGC活性及凋亡的影響
實驗分為正常RGC對照組（A組）、高糖對照組（B組）、正常共培養組（C組）、高糖共培養組（D組）進行。A組細胞正常培養，B組細胞為33 mmol/L葡萄糖培養，C組細胞為hUMSC-MV培養，D組細胞為33 mmol/L葡萄糖、hUMSC-MV共培養。Neurobasal/B27神經元培養液內加入hUMSC-MV至終濃度50 μg/ml。觀察時間點為RGC與hUMSC-MV共培養后48 h。實驗重復3次，取其均值。
采用CCK-8試劑盒測定各組RGC活性。各組細胞棄上清液后每孔加入10 μl CCK-8試劑孵育4 h，酶標儀測定450 nm處的吸光度[A，舊稱光密度（OD）]值。細胞活性（%）=（A干預?A空白對照）/（A0干預?A空白對照）×100%，其中A0干預為具有RGC、CCK溶液而未加hUMSC-MV的A值。采用AnnexinⅤ/PI雙染法測量各組RGC凋亡率。酶解細胞后低速離心棄上清液，PBS漂洗后200×g離心5 min，500 μl結合緩沖液重懸，加入5 μl AnnexinⅤ-FITC溶液和5 μl PI溶液，輕輕振蕩混勻。室溫避光反應15 min，1 h內上機檢測細胞凋亡率。
1.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應（RT-PCR）及蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測
采用RT-PCR檢測各組RGC內Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA表達。以磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）為內參照，按照Trizol試劑盒說明書提取細胞總RNA，Premier 5.0軟件設計正向、反向引物（表1）。反應條件為95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，重復40個循環。變性、退火、延伸重復45個循環。將得到的各組循環閾值（Ct值）數據與內參照GAPDH分析處理后，采用RQ= 2?△△Ct法計算各目的基因的相對表達量。
表1
Bcl-2、Bax、Caspase-3、GAPDH基因擴增和測序引物
采用Western blot檢測各組RGC內Bcl-2、Bax、裂解的Caspase-3、Caspase-3蛋白表達。各組細胞棄上清液，加入預冷PBS清洗后，加入適量RIPA充分裂解細胞，BCA測量細胞內總蛋白。取40 μg樣品100 ℃水浴加熱3～5 min以充分變性蛋白。冷卻至室溫后加入15%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將蛋白轉移到PVDF膜上。PVDF膜做好標記后于5%脫脂奶粉25 ml中室溫封閉1 h，洗膜緩沖液（TBST）漂洗3次，10 min/次。分別加入兔抗鼠抗Bcl-2、Bax、裂解的Caspase-3抗體。混勻后4 ℃平搖過夜。再加入羊抗兔IgG-HRP二抗，混勻后4 ℃平搖1 h，TBST漂洗3次。取出PVDF膜后用增強化學發光A、B液反復吹洗5 min后置于曝光夾中用塑料薄膜封好，暗室中曝光30 s～5 min后顯影并定影。以β-肌動蛋白作為內參照。膠片經激光光密度圖像掃描儀掃描圖像并用Quantity One分析軟件進行圖像分析，測得各個條帶的灰度值。將目的條帶的灰度值與對應內參的灰度值相比較，得出相對表達量，所得數據取平均值。
1.5 統計學方法
采用SPSS 22.0軟進行統計分析，計量資料采用均數±標準差（
）表示，數據均行正態分布及方差齊性檢驗。符合正態分布及方差齊，各組計量資料統計分析采用單因素方差分析。組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
原代大鼠RGC于24～36 h可完全貼壁。倒置顯微鏡觀察發現，RGC細胞核居中，胞體清晰，培養3～5 d后長出少許短小神經元突起，呈多角狀（圖1A）；6～7 d RGC神經突起間接觸；7～8 d后RGC融合率達到70%。免疫熒光雙染法結果顯示，RGC細胞質內Thy-1表達陽性，細胞核內Brn-3a表達陽性（圖1B）。
圖1
原代大鼠RGC及hUMSC-MV鑒定像。1A.原代大鼠RGC倒置顯微鏡像，RGC胞體清晰，培養3～5 d后長出少許短小神經元多角狀突起 ×200；1B.原代大鼠RGC免疫熒光鑒定像，RGC細胞質、短小突觸及細胞核可見Thy-1及Brn-3a免疫熒光雙染，細胞核DAPI藍色染色陽性 Thy-1+Brn-3a雙染 ×100；1C.hUMSC-MV透射電子顯微鏡像。hUMSC-MV為單個或少許成簇的圓形膜性囊泡樣結構 磷鎢酸 標尺：300 μm1C.hUMSC-MV透射電子顯微鏡像。hUMSC-MV為單個或少許成簇的圓形膜性囊泡樣結構 磷鎢酸 標尺：300 μm
透射電子顯微鏡觀察發現，hUMSC-MV為單個或少許成簇的圓形膜性囊泡樣結構，直徑約100～1000 nm不等（圖1B）。流式細胞儀檢測結果顯示，hUMSC-MV多聚集在102～103 nm直徑范圍（圖2）。
圖2
hUMSC-MV流式細胞儀檢測像。hUMSC-MV多聚集在102～103 nm直徑范圍
流式細胞儀分析結果顯示，hUMSC-MV表面高表達CD44、CD29、CD73、CD105，陰性表達CD49f、HLA-DR、CD34、CD45（圖3）。BCA法測量結果顯示，hUMSC-MV蛋白含量約為（80.12±0.44）μg。
圖3
hUMSC-MV流式細胞儀分析像。hUMSC-MV表面高表達CD44、CD29、CD73、CD105、CD90，陰性表達CD49f、HLA-DR、CD34、CD45
熒光顯微鏡觀察發現，hUMSC-MV與RGC共培養6 h后，RGC內細胞核呈藍色熒光著染，細胞質內大量點狀紅色熒光，RGC可與hUMSC-MV良好內化（圖4）。
圖4
hUMSC-MV與RGC內化熒光顯微鏡像。4A.PKH26熒光標記hUMSC-MV；4B.RGC細胞核DAPI染色；4C.hUMSC-MV進入RGC內化 標尺：20 μm
A～D組細胞活性率分別為（92.33±2.51）%、（62.00±3.61）%、（90.33±0.58）%、（76.67±1.53）%，細胞凋亡率分別為（11.33±1.53）%、（44.67±1.53）%、（10.33±1.51）%、（23.00±1.00）%。4組細胞活性及凋亡率比較，差異均有統計學意義（F=107.92、382.11，P=0.000、0.000）。組間兩兩比較結果顯示，B組細胞活性低于A、C、D組，B組細胞凋亡率高于A、C、D組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。
RT-PCR檢測結果顯示，4組RGC內Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA表達比較，差異有統計學意義（F=219.79、339.198、1 071.21，P=0.000、0.000、0.000）。組間兩兩比較結果顯示，B、D組RGC內Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA表達高于A、C組，差異有統計學意義；D組RGC內Bcl-2 mRNA表達高于B組，差異有統計學意義（P＜0.05）；B組Bax、Caspase-3 mRNA表達高于D組，差異有統計學意義（P＜0.05）（圖5）。
圖5
各組細胞凋亡相關基因mRNA表達比較
Western blot檢測結果顯示，4組RGC內Bcl-2、Bax、裂解的Caspase-3、Caspase-3蛋白表達比較，差異有統計學意義（F=544.28、295.79、533.18、224.75，P=0.000、0.000、0.000、0.000）。組間兩兩比較結果顯示，B、D組RGC內Bcl-2、Bax、裂解的Caspase-3、Caspase-3蛋白表達高于A、C組，差異有統計學意義（P＜0.05）；D組RGC內Bcl-2蛋白表達高于B組，差異有統計學意義（P＜0.05）；B組Bax、Caspase-3蛋白表達高于D組，差異有統計學意義（P＜0.05）（圖6）。
圖6
各組細胞凋亡相關蛋白表達比較
3 討論
MV是以細胞出芽方式分泌，由磷脂轉運酶、反轉酶等酶類參與，釋放過程包括細胞膜內層磷脂酰絲氨酸非對稱分布及細胞骨架的再分配[16-18]。Kanada等[19]發現，MV轉運細胞內生信物質更為高效，其通過內化形式可完整進入靶細胞內，防止母細胞內核酸、蛋白質等生信物質在非正常亞細胞定位的降解。因此，本研究選用了具有體積較大、相對較低超離速度及時間、較為完整的細胞外囊膜完整性、更為有效的生信物質轉運率的MV為研究對象，觀察hUMSC-MV對高糖誘導下大鼠RGC損傷的保護作用并初步探討其機制。
我們采用超速離心法成功提取hUMSC-MV，透射電子顯微鏡下觀察到hUMSC-MV為單個或聚集成簇的完整圓形膜性囊泡樣結構，直徑約100～1000 nm不等。通過流式細胞儀分析發現，hUMSC-MV在直徑102～103 nm范圍內呈柱樣聚集；其表面高表達CD44、CD29、CD73、CD105，陰性表達CD49f、HLA-DR、CD34、CD45，與文獻報道結果一致[20-22]。hUMSC-MV與大鼠RGC共培養后RGC內可見大量點狀紅色熒光，證明hUMSC-MV可與大鼠RGC良好內化。CCK-8細胞活性檢測及AnnexinⅤ/PI雙染法細胞凋亡檢測結果表明，高糖環境可降低大鼠RGC的細胞活性，誘導細胞凋亡，高糖刺激RGC內凋亡相關基因Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA及蛋白表達。hUMSC-MV與大鼠RGC共培養后可增加大鼠RGC活性，降低細胞凋亡率；RGC內Bcl-2表達增加，Bax、Caspase-3表達降低，并降低Caspase-3的裂解活化。據此我們認為，高糖環境作為對RGC的損傷因素，通過誘導細胞內凋亡相關基因Bcl-2、Bax、Caspase-3的表達導致RGC活性下降或凋亡；hUMSC-MV可通過與RGC內化的作用形式干預細胞內凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的表達及Caspase-3活化，從而發揮對RGC細胞損傷的保護。目前關于干細胞源性MV在神經損傷方面的作用多集中于中樞神經系統。Baulch等[23]發現，通過脊髓移植神經干細胞源性MV可改善大鼠接受放射治療后行為認知功能的損傷。脂肪MSC源性MV在低濃度范圍內可發揮對神經細胞的保護作用，高濃度范圍對神經細胞的保護作用減弱[13]。上述研究結果與本研究結果類似，提示干細胞源性MV均有修復神經細胞損傷的作用。
本研究立足于hUMSC研究現狀，以hUMSC-MV為介質為視網膜神經組織損傷的治療提供一定的理論依據。但本研究缺陷在于為體外實驗，僅觀察單一濃度、單一時間點的hUMSC-MV對RGC的作用，并未進一步分析hUMSC-MV內的具體生物信息物質對RGC內凋亡相關信號通路的影響。在今后進一步研究中，擬進行hUMSC-MV不同濃度梯度對糖尿病視網膜病變動物模型的作用，著重于探討hUMSC-MV對視網膜神經組織保護作用的作用靶點及信號通路。
高糖、缺氧、高滲透壓等應激因素可通過激活視網膜神經節細胞（RGC）內活性氧/絲裂原活化蛋白激酶等相關信號通路，導致促凋亡因子Bax、Bad等與抗凋亡因子B淋巴細胞瘤（Bcl）-2基因、Bcl-x等比例失衡，活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspases），從而引起細胞內線粒體損傷，啟動級聯放大式的細胞凋亡程序，產生不可逆性的RGC損傷 [1-3]。大量基礎研究結果已證實，間充質干細胞（MSC）可通過旁分泌途徑以細胞外囊泡（EV）的形式發揮對組織直接或間接的修復作用[4-9]。EV是從細胞主動分泌的外泌體或從細胞膜表面直接出芽脫落形成的胞膜微囊泡（MV）或凋亡小體，其中MV是細胞在正常或病理狀態下從細胞膜表面出芽脫落形成的雙層胞膜結構的囊泡樣物質，直徑100～1000 nm，在細胞間通訊、凋亡、炎癥、修復等方面發揮作用[10]。現已有多項研究表明MSC-MV具有減輕組織損傷的作用[11-13]。為驗證這一結論，我們觀察探討了人臍帶MSC-MV（hUMSC-MV）對高糖誘導下大鼠RGC損傷的保護作用及機制。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 主要實驗材料及原代大鼠RGC分離培養、鑒定
出生1～3 d、體重6.5～9.0 g的Sprague-Dawley雄性大鼠32只購自天津醫科大學動物中心。hUMSC由中國醫學科學院血液學研究所惠贈。多聚L賴氨酸預包被細胞6孔培養板（德國Greiner Bio-one公司）；羥乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）、Dulbecco改良Eagle（DMEM）/F12低糖培養基、胎牛血清、Neurobasal/B27神經元培養基（美國Gibco公司）；胰蛋白酶（美國Amresco公司）；Trizol RNA逆轉錄試劑盒（美國Invitrogen公司）；苯基吲哚（DAPI）、PKH26試劑盒（美國Sigma公司）；小鼠抗大鼠Thy-1一抗（美國Chemicon公司）；羊抗鼠Brn-3a一抗、熒光素異硫氰酸酯（FITC）標記兔抗鼠IgG二抗、Cy3標記兔抗羊IgG二抗（美國Santa Cruz公司）；FITC標記抗人CD44、CD29、CD73、CD105、CD49f、第二型人類白血球抗原（HLA-DR）、CD34、CD45抗體（美國eBioscience公司）；兔抗鼠B-細胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bax、半胱天冬蛋白酶（Caspase）-3、裂解的Caspase-3一抗抗體，羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶（HRP）二抗（英國Abcam公司）。聚偏氟乙烯（PVDF）膜（美國Roche公司）；細胞計數CCK-8試劑盒、膜聯蛋白（Annexin）Ⅴ/碘化丙啶（PI）凋亡試劑盒（日本株式會社同仁化學研究所）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒（北京碧云天生物技術公司）。手術顯微鏡（德國Zeiss公司）；超速低溫離心機、流式細胞儀（美國Beckman公司）。RNA引物由天津博奧科生物公司合成。其余試劑均購自天津博奧科生物公司。
參照文獻[14]的方法分離培養原代大鼠RGC。完整分離視網膜神經上皮層置于含100 U/ml青霉素及鏈霉素的磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗，于37 ℃細胞培養箱內用0.125%胰蛋白酶消化15～20 min，加入適量含10%胎牛血清DMEM/F12培養基終止消化，輕微吹打，4 ℃ 200×g離心3 min，棄上清液后加入Neurobasal/B27神經元培養基（Neurobasal+B27+0.5 mmol/L谷氨酰胺），吹打成細胞懸液，調整細胞密度為5×105個/ml后接種于多聚賴氨酸包被的6孔細胞培養板內，每孔細胞懸液2 ml，置于37 ℃、5%CO2溫箱內培養24 h后更換新鮮Neurobasal/B27 培養基。倒置顯微鏡下觀察細胞密度及細胞貼壁情況。
采用免疫熒光法鑒定原代大鼠RGC。預冷PBS浸泡細胞3 min，4%多聚甲醛冰上固定20 min，PBS清洗3次，5 min/次，10%牛血清白蛋白室溫下封閉20 min后加入小鼠抗大鼠Thy-1一抗，兔抗大鼠Brn-3a（1：500）4 ℃過夜，PBS再次清洗3次，5 min/次，避光下加入FITC標記的兔抗小鼠熒光二抗IgG、Cy3標記的羊抗兔熒光二抗IgG（1：100），室溫孵育1 h。PBS避光搖動清洗3次，5 min/次。加入DAPI染液，室溫孵育4 min，PBS洗滌3次，5 min/次。避光晾干封片后熒光顯微鏡下觀察細胞情況。
1.2 hUMSC-MV提取、鑒定以及大鼠RGC與hUMSC-MV內化過程
參照文獻[15]的超速離心法收集hUMSC-MV。復蘇hUMSC后以細胞密度1×105個/ml接種于6孔細胞培養板，待細胞鋪滿孔底約80%后，0.25%胰蛋白酶+0.02%乙二胺四乙酸消化細胞后以1：2傳代，收集2～7代狀態良好的hUMSC上清液，4 ℃下400×g離心10 min，取上清液后再以2000×g離心20 min，取上清液轉移至超速離心管中，4 ℃下20 000 ×g離心1 h后去上清液，加入DMEM/F12培養基（1：1）及25 mmol/L HEPES緩沖液后再次4 ℃ 20 000 ×g離心1 h，得到的白色沉淀即為hUMSC-MV。500 μl PBS重懸沉淀，部分hUMSC-MV經多聚甲醛固定，剩余hUMSC-MV轉移至無菌離心管中進行后續實驗或?80 ℃冰箱中保存備用。
流式細胞儀檢測MV大小及表型。0.5 ml PBS重懸hUMSC-MV，加入FITC標記的CD44、CD29、CD73、CD105、CD49f、HLA-DR、CD34、CD45等表面分子。孔徑2 nm的載樣銅網固定于支架上，滴加20 μl hUMSC-MV懸液，室溫靜置3 min。濾紙從銅網側邊吸干液體，3%磷鎢酸溶液30 μl室溫環境下負染hUMSC-MV 5 min。濾紙吸干負染液，將銅網置于透射電子顯微鏡的樣品室內，觀察hUMSC-MV的形態并拍照。BCA試劑盒測量hUMSC-MV蛋白含量。
配置蛋白濃度為50 μg/ml的hUMSC-MV PBS重懸液1 ml，加入100 μg/ml的PKH26 4 μl，混勻后4 ℃孵育1 h，4 ℃ 10 000×g離心1 h后去上清液，加入1 ml PBS重懸。RGC棄上清液后加入1滴濃度為5 μg/ml DAPI室溫著染15 min，PBS清洗3次后加入1 ml上述PKH26標記的hUMSC-MV，繼續培養6 h，棄上清液，加入新鮮Neurobasal/B27神經元培養液。熒光顯微鏡下觀察、拍照。
1.3 實驗分組以及hUMSC-MV對高糖環境下大鼠RGC活性及凋亡的影響
實驗分為正常RGC對照組（A組）、高糖對照組（B組）、正常共培養組（C組）、高糖共培養組（D組）進行。A組細胞正常培養，B組細胞為33 mmol/L葡萄糖培養，C組細胞為hUMSC-MV培養，D組細胞為33 mmol/L葡萄糖、hUMSC-MV共培養。Neurobasal/B27神經元培養液內加入hUMSC-MV至終濃度50 μg/ml。觀察時間點為RGC與hUMSC-MV共培養后48 h。實驗重復3次，取其均值。
采用CCK-8試劑盒測定各組RGC活性。各組細胞棄上清液后每孔加入10 μl CCK-8試劑孵育4 h，酶標儀測定450 nm處的吸光度[A，舊稱光密度（OD）]值。細胞活性（%）=（A干預?A空白對照）/（A0干預?A空白對照）×100%，其中A0干預為具有RGC、CCK溶液而未加hUMSC-MV的A值。采用AnnexinⅤ/PI雙染法測量各組RGC凋亡率。酶解細胞后低速離心棄上清液，PBS漂洗后200×g離心5 min，500 μl結合緩沖液重懸，加入5 μl AnnexinⅤ-FITC溶液和5 μl PI溶液，輕輕振蕩混勻。室溫避光反應15 min，1 h內上機檢測細胞凋亡率。
1.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應（RT-PCR）及蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測
采用RT-PCR檢測各組RGC內Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA表達。以磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）為內參照，按照Trizol試劑盒說明書提取細胞總RNA，Premier 5.0軟件設計正向、反向引物（表1）。反應條件為95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，重復40個循環。變性、退火、延伸重復45個循環。將得到的各組循環閾值（Ct值）數據與內參照GAPDH分析處理后，采用RQ= 2?△△Ct法計算各目的基因的相對表達量。
表1
Bcl-2、Bax、Caspase-3、GAPDH基因擴增和測序引物
采用Western blot檢測各組RGC內Bcl-2、Bax、裂解的Caspase-3、Caspase-3蛋白表達。各組細胞棄上清液，加入預冷PBS清洗后，加入適量RIPA充分裂解細胞，BCA測量細胞內總蛋白。取40 μg樣品100 ℃水浴加熱3～5 min以充分變性蛋白。冷卻至室溫后加入15%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將蛋白轉移到PVDF膜上。PVDF膜做好標記后于5%脫脂奶粉25 ml中室溫封閉1 h，洗膜緩沖液（TBST）漂洗3次，10 min/次。分別加入兔抗鼠抗Bcl-2、Bax、裂解的Caspase-3抗體。混勻后4 ℃平搖過夜。再加入羊抗兔IgG-HRP二抗，混勻后4 ℃平搖1 h，TBST漂洗3次。取出PVDF膜后用增強化學發光A、B液反復吹洗5 min后置于曝光夾中用塑料薄膜封好，暗室中曝光30 s～5 min后顯影并定影。以β-肌動蛋白作為內參照。膠片經激光光密度圖像掃描儀掃描圖像并用Quantity One分析軟件進行圖像分析，測得各個條帶的灰度值。將目的條帶的灰度值與對應內參的灰度值相比較，得出相對表達量，所得數據取平均值。
1.5 統計學方法
采用SPSS 22.0軟進行統計分析，計量資料采用均數±標準差（
）表示，數據均行正態分布及方差齊性檢驗。符合正態分布及方差齊，各組計量資料統計分析采用單因素方差分析。組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
原代大鼠RGC于24～36 h可完全貼壁。倒置顯微鏡觀察發現，RGC細胞核居中，胞體清晰，培養3～5 d后長出少許短小神經元突起，呈多角狀（圖1A）；6～7 d RGC神經突起間接觸；7～8 d后RGC融合率達到70%。免疫熒光雙染法結果顯示，RGC細胞質內Thy-1表達陽性，細胞核內Brn-3a表達陽性（圖1B）。
圖1
原代大鼠RGC及hUMSC-MV鑒定像。1A.原代大鼠RGC倒置顯微鏡像，RGC胞體清晰，培養3～5 d后長出少許短小神經元多角狀突起 ×200；1B.原代大鼠RGC免疫熒光鑒定像，RGC細胞質、短小突觸及細胞核可見Thy-1及Brn-3a免疫熒光雙染，細胞核DAPI藍色染色陽性 Thy-1+Brn-3a雙染 ×100；1C.hUMSC-MV透射電子顯微鏡像。hUMSC-MV為單個或少許成簇的圓形膜性囊泡樣結構 磷鎢酸 標尺：300 μm1C.hUMSC-MV透射電子顯微鏡像。hUMSC-MV為單個或少許成簇的圓形膜性囊泡樣結構 磷鎢酸 標尺：300 μm
透射電子顯微鏡觀察發現，hUMSC-MV為單個或少許成簇的圓形膜性囊泡樣結構，直徑約100～1000 nm不等（圖1B）。流式細胞儀檢測結果顯示，hUMSC-MV多聚集在102～103 nm直徑范圍（圖2）。
圖2
hUMSC-MV流式細胞儀檢測像。hUMSC-MV多聚集在102～103 nm直徑范圍
流式細胞儀分析結果顯示，hUMSC-MV表面高表達CD44、CD29、CD73、CD105，陰性表達CD49f、HLA-DR、CD34、CD45（圖3）。BCA法測量結果顯示，hUMSC-MV蛋白含量約為（80.12±0.44）μg。
圖3
hUMSC-MV流式細胞儀分析像。hUMSC-MV表面高表達CD44、CD29、CD73、CD105、CD90，陰性表達CD49f、HLA-DR、CD34、CD45
熒光顯微鏡觀察發現，hUMSC-MV與RGC共培養6 h后，RGC內細胞核呈藍色熒光著染，細胞質內大量點狀紅色熒光，RGC可與hUMSC-MV良好內化（圖4）。
圖4
hUMSC-MV與RGC內化熒光顯微鏡像。4A.PKH26熒光標記hUMSC-MV；4B.RGC細胞核DAPI染色；4C.hUMSC-MV進入RGC內化 標尺：20 μm
A～D組細胞活性率分別為（92.33±2.51）%、（62.00±3.61）%、（90.33±0.58）%、（76.67±1.53）%，細胞凋亡率分別為（11.33±1.53）%、（44.67±1.53）%、（10.33±1.51）%、（23.00±1.00）%。4組細胞活性及凋亡率比較，差異均有統計學意義（F=107.92、382.11，P=0.000、0.000）。組間兩兩比較結果顯示，B組細胞活性低于A、C、D組，B組細胞凋亡率高于A、C、D組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。
RT-PCR檢測結果顯示，4組RGC內Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA表達比較，差異有統計學意義（F=219.79、339.198、1 071.21，P=0.000、0.000、0.000）。組間兩兩比較結果顯示，B、D組RGC內Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA表達高于A、C組，差異有統計學意義；D組RGC內Bcl-2 mRNA表達高于B組，差異有統計學意義（P＜0.05）；B組Bax、Caspase-3 mRNA表達高于D組，差異有統計學意義（P＜0.05）（圖5）。
圖5
各組細胞凋亡相關基因mRNA表達比較
Western blot檢測結果顯示，4組RGC內Bcl-2、Bax、裂解的Caspase-3、Caspase-3蛋白表達比較，差異有統計學意義（F=544.28、295.79、533.18、224.75，P=0.000、0.000、0.000、0.000）。組間兩兩比較結果顯示，B、D組RGC內Bcl-2、Bax、裂解的Caspase-3、Caspase-3蛋白表達高于A、C組，差異有統計學意義（P＜0.05）；D組RGC內Bcl-2蛋白表達高于B組，差異有統計學意義（P＜0.05）；B組Bax、Caspase-3蛋白表達高于D組，差異有統計學意義（P＜0.05）（圖6）。
圖6
各組細胞凋亡相關蛋白表達比較
3 討論
MV是以細胞出芽方式分泌，由磷脂轉運酶、反轉酶等酶類參與，釋放過程包括細胞膜內層磷脂酰絲氨酸非對稱分布及細胞骨架的再分配[16-18]。Kanada等[19]發現，MV轉運細胞內生信物質更為高效，其通過內化形式可完整進入靶細胞內，防止母細胞內核酸、蛋白質等生信物質在非正常亞細胞定位的降解。因此，本研究選用了具有體積較大、相對較低超離速度及時間、較為完整的細胞外囊膜完整性、更為有效的生信物質轉運率的MV為研究對象，觀察hUMSC-MV對高糖誘導下大鼠RGC損傷的保護作用并初步探討其機制。
我們采用超速離心法成功提取hUMSC-MV，透射電子顯微鏡下觀察到hUMSC-MV為單個或聚集成簇的完整圓形膜性囊泡樣結構，直徑約100～1000 nm不等。通過流式細胞儀分析發現，hUMSC-MV在直徑102～103 nm范圍內呈柱樣聚集；其表面高表達CD44、CD29、CD73、CD105，陰性表達CD49f、HLA-DR、CD34、CD45，與文獻報道結果一致[20-22]。hUMSC-MV與大鼠RGC共培養后RGC內可見大量點狀紅色熒光，證明hUMSC-MV可與大鼠RGC良好內化。CCK-8細胞活性檢測及AnnexinⅤ/PI雙染法細胞凋亡檢測結果表明，高糖環境可降低大鼠RGC的細胞活性，誘導細胞凋亡，高糖刺激RGC內凋亡相關基因Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA及蛋白表達。hUMSC-MV與大鼠RGC共培養后可增加大鼠RGC活性，降低細胞凋亡率；RGC內Bcl-2表達增加，Bax、Caspase-3表達降低，并降低Caspase-3的裂解活化。據此我們認為，高糖環境作為對RGC的損傷因素，通過誘導細胞內凋亡相關基因Bcl-2、Bax、Caspase-3的表達導致RGC活性下降或凋亡；hUMSC-MV可通過與RGC內化的作用形式干預細胞內凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的表達及Caspase-3活化，從而發揮對RGC細胞損傷的保護。目前關于干細胞源性MV在神經損傷方面的作用多集中于中樞神經系統。Baulch等[23]發現，通過脊髓移植神經干細胞源性MV可改善大鼠接受放射治療后行為認知功能的損傷。脂肪MSC源性MV在低濃度范圍內可發揮對神經細胞的保護作用，高濃度范圍對神經細胞的保護作用減弱[13]。上述研究結果與本研究結果類似，提示干細胞源性MV均有修復神經細胞損傷的作用。
本研究立足于hUMSC研究現狀，以hUMSC-MV為介質為視網膜神經組織損傷的治療提供一定的理論依據。但本研究缺陷在于為體外實驗，僅觀察單一濃度、單一時間點的hUMSC-MV對RGC的作用，并未進一步分析hUMSC-MV內的具體生物信息物質對RGC內凋亡相關信號通路的影響。在今后進一步研究中，擬進行hUMSC-MV不同濃度梯度對糖尿病視網膜病變動物模型的作用，著重于探討hUMSC-MV對視網膜神經組織保護作用的作用靶點及信號通路。
