目的體外實驗研究腺病毒介導Wnt10b基因表達與抑制對人BMSCs（human BMSCs，hBMSCs）成骨成脂分化的調控。 方法取健康成人髂骨骨髓分離培養hBMSCs，取第4代細胞并分為4組：A、B、C組分別加入Wnt10b基因表達腺病毒載體、Wnt10b基因沉默（Wnt10b-shRNA）腺病毒載體和空病毒轉染細胞，D組細胞不進行轉染作為空白對照組。各組進行成骨、成脂和無誘導培養，通過ALP染色、茜素紅染色和油紅O染色檢測Wnt10b對各組成骨成脂分化的影響，通過實時熒光定量PCR檢測成骨和成脂相關基因表達，Western blot檢測成骨和成脂相關蛋白表達，了解Wnt10b對hBMSCs成骨成脂轉錄和蛋白水平的影響。 結果成骨誘導培養后ALP染色4組均呈陽性，A組呈強陽性，B組染色最弱；茜素紅染色A組出現大量片狀融合褐色礦化結節，B組見少許點狀褐色礦化結節，C、D組出現大量點狀褐色礦化結節。成脂誘導培養后油紅O染色B、C、D組呈強陽性表現，其中B組最強；A組散在小團狀著色區，數量較其他組明顯減少。熒光定量PCR和Western blot結果示：A組成骨轉錄因子和蛋白表達高于B、C、D組，B組低于C、D組；而成脂轉錄因子和蛋白表達與成骨轉錄因子及蛋白表達情況相反。 結論Wnt10b基因高表達促進hBMSCs向成骨分化，低表達則促進成脂分化。
目的研究白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）聯合bFGF對人BMSCs（human BMSCs，hBMSCs）增殖及分化的影響。 方法取第4代hBMSCs，根據培養條件不同分為4組：A組為對照組，加入完全培養基（含10% FBS的α-MEM）常規培養；B組加入含10 ng/mL LIF的完全培養基；C組加入含10 ng/mL bFGF的完全培養基；D組加入含10 ng/mL LIF和10 ng/mL bFGF的完全培養基。采用細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8）測定各組第4代hBMSCs生長曲線；倒置相差顯微鏡觀察各組hBMSCs形態變化；流式細胞術檢測各組第8代hBMSCs表面標志CD44、CD90、CD19、CD34表達情況。 結果4組細胞生長曲線均近似S形，且細胞增殖速率表現為D組>C組>B組>A組。各組細胞形態觀察發現A組細胞較早出現衰老和分化現象；B組細胞早期形態維持較好，但增殖相對緩慢，后期出現部分衰老細胞；C組少量細胞呈神經樣細胞分化，但增殖較快；D組細胞增殖迅速，且能長期維持hBMSCs形態特征。流式細胞術檢測示，A、C組骨髓基質標志CD44、CD90表達較B、D組低；各組造血細胞標志CD19、CD34均呈陰性，組間差異不明顯。 結論LIF聯合bFGF不僅可以維持hBMSCs的多向分化潛能，而且能夠促進其快速增殖。
目的通過誘導人BMSCs（human BMSCs，hBMSCs）成軟骨分化，觀察低氧誘導因子1α（hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α）、HIF-2α在分化過程中的表達趨勢，為闡明HIF參與調控成軟骨分化機制提供依據。 方法對已消化的懸浮hBMSCs進行離心沉淀，形成細胞微球。將細胞微球分為2組，對照組加入含2% FBS的H-DMEM培養基，成軟骨誘導組加入軟骨誘導液，于低氧（2% O2）條件下培養。培養3周后行甲苯胺藍及Ⅱ型膠原免疫組織化學染色觀察，培養1周行Western blot檢測HIF-1α、HIF-2α蛋白表達，培養1、2、3周行實時定量PCR檢測成軟骨分化關鍵轉錄因子及相關標志基因表達。 結果甲苯胺藍染色示，對照組染色細胞核整體分布稀疏，而成軟骨誘導組分布致密；成軟骨誘導組細胞外基質染色明顯較對照組深。Ⅱ型膠原免疫組織化學染色示陽性信號主要位于細胞質內；與成軟骨誘導組相比，對照組細胞核分布較稀疏且著色淺。Western blot檢測示，培養1周成軟骨誘導組HIF-1α和HIF-2α蛋白相對表達量均顯著低于對照組（t=8.345，P=0.001；t=7.683，P=0.002）。實時定量PCR檢測示，與對照組比較，成軟骨誘導組HIF-1α mRNA相對表達量在培養1周時降低、2周時顯著升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）；3周時兩組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。成軟骨誘導組培養各時間點HIF-2α mRNA相對表達量均顯著低于對照組，Sox-9 mRNA相對表達量均顯著高于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.01）。培養過程中，Ⅱ型膠原及Ⅹ型膠原表達呈逐漸增加趨勢，第2、3周時兩者的mRNA相對表達量顯著高于對照組（P＜0.05）。而成軟骨誘導組多聚蛋白聚糖mRNA相對表達量在各時間點均高于對照組（P＜0.05）。 結論HIF-1α參與誘導hBMSCs成軟骨分化過程，但HIF-2α表達在該分化過程中受抑制。
目的探討bFGF及EGF單獨或聯合誘導人BMSCs（human BMSCs，hBMSCs）向神經細胞分化的差異以及Wnt/β-catenin信號通路在分化過程中的調控作用。方法 取鑒定后的第4代hBMSCs，根據不同誘導條件分為對照組（A組）、EGF誘導組（B組）、bFGF誘導組（C組）、EGF+bFGF誘導組（D組）以及EGF+bFGF+ Dickkopf相關蛋白1（Dickkopf-related protein 1，DKK-1）誘導組（E組）。誘導培養7 d后，采用倒置熒光相差顯微鏡觀察細胞形態，RT-PCR檢測神經細胞 ［巢蛋白（Nestin）、神經元特異性烯醇化酶 （neuron-specific enolase，NSE）、微管相關蛋白 2（microtubule-associated protein 2，MAP-2）和膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）］ 以及Wnt/β-catenin信號通路關鍵組件（β-catenin和Cyclin D1）基因水平表達變化，細胞免疫熒光染色以及Western blot檢查檢測神經細胞（Nestin、GFAP）以及Wnt/β-catenin信號通路關鍵組件 ［β-catenin、磷酸化β-catenin（phosphorylation β-catenin，P-β-catenin）、細胞胞質β-catenin（Cytoplasmic β-catenin）及細胞核內β-catenin（Nuclear β-catenin）］ 蛋白水平表達變化。結果 誘導培養后，與A、B組比較，C～E組細胞出現典型的神經樣細胞變化，其中D組最明顯。RT-PCR檢測示與A組比較，C～E組Nestin、NSE、MAP-2，D、E組GFAP及B組NSE基因相對表達量升高；C、D組β-catenin以及B～D組Cyclin D1基因相對表達量升高；差異均有統計學意義（P<0.05）。D組與E組比較，Nestin、NSE、MAP-2、GFAP、β-catenin、CyclinD1基因相對表達量均升高；與C組比較Nestin基因相對表達量下降，NSE、MAP-2、GFAP基因相對表達量均升高；組間差異有統計學意義（P<0.05）。細胞免疫熒光染色觀察示C～E組NSE、GFAP陽性率與A組比較均升高，D組高于C、E組，差異有統計學意義（P<0.05）。Western blot檢測示，C、D組NSE蛋白相對表達量較A組升高，D組高于C、E組；C～E組GFAP蛋白相對表達量較A組升高、D組高于E組；差異均有統計學意義（P<0.05）。C、D組與A組比較以及D組與E組比較，β-catenin、Cytoplasmic β-catenin、Nuclear β-catenin蛋白相對表達量以及β-catenin核質比均升高，P-β-catenin蛋白相對表達量下降，差異有統計學意義（P<0.05）。結論bFGF可誘導hBMSCs向神經細胞分化，而EGF無此作用，但能增強bFGF誘導作用；Wnt/β-catenin信號通路在這一過程中發揮正向調控效應。