目的 構建針對大鼠opticin表達基因(OPTC)的特異性小發夾RNA(shRNA)真核表達質粒。方法 用DNA重組技術將針對大鼠OPTC基因不同位點所設計的4個shRNA序列克隆到真核表達質粒中。根據構建的4對質粒設置shRNA-1組、shRNA-2組、shRNA-3組、shRNA-4組，同時只加轉染試劑不加質粒的細胞設為正常對照組，轉染陰性質粒的細胞為陰性對照組。用脂質體lipofectimine 2000將4個shRNA質粒分別轉染至體外培養的原代大鼠睫狀體非色素上皮(NPE)細胞，轉染后采用半定量逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)和蛋白免疫印跡法（Western blot）分別檢測OPTC基因的mRNA及opticin蛋白的相對表達量和抑制率。結果 各組質粒轉染大鼠NPE細胞后，shRNA-1、shRNA-2、shRNA-3、shRNA-4組細胞OPTC mRNA相對表達較正常對照組均明顯下調(F=10.239，P＝0.000),各組OPTC mRNA抑制率為85.7%、62.87%、54.87%、48.77%。各質粒干擾組細胞opticin蛋白表達較正常組均有不同程度下降(F=17.870，P=0.000)，各組opticin蛋白抑制率為78.7%、34.6%、31.1%、16.8%。結論 OPTC基因干擾質粒shRNA-1可以有效抑制大鼠睫狀體NPE細胞opticin的表達。
目的 探討重組B因子（CFB）小干擾RNA(siRNA)抑制激光誘導的大鼠脈絡膜新生血管(CNV)的效果。方法 采用基因重組的方法獲得重組CFBsiRNA，取棕色挪威（BN）大鼠42 只84 只眼，用激光光凝方式建立CNV模型，隨機分為尾靜脈注射組、玻璃體腔注射組、視網膜下腔注射組、對照組。3種不同的注射方式組分別設有相應的空質粒注射組。除對照組外，其余各組于激光光凝后第1、3、5天分別進行注射CFBsiRNA，尾靜脈、玻璃體腔、視網膜下腔注射組的注射劑量分別為50、20、10 mu;g；對照組激光光凝后不給于任何干預。激光光凝前和光凝后14 d分別行熒光素眼底血管造影(FFA)，根據熒光滲漏程度對各激光光斑評分來檢測CNV的生成情況；免疫組織化學法檢測各組大鼠脈絡膜內血管內皮生長因子(VEGF)、第Ⅷ因子的表達情況。結果 各組激光光斑熒光滲漏程度評分結果顯示，CFB-siRNA尾靜脈注射組與對照組相比熒光滲漏程度明顯減輕 (chi;2=15.1620,Plt;0.05)。免疫組織化學結果顯示，CFB-siRNA尾靜脈注射組VEGF、第Ⅷ因子的陽性表達強度在激光光凝后不同時間點之間差異無統計學意義(F=20.35，18.33；Pgt;0.05)，而與同時間點其他各組相比，明顯降低(F=77.96,55.68;Plt;0.05)。其他各組VEGF、第Ⅷ因子的陽性表達強度在激光光凝后14 d均顯著強于激光光凝后7 d (F=60.89,61.12;Plt;0.05)。結論 通過下調VEGF及第Ⅷ因子的表達水平，重組CFB-siRNA能有效的抑制CNV的生成。
目的 觀察Ras相關的C3肉毒毒素底物1的小發夾RNA（Rac1-shRNA）在小鼠氧致視網膜病變中對視網膜新生血管（RNV）生成的抑制作用及對活性氧（ROS）-核因子kappa;B（NF-kappa;B）通路的影響。方法 將108只7日齡C57BL/6J小鼠隨機平均分為3組。其中2組Smith法建立氧致視網膜病變模型；11日齡時玻璃體腔注射Rac1-shRNA表達質粒或無意義質粒，分別作為基因干預組和空白對照組。第3組于正常氧環境中飼養，11日齡時玻璃體腔注射Rac1-shRNA表達質粒作為空白干預組。15、17日齡時行熒光視網膜鋪片，觀察視網膜血管發育及新生血管情況。17日齡時計數眼球切片中突破內界膜的血管內皮細胞核數。17日齡時進行原位雜交法和熒光實時定量逆轉錄－聚合酶鏈反應法檢測小鼠視網膜Rac1和NF-kappa;B p65亞單位的mRNA含量；免疫組織化學和蛋白質免疫印記檢測Rac1和NF-kappa;B p65的蛋白表達。結果 基因干預組視網膜Rac1的mRNA水平較空白對照組明顯下調（t=4.500，P=0.001）。與空白對照組比較，基因干預組視網膜鋪片中無灌注區、熒光滲漏和新生血管叢明顯減輕，突破內界膜的血管內皮細胞核顯著減少（t=6.521，P＜0.001）；視網膜NF-kappa;B p65的核易位水平明顯下降（t=16.008，P＜0.001），同時mRNA表達亦明顯下調（t=3.354，P=0.006），與Rac1 mRNA表達呈正相關（t=0.580，P=0.012）。結論 小鼠玻璃體腔注射脂質體包裹的Rac1-shRNA表達質粒可有效沉默視網膜Rac1基因表達，阻斷ROS-NF-kappa;B通路而參與抑制相對缺氧狀態下RNV生成。
目的 觀察Rac1-siRNA重組載體對視網膜新生血管生成的抑制作用。方法25只成年Sprague-Dawley（SD）大鼠，采用光動療力法誘導雙眼視網膜靜脈阻塞后，1只眼玻璃體腔轉染Rac1-siRNA重組載體作為基因干預組，另1只眼注射空白載體作為空白對照組。25只SD大鼠單眼玻璃體腔內轉染Rac1-siRNA重組載體作為空白干預組。2周后對3組大鼠進行心內灌注右旋異硫-氰酸熒光素，視網膜鋪片，檢測視網膜新生血管生成情況。摘除3組大鼠眼球，蘇木素-伊紅染色后計數突破內界膜的內皮細胞數。結果 視網膜鋪片發現，空白對照組視網膜產生大片新生血管，大量熒光素滲漏；基因干預組僅見小片狀新生血管網，少量熒光素滲漏；空白干預組呈正常血管形態。基因干預組大鼠視網膜切片中，突破內界膜的血管內皮細胞平均數與空白對照組和空白干預組比較，兩兩間差異具有統計學意義（統計值=，P=0.000lt;0.05）。結論 Rac1-siRNA重組載體能有效抑制體內視網膜新生血管的生成。
目的 總結外周血小分子RNA （microRNA，miRNA）作為腫瘤標志物的研究進展。方法 復習相關文獻，就近年來國內外關于外周血miRNA作為腫瘤標志物的研究進展進行綜述。結果 miRNA的表達存在廣泛性、穩定性及特異性，并與多種疾病的發生和發展相關聯。結論 外周血miRNA在未來腫瘤及其他疾病的臨床診斷、治療和預后中將展示出廣闊的應用前景。
【摘要】目的 研究小分子泛素樣修飾體-1(small ubiquitin-like modifier-1，SUMO-1)在野生型p53基因誘導HepG2細胞凋亡中的作用。方法 用含人野生型p53基因質粒pcDNA3-wtp53(pwtp53)、含人雙微粒體基因2〔（human double minute gene 2 (HDM2)； 鼠同源基因為MDM2〕質粒pCMV-HDM1B(pMDM2)、含人SUMO-1基因質粒pcDNA3-His6-SUMO-1(pSUMO-1)和空質粒pcDNA3分別或同時轉染HepG2細胞，獲得各轉染細胞系，應用Western blot檢測轉染后細胞中質粒蛋白的表達及流式細胞技術檢測細胞凋亡比例。結果 轉染pwtp53和pMDM2質粒的HepG2細胞均可見p53及MDM2蛋白條帶，同時轉染pSUMO-1質粒的細胞分別可見被SUMO-1修飾的相對分子量較大的p53和MDM2蛋白條帶，在未轉染任何質粒、僅轉染空質粒和pSUMO1質粒的細胞中只檢測到少量p53蛋白表達。轉染pwtp53及pwtp53+pSUMO-1質粒的HepG2細胞凋亡比例分別為(16.79±1.62)%和(18.15±1.36)%，轉染pwtp53+pMDM2+pSUMO-1質粒的細胞凋亡比例為(14.06±1.84)%，轉染pwtp53+pMDM2質粒的細胞凋亡比例則下降至(5.17±1.23)%，與前三者比較差異有顯著性意義(PH＜0.01)； 其他轉染系細胞中的細胞凋亡比例均≤2%，差異無顯著性意義。結論 SUMO-1通過與p53蛋白的結合或翻譯后修飾，抑制MDM2等癌基因蛋白對p53蛋白的降解，可增強p53抑癌基因誘導的細胞凋亡。
目的總結循環小分子RNA（miRNAs）與消化道腫瘤的關系，以及其在消化道腫瘤診斷、治療及預后判斷中的應用前景。 方法收集國內外關于miRNAs與消化道腫瘤關系的文獻并作綜述。 結果miRNAs可通過基因調控作用，參與調節細胞的增殖、分化和凋亡。消化道腫瘤患者的血循環中常伴有一些異常表達的miRNAs，其與腫瘤的發生和發展密切相關，不僅有助于腫瘤的診斷，而且還有助于確定腫瘤原發灶部位，甚至有助于臨床和病理分期，由此預測腫瘤的進展、復發和轉移情況，評估治療效果等。 結論循環miRNAs可作為消化道腫瘤的分子傳感器，用于臨床消化道腫瘤的無創早期診斷、治療和預后評估。
目的觀察早期糖尿病視網膜病變(DR)狀態下, 以pSUPER為載體的缺氧誘導因子1α(HIF1α)特異性小干擾(siHIF1α) RNA對髓樣細胞表面黏附分子CD18及神經損傷誘導蛋白-1(Ninj-1)表達的影響。 方法實驗分為健康人血清培養組(A組)、糖尿病血清培養組(B組)、糖尿病血清培養聯合pSUPERH1-siHIF1α轉染組(C組)及糖尿病血清培養聯合pSUPER空載體組(D組)進行。A組采用健康志愿者血清培養人髓樣細胞系白血病細胞系(K562)細胞; B、C、D組均采用DR患者血清培養K562細胞。C、D組在加入DR患者血清前24 h分別轉染pSUPERH1-siHIF1α及pSUPER空載體。采用流式細胞儀檢測各組K562細胞表面的CD18、Ninj-1表達。行細胞黏附實驗, 檢測各組K562細胞與恒河猴視網膜脈絡膜血管內皮細胞系(RF/6A)細胞黏附率。 結果A、B、C、D組K562細胞表面CD18表達比較, 4組間差異有統計學意義(F=14.33, P=0.01)。組間CD18表達兩兩比較, B組明顯高于A組(P=0.001);C組明顯低于B組(P=0.001)和D組(P=0.02);C組與A組間無明顯差異(95%可信區間=-14.89～2.13, P=0.12)。A、B、C、D組K562細胞表面Ninj-1表達比較, 4組間差異有統計學意義(F=39.38, P=0.001)。組間Ninj-1表達兩兩比較, B組明顯高于A組(P=0.00);C組與B組間無明顯差異(P=0.06);C組與D組間也無明顯差異(P=0.49)。A、B、C、D組K562細胞與RF/6A細胞黏附率比較, 4組間差異有統計學意義(F=20.62, P=0.00)。組間K562細胞與RF/6A細胞黏附率兩兩比較, B組明顯高于A組(P=0.00);C組較B組明顯下降(P=0.01), 較A組明顯提高(P=0.002);B組與D組間無明顯差異(P=0.68)。 結論早期DR狀態下, 以pSUPER為載體的siHIF1α RNA可降低K562細胞表面CD18的表達, 但對Ninj-1表達無明顯影響。
目的觀察G蛋白偶聯受體91(GPR91)對早期糖尿病大鼠血視網膜屏障(BRB)的影響及可能的作用機制。 方法構建GPR91小發夾RNA(shRNA)慢病毒載體pGCSIL-GFP-shGPR91及相應的慢病毒空載體pGCSIL-GFP-shScrambled。健康雄性Sprague-Dawley大鼠60只, 隨機分為對照組(A組)、糖尿病鏈脲佐菌素(STZ)組(B組)、空病毒LV.shScrambled組(C組)、病毒LV.shGPR91組(D組), 每組均為15只大鼠。大鼠STZ腹腔注射2周后, C組大鼠玻璃體腔注射濃度為1×108 TU/ml的空載體病毒1 μl; D組大鼠玻璃體腔注射濃度為1×108 TU/ml的pGCSIL-GFP-shGPR91慢病毒1 μl。注射后12周, 免疫組織化學染色和蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測各組大鼠視網膜中GPR91及絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的表達和激活情況。蘇木精-伊紅染色和伊凡思藍(EB)滲漏試驗觀察大鼠視網膜微血管結構改變和滲漏情況。酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測視網膜中血管內皮生長因子(VEGF)表達情況。 結果免疫組織化學染色可見GPR91主要表達于大鼠視網膜神經節細胞層; Western blot檢測結果顯示, D組GPR91表達較C組顯著降低, 差異有統計學意義(F=39.31, P＜0.01)。光學顯微鏡觀察發現, B、C組大鼠視網膜內層毛細血管較A組大鼠視網膜內層毛細血管明顯擴張, D組大鼠視網膜內層擴張的毛細血管顯著改善。EB滲漏試驗結果顯示, D組大鼠視網膜EB滲漏量較C組下降(33.8±4.11)%, 差異有統計學意義(F=30.35, P＜0.05)。ELISA檢測結果顯示, B、C組大鼠視網膜VEGF蛋白表達較A組明顯增加; D組大鼠視網膜VEGF蛋白表達較C組顯著下降, 差異有統計學意義(F=253.15, P＜0.05)。Western blot檢測結果顯示, B組大鼠視網膜細胞外信號調節激酶(ERK)1/2、c-jun氨基末端激酶、p38 MAPK通路均激活, B組各比值與A組比較, 差異有統計學意義(q=6.38、2.94、3.45, P＜0.05)。D組中p-ERK1/2與t-ERK1/2的比值較C組顯著降低, 差異有統計學意義(F=22.50, P＜0.05)。 結論GPR91受體shRNA玻璃體腔注射可改善早期糖尿病大鼠視網膜BRB損傷; GPR91受體可能通過激活ERK1/2信號通路參與調控早期糖尿病視網膜中VEGF的表達及BRB的損傷。
目的 觀察腺相關病毒（AAV）介導小發夾RNA（shRNA）干擾抑制Claudin-3表達對體外培養小鼠視網膜神經節細胞（RGC）的影響。 方法 原代培養小鼠RGC分為正常對照組、AAV-shScramble組、AAV-shClaudin3組。細胞接種24 h后，AAV-shScramble組、AAV-shClaudin3組RGC分別轉染AAV-shScramble和AAV-shClaudin3。轉染96 h后，活細胞熒光動態顯微鏡觀察目的病毒轉染效率；β-微管蛋白免疫熒光染色檢測RGC軸突長度；免疫熒光4′，6-二脒基-2-苯基吲哚染色觀察RGC凋亡形態；實時聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測各組RGC Claudin-3、血管內皮生長因子（VEGF）mRNA表達；蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測各組RGC Claudin-3、VEGF、B淋巴細胞瘤/白血病-2基因（Bcl-2）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）蛋白表達水平。 結果 活細胞動態熒光顯微鏡觀察發現,AAV-shScramble組、AAV-shClaudin3組RGC病毒轉染效率均＞50%；病毒轉染96 h后，AAV-shClaudin3組RGC軸突長度明顯低于正常對照組、AAV-shScramble組，差異有統計學意義（F=2 363.274，P＜0.05）；AAV-shClaudin3組RGC密度較正常對照組、AAV-shScramble組明顯減低，可見細胞核皺縮、趨邊以及細胞核裂解形成的凋亡小體。AAV-shClaudin組RGC的Claudin-3、VEGF mRNA表達明顯低于正常對照組和AAV-shScramble組，差異有統計學意義（F=257.408、160.533，P＜0.05）。AAV-shClaudin3組RGC的Claudin-3、VEGF、Bcl-2蛋白表達明顯低于正常對照組和AAV-shScramble組,差異有統計學意義（F=129.671、420.552、62.669，P＜0.05）；Caspase-3蛋白表達明顯高于正常對照組、AAV-shScramble組，差異有統計學意義（F=231.348，P＜0.05）。 結論 AAV介導shRNA干擾抑制Claudin-3的表達可下調VEGF、Bcl-2及上調Caspase-3的表達，促進RGC凋亡，抑制RGC軸突生長。