引用本文： 龔銘, 黃勝, 羅嘉全, 黃保丁, 周治宇, 代學俊, 高蔓蔓, 李亮平, 鄒學農. 低氧誘導因子1α及2α在人BMSCs成軟骨分化中的表達規律. 中國修復重建外科雜志, 2015, 29(7): 857-862. doi: 10.7507/1002-1892.20150186 復制
細胞外微環境包括氧濃度、酸堿度、滲透壓及應力等，它們均可對細胞自身功能狀態發揮調控作用[1]。其中，低氧因素在干細胞分化與代謝方面發揮著至關重要的作用，低氧狀態可激活干細胞不同的分子機制，從而使細胞適應缺氧微環境[2]。低氧誘導因子（hypoxia inducible factor，HIF）普遍存在于人和哺乳動物細胞內，常氧下（21%O2）也有表達，但合成的HIF蛋白很快即被細胞內氧依賴性泛素蛋白酶降解途徑所降解，只有在缺氧條件下才可穩定表達[3]。已有相關研究證明，HIF可促進干細胞的成骨、成軟骨分化[2, 4-6]。HIF具有不同亞型，目前研究較多的HIF-1α被認為是主要參與調節并維持低氧狀態下細胞新陳代謝、促進干細胞分化的功能因子，HIF的其他亞型如2α、3α如何參與干細胞的代謝及分化調控作用仍不十分清楚[3, 7-9]。而且，HIF-1α主要在肝臟、胰腺、胃等臟器中表達，HIF-2α主要在腎、肺及血管內皮細胞中表達[3, 7]。對不同臟器的選擇性表達也提示了HIF的不同亞型可能在功能調控上具有不同的側重點。本研究中，我們利用人BMSCs（human BMSCs，hBMSCs）誘導成軟骨分化，探討HIF-1α、2α在該過程中的表達，為進一步闡明其功能奠定實驗基礎。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
H/L-DMEM （Thermo Fisher Scientific公司，美國）；Trizol、FBS（Invitrogen公司，美國）；Total RNA逆轉錄試劑盒、實時定量PCR試劑（大連TaKaRa公司）；TGF-β3（Peprotech公司，美國）；細胞總蛋白裂解液及BCA試劑盒、ECL發光試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜（Millipore公司，美國）；HIF-1α與HIF-2α抗體（Abcam公司，英國）；地塞米松（dexamethasone，Dex）、二磷酸抗壞血酸（ascorbic acid，AsAp）（Sigma公司，美國）；胰島素-轉鐵蛋白-硒（insulin-transferrin-selenium，ITS；BD公司，英國）；（1.007±0.001）g/mL淋巴細胞分離液（GE Healthcare公司，瑞士）；胰蛋白酶粉（GIBCO公司，美國）；氯仿、異丙醇（廣州化學試劑廠）。細胞培養瓶（Corn ing公司，美國）； BD53低氧培養箱（Binder公司，德國）；TS100倒置光學/熒光多功能顯微鏡（Nikon公司，日本）；NanoDrop 2000分光光度計（Thermo公司，美國）。
1.2 hBMSCs的分離、培養及傳代
經中山大學附屬第一醫院倫理委員會批準并經患者同意后，選取2013年8月－2014年2月于中山大學附屬第一醫院進行脊柱手術的6例患者為研究對象，其中男3例，女3例；年齡41～59歲。術中用50 mL注射器抽取腰椎骨髓血15～25 mL，取15 mL離心管，按體積比4∶3先后加入淋巴細胞分離液及骨髓液，室溫以離心半徑16 cm、1 200 r/ min離心45 min。小心吸棄上層水相至中間絮狀細胞層，將中間細胞層移至另一15 mL離心管，加入適量L-DMEM，混勻，同上法離心5 min；棄上清，再加入2～3 mL含10%FBS的L-DMEM，吹打懸浮細胞。將該細胞懸浮液轉移至25 cm2細胞培養瓶中，加入5 mL含10%FBS的L-DMEM，混勻后置于37℃、5%CO2培養箱中靜置培養；2 d后首次換液，之后每3天全量換液；約14 d原代hBMSCs增長至80%～90%融合時，室溫下以2.5 g/L胰蛋白酶消化并收集細胞，以1∶3比例傳代接種于75 cm2細胞培養瓶，每3天更換培養液，繼續消化傳代培養。
1.3 實驗分組及方法
根據文獻[8, 10]方法采用離心成球法誘導hBMSCs成軟骨分化。將第5～7代hBMSCs以5×105個/mL細胞密度轉移至15 mL離心管中，以離心半徑16 cm、1 300 r/min離心5 min，于離心管底部形成一細胞微團。棄上清后，將細胞分為對照組與成軟骨誘導組，對照組加入含2%FBS的H-DMEM培養基，成軟骨誘導組加入軟骨誘導液（含2%FBS、10 ng/ mL TGF-β3、100 nmol/L Dex、50 μg/mL AsAp、40 μg/ mL脯氨酸、100 μg/mL丙酮酸、1∶100稀釋的ITS+Premix的H-DMEM培養基）。將兩組細胞置于低氧（2%O2）培養箱中，每3天換液1次，分別于各時間點收集細胞微球進行以下觀測。
1.4 觀測指標
1.4.1 組織學及免疫組織化學染色觀察
培養3周后收集兩組細胞微球，經PBS清洗、固定、包埋、脫蠟后，行甲苯胺藍及Ⅱ型膠原免疫組織化學染色觀察。
1.4.2 Western
blot檢測培養1周后收集兩組細胞微球，加入約100 μL總蛋白裂解液，用槍頭反復吹打形成均質的懸濁液，BCA法測定蛋白濃度；蛋白煮沸變性后取20 μg等量樣本行SDS-PAGE分離，然后將蛋白轉至PVDF膜上，1%牛血清白蛋白封閉后，分別加入抗HIF-1α與HIF-2α抗體，內參抗體為β-actin，4℃過夜，TBST洗膜10 min；加入二抗洗膜后用ECL發光試劑顯影，X線片曝光后將膠片顯影及定影。釆用Image J軟件測量目的條帶的吸光度（A）值，以β-actin條帶為內參照進行蛋白上樣量校正（校正值=目的條帶A值/β-actin條帶A值），以校正值對HIF-1α和HIF-2α蛋白表達水平進行半定量分析。
1.4.3 實時定量PCR檢測
采用實時定量PCR法檢測成軟骨分化過程關鍵啟動基因Sox-9，軟骨標志基因Ⅱ型膠原、多聚蛋白聚糖（Aggrecan），軟骨終末分化階段標志基因Ⅹ型膠原的基因表達，以及HIF-1α、HIF-2α基因表達。培養1、2、3周分別收集兩組細胞微球，按照Trizol說明書方法提取細胞總RNA，NanoDrop 2000分光光度計檢測總RNA純度及含量，逆轉錄總RNA，cDNA置于- 20℃保存。根據實時定量PCR試劑盒說明書進行反應，反應總體系10 μL；反應條件：95℃、10 min，95℃、15 s，60℃、30 s，72℃、20 s，40個循環；內參為18 s。基因擴增引物序列見表 1。采用2-ΔΔCt公式計算各基因mRNA相對表達量。
表1
各基因引物序列及產物大小
Table1.
Primer sequences and product size of genes
1.5 統計學方法
采用SPSS20.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 組織學及免疫組織化學染色觀察
甲苯胺藍染色示，兩組軟骨細胞基質呈淺藍色，細胞核呈深藍色。對照組染色細胞核整體分布稀疏，細胞基質染色較淺；而成軟骨誘導組染色細胞液分布致密，細胞基質染色明顯較對照組深。見圖 1。
圖1
培養3周兩組甲苯胺藍染色觀察（×40） ? 對照組 ? 成軟骨誘導組 ? ?Ⅱ型膠原免疫組織化學染色示，兩組細胞可見被染成棕黃色的Ⅱ型膠原蛋白，陽性表達主要位于細胞質內，細胞質與細胞外基質連成片狀；細胞核呈藍色；在部分細胞周圍可觀察到陷窩樣空隙。與成軟骨誘導組相比，對照組細胞核分布較稀疏且著色淺（圖 2），Ⅱ型膠原表達含量少。
2.2 Western blot檢測
培養1周時，成軟骨誘導組HIF-1α和HIF-2α蛋白相對表達量分別為0.386±0.015、0.118±0.002，均顯著低于對照組的0.525±0.024和0.163±0.010，差異有統計學意義（t=8.345，P=0.001；t=7.683，P=0.002）。見圖 3。
2.3 實時定量PCR檢測
與對照組比較，成軟骨誘導組HIF-1α mRNA相對表達量在培養1周時降低，而在2周時顯著升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）；培養3周時兩組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。成軟骨誘導組HIF-2α的表達在分化過程中均受抑制，培養各時間點HIF-2α mRNA相對表達量均顯著低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）。成軟骨誘導組Sox-9 mRNA相對表達量均顯著高于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05），以2周時表達最高。培養過程中Ⅱ型膠原及Ⅹ型膠原呈逐漸增加趨勢，2、3周時其mRNA相對表達量顯著高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。而成軟骨誘導組Aggrecan mRNA相對表達量在培養各時間點均有升高，與對照組比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖 4。
3 討論
人正常軟骨組織中含有軟骨細胞、基質及纖維成分，其中軟骨基質內膠原約占軟骨有機成分的40%[11]；而軟骨細胞能不斷產生新的軟骨基質，其主要組成成分是酸性糖胺多糖。由于軟骨組織的營養物質主要是通過滲透作用進入組織內部，僅在軟骨的邊緣及淺表位置含有少量血管來營養細胞。因此，軟骨組織這種生理特點決定其一旦損傷后則難以通過自身方式得到修復。目前臨床上關節軟骨損傷的治療效果均不令人滿意。而隨著對干細胞領域的深入研究，干細胞治療關節軟骨損傷為臨床提供了一種可能的途徑。
目前，運用離心沉淀法將干細胞聚集，使細胞與細胞之間形成空間上的緊密接觸，從而在體外模擬三維培養，可滿足誘導干細胞成軟骨分化的要求[12]。有文獻指出，三維立體培養是誘導干細胞成軟骨分化的必要條件之一[12]。干細胞在體外分化成軟骨的過程中，早期由于關鍵轉錄因子Sox-9的啟動，從而使Ⅱ型膠原與Aggrecan表達增加，分泌的膠原纖維與蛋白多糖不斷被修飾并改造；晚期軟骨細胞體積增大，Ⅱ型膠原逐漸改造形成特定空間結構排列的Ⅹ型膠原，該過程為軟骨分化的成熟階段，表明干細胞最終向軟骨分化[1]。本實驗中，實時定量PCR結果表明，與透明軟骨相關的Ⅱ型膠原和Aggrecan表達升高，提示干細胞分泌細胞外基質成分增加，為最終向軟骨成熟作準備；終末分化Ⅹ型膠原表達增多提示軟骨肥大成熟。目前認為Sox-9可啟動Aggre can及Ⅱ型膠原的轉錄，從而最終分化為軟骨組織，且低氧下能促進Sox-9的表達而有利于軟骨分化[13-14]。本實驗中Sox-9的表達與Ⅱ型膠原、Aggre can表達趨勢基本一致。在本實驗低氧培養下，甲苯胺藍染色顯示成軟骨誘導組的細胞基質分泌明顯多于對照組，Ⅱ型膠原表達也較對照組著色明顯。
目前研究認為，HIF在常氧微環境下通過細胞質內泛素化途徑降解；在低氧微環境下降解減少并由細胞質轉運入細胞核內，與HIF-1β亞基結合后啟動下游基因的轉錄與表達，調控細胞在缺血、缺氧等條件下的生理活動[9, 15]。通過三維培養模擬了細胞外低氧微環境，可為干細胞分化提供必要條件；而且，HIF參與了MSCs的成骨、成軟骨、成脂分化調控[16-17]，有利于細胞的干性維持[18]。本實驗結果顯示，HIF-1α在誘導分化早期（1周），基因及蛋白表達水平稍有降低，我們認為這可能是由于早期短時間的低氧微環境有利于細胞的干性維持，而在持續的低氧環境下可促進HIF-1α表達。而且，實驗結果顯示，HIF-1α表達在2周時明顯升高后再降低，而HIF-2α的表達在分化過程中受抑制，提示在hBM SCs成軟骨分化過程中，HIF-1α促進軟骨分化，而HIF-2α可能會發揮負調控作用。
關于HIF對MSCs向軟骨分化的作用，目前研究報道結果并不一致。原因在于HIF在不同臟器內表達不同的異構體，其功能也有不同。HIF-1α主要在骨髓及肝臟內表達，而HIF-2α主要在肺、心及腎臟內表達[19]；HIF-1α主要參與調控細胞的干性維持、糖代謝及能量代謝途徑的基因表達，而HIF-2α多被認為參與的是血管形成[15]。Malladi等[20]在體外用三維培養模型添加誘導因子誘導MSCs向軟骨分化，結果發現置于2%O2比置于21%O2細胞培養微環境下向軟骨分化率低。有文獻報道[10]，HIF-2α在人關節軟骨退變過程中是一個重要的病理始動因子，其功能在于誘導血管的侵入，因此可導致鈣鹽的沉積與軟骨內成骨分化，最終發展為骨性關節炎[15]。因HIF-1α與2α在結構上差別較小，在總體表達水平維持不變的情況下，HIF-1α與2α存在mRNA水平的剪切競爭調控。所以，我們認為在干細胞成軟骨分化過程中，抑制HIF-2α將有利于HIF-1α基因水平的表達；而HIF本身存在不同的異構體也提示機體針對于細胞生存與分化的微環境已發展出更加精細的調控方式，這有利于適應機體不同器官功能側重的需要。
綜上述，HIF-1α在誘導干細胞成軟骨分化過程中表達上調，而HIF-2α表達持續抑制，提示HIF-1α可促進干細胞成軟骨分化，而HIF-2α可能會抑制該分化。但HIF在干細胞分化，過程中的具體作用仍未完全闡明，本文為揭示HIF-2α在成軟骨分化過程中的作用進行了初步探索，其具體生物功能還有待進一步研究。
細胞外微環境包括氧濃度、酸堿度、滲透壓及應力等，它們均可對細胞自身功能狀態發揮調控作用[1]。其中，低氧因素在干細胞分化與代謝方面發揮著至關重要的作用，低氧狀態可激活干細胞不同的分子機制，從而使細胞適應缺氧微環境[2]。低氧誘導因子（hypoxia inducible factor，HIF）普遍存在于人和哺乳動物細胞內，常氧下（21%O2）也有表達，但合成的HIF蛋白很快即被細胞內氧依賴性泛素蛋白酶降解途徑所降解，只有在缺氧條件下才可穩定表達[3]。已有相關研究證明，HIF可促進干細胞的成骨、成軟骨分化[2, 4-6]。HIF具有不同亞型，目前研究較多的HIF-1α被認為是主要參與調節并維持低氧狀態下細胞新陳代謝、促進干細胞分化的功能因子，HIF的其他亞型如2α、3α如何參與干細胞的代謝及分化調控作用仍不十分清楚[3, 7-9]。而且，HIF-1α主要在肝臟、胰腺、胃等臟器中表達，HIF-2α主要在腎、肺及血管內皮細胞中表達[3, 7]。對不同臟器的選擇性表達也提示了HIF的不同亞型可能在功能調控上具有不同的側重點。本研究中，我們利用人BMSCs（human BMSCs，hBMSCs）誘導成軟骨分化，探討HIF-1α、2α在該過程中的表達，為進一步闡明其功能奠定實驗基礎。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
H/L-DMEM （Thermo Fisher Scientific公司，美國）；Trizol、FBS（Invitrogen公司，美國）；Total RNA逆轉錄試劑盒、實時定量PCR試劑（大連TaKaRa公司）；TGF-β3（Peprotech公司，美國）；細胞總蛋白裂解液及BCA試劑盒、ECL發光試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜（Millipore公司，美國）；HIF-1α與HIF-2α抗體（Abcam公司，英國）；地塞米松（dexamethasone，Dex）、二磷酸抗壞血酸（ascorbic acid，AsAp）（Sigma公司，美國）；胰島素-轉鐵蛋白-硒（insulin-transferrin-selenium，ITS；BD公司，英國）；（1.007±0.001）g/mL淋巴細胞分離液（GE Healthcare公司，瑞士）；胰蛋白酶粉（GIBCO公司，美國）；氯仿、異丙醇（廣州化學試劑廠）。細胞培養瓶（Corn ing公司，美國）； BD53低氧培養箱（Binder公司，德國）；TS100倒置光學/熒光多功能顯微鏡（Nikon公司，日本）；NanoDrop 2000分光光度計（Thermo公司，美國）。
1.2 hBMSCs的分離、培養及傳代
經中山大學附屬第一醫院倫理委員會批準并經患者同意后，選取2013年8月－2014年2月于中山大學附屬第一醫院進行脊柱手術的6例患者為研究對象，其中男3例，女3例；年齡41～59歲。術中用50 mL注射器抽取腰椎骨髓血15～25 mL，取15 mL離心管，按體積比4∶3先后加入淋巴細胞分離液及骨髓液，室溫以離心半徑16 cm、1 200 r/ min離心45 min。小心吸棄上層水相至中間絮狀細胞層，將中間細胞層移至另一15 mL離心管，加入適量L-DMEM，混勻，同上法離心5 min；棄上清，再加入2～3 mL含10%FBS的L-DMEM，吹打懸浮細胞。將該細胞懸浮液轉移至25 cm2細胞培養瓶中，加入5 mL含10%FBS的L-DMEM，混勻后置于37℃、5%CO2培養箱中靜置培養；2 d后首次換液，之后每3天全量換液；約14 d原代hBMSCs增長至80%～90%融合時，室溫下以2.5 g/L胰蛋白酶消化并收集細胞，以1∶3比例傳代接種于75 cm2細胞培養瓶，每3天更換培養液，繼續消化傳代培養。
1.3 實驗分組及方法
根據文獻[8, 10]方法采用離心成球法誘導hBMSCs成軟骨分化。將第5～7代hBMSCs以5×105個/mL細胞密度轉移至15 mL離心管中，以離心半徑16 cm、1 300 r/min離心5 min，于離心管底部形成一細胞微團。棄上清后，將細胞分為對照組與成軟骨誘導組，對照組加入含2%FBS的H-DMEM培養基，成軟骨誘導組加入軟骨誘導液（含2%FBS、10 ng/ mL TGF-β3、100 nmol/L Dex、50 μg/mL AsAp、40 μg/ mL脯氨酸、100 μg/mL丙酮酸、1∶100稀釋的ITS+Premix的H-DMEM培養基）。將兩組細胞置于低氧（2%O2）培養箱中，每3天換液1次，分別于各時間點收集細胞微球進行以下觀測。
1.4 觀測指標
1.4.1 組織學及免疫組織化學染色觀察
培養3周后收集兩組細胞微球，經PBS清洗、固定、包埋、脫蠟后，行甲苯胺藍及Ⅱ型膠原免疫組織化學染色觀察。
1.4.2 Western
blot檢測培養1周后收集兩組細胞微球，加入約100 μL總蛋白裂解液，用槍頭反復吹打形成均質的懸濁液，BCA法測定蛋白濃度；蛋白煮沸變性后取20 μg等量樣本行SDS-PAGE分離，然后將蛋白轉至PVDF膜上，1%牛血清白蛋白封閉后，分別加入抗HIF-1α與HIF-2α抗體，內參抗體為β-actin，4℃過夜，TBST洗膜10 min；加入二抗洗膜后用ECL發光試劑顯影，X線片曝光后將膠片顯影及定影。釆用Image J軟件測量目的條帶的吸光度（A）值，以β-actin條帶為內參照進行蛋白上樣量校正（校正值=目的條帶A值/β-actin條帶A值），以校正值對HIF-1α和HIF-2α蛋白表達水平進行半定量分析。
1.4.3 實時定量PCR檢測
采用實時定量PCR法檢測成軟骨分化過程關鍵啟動基因Sox-9，軟骨標志基因Ⅱ型膠原、多聚蛋白聚糖（Aggrecan），軟骨終末分化階段標志基因Ⅹ型膠原的基因表達，以及HIF-1α、HIF-2α基因表達。培養1、2、3周分別收集兩組細胞微球，按照Trizol說明書方法提取細胞總RNA，NanoDrop 2000分光光度計檢測總RNA純度及含量，逆轉錄總RNA，cDNA置于- 20℃保存。根據實時定量PCR試劑盒說明書進行反應，反應總體系10 μL；反應條件：95℃、10 min，95℃、15 s，60℃、30 s，72℃、20 s，40個循環；內參為18 s。基因擴增引物序列見表 1。采用2-ΔΔCt公式計算各基因mRNA相對表達量。
表1
各基因引物序列及產物大小
Table1.
Primer sequences and product size of genes
1.5 統計學方法
采用SPSS20.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 組織學及免疫組織化學染色觀察
甲苯胺藍染色示，兩組軟骨細胞基質呈淺藍色，細胞核呈深藍色。對照組染色細胞核整體分布稀疏，細胞基質染色較淺；而成軟骨誘導組染色細胞液分布致密，細胞基質染色明顯較對照組深。見圖 1。
圖1
培養3周兩組甲苯胺藍染色觀察（×40） ? 對照組 ? 成軟骨誘導組 ? ?Ⅱ型膠原免疫組織化學染色示，兩組細胞可見被染成棕黃色的Ⅱ型膠原蛋白，陽性表達主要位于細胞質內，細胞質與細胞外基質連成片狀；細胞核呈藍色；在部分細胞周圍可觀察到陷窩樣空隙。與成軟骨誘導組相比，對照組細胞核分布較稀疏且著色淺（圖 2），Ⅱ型膠原表達含量少。
2.2 Western blot檢測
培養1周時，成軟骨誘導組HIF-1α和HIF-2α蛋白相對表達量分別為0.386±0.015、0.118±0.002，均顯著低于對照組的0.525±0.024和0.163±0.010，差異有統計學意義（t=8.345，P=0.001；t=7.683，P=0.002）。見圖 3。
2.3 實時定量PCR檢測
與對照組比較，成軟骨誘導組HIF-1α mRNA相對表達量在培養1周時降低，而在2周時顯著升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）；培養3周時兩組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。成軟骨誘導組HIF-2α的表達在分化過程中均受抑制，培養各時間點HIF-2α mRNA相對表達量均顯著低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）。成軟骨誘導組Sox-9 mRNA相對表達量均顯著高于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05），以2周時表達最高。培養過程中Ⅱ型膠原及Ⅹ型膠原呈逐漸增加趨勢，2、3周時其mRNA相對表達量顯著高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。而成軟骨誘導組Aggrecan mRNA相對表達量在培養各時間點均有升高，與對照組比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖 4。
3 討論
人正常軟骨組織中含有軟骨細胞、基質及纖維成分，其中軟骨基質內膠原約占軟骨有機成分的40%[11]；而軟骨細胞能不斷產生新的軟骨基質，其主要組成成分是酸性糖胺多糖。由于軟骨組織的營養物質主要是通過滲透作用進入組織內部，僅在軟骨的邊緣及淺表位置含有少量血管來營養細胞。因此，軟骨組織這種生理特點決定其一旦損傷后則難以通過自身方式得到修復。目前臨床上關節軟骨損傷的治療效果均不令人滿意。而隨著對干細胞領域的深入研究，干細胞治療關節軟骨損傷為臨床提供了一種可能的途徑。
目前，運用離心沉淀法將干細胞聚集，使細胞與細胞之間形成空間上的緊密接觸，從而在體外模擬三維培養，可滿足誘導干細胞成軟骨分化的要求[12]。有文獻指出，三維立體培養是誘導干細胞成軟骨分化的必要條件之一[12]。干細胞在體外分化成軟骨的過程中，早期由于關鍵轉錄因子Sox-9的啟動，從而使Ⅱ型膠原與Aggrecan表達增加，分泌的膠原纖維與蛋白多糖不斷被修飾并改造；晚期軟骨細胞體積增大，Ⅱ型膠原逐漸改造形成特定空間結構排列的Ⅹ型膠原，該過程為軟骨分化的成熟階段，表明干細胞最終向軟骨分化[1]。本實驗中，實時定量PCR結果表明，與透明軟骨相關的Ⅱ型膠原和Aggrecan表達升高，提示干細胞分泌細胞外基質成分增加，為最終向軟骨成熟作準備；終末分化Ⅹ型膠原表達增多提示軟骨肥大成熟。目前認為Sox-9可啟動Aggre can及Ⅱ型膠原的轉錄，從而最終分化為軟骨組織，且低氧下能促進Sox-9的表達而有利于軟骨分化[13-14]。本實驗中Sox-9的表達與Ⅱ型膠原、Aggre can表達趨勢基本一致。在本實驗低氧培養下，甲苯胺藍染色顯示成軟骨誘導組的細胞基質分泌明顯多于對照組，Ⅱ型膠原表達也較對照組著色明顯。
目前研究認為，HIF在常氧微環境下通過細胞質內泛素化途徑降解；在低氧微環境下降解減少并由細胞質轉運入細胞核內，與HIF-1β亞基結合后啟動下游基因的轉錄與表達，調控細胞在缺血、缺氧等條件下的生理活動[9, 15]。通過三維培養模擬了細胞外低氧微環境，可為干細胞分化提供必要條件；而且，HIF參與了MSCs的成骨、成軟骨、成脂分化調控[16-17]，有利于細胞的干性維持[18]。本實驗結果顯示，HIF-1α在誘導分化早期（1周），基因及蛋白表達水平稍有降低，我們認為這可能是由于早期短時間的低氧微環境有利于細胞的干性維持，而在持續的低氧環境下可促進HIF-1α表達。而且，實驗結果顯示，HIF-1α表達在2周時明顯升高后再降低，而HIF-2α的表達在分化過程中受抑制，提示在hBM SCs成軟骨分化過程中，HIF-1α促進軟骨分化，而HIF-2α可能會發揮負調控作用。
關于HIF對MSCs向軟骨分化的作用，目前研究報道結果并不一致。原因在于HIF在不同臟器內表達不同的異構體，其功能也有不同。HIF-1α主要在骨髓及肝臟內表達，而HIF-2α主要在肺、心及腎臟內表達[19]；HIF-1α主要參與調控細胞的干性維持、糖代謝及能量代謝途徑的基因表達，而HIF-2α多被認為參與的是血管形成[15]。Malladi等[20]在體外用三維培養模型添加誘導因子誘導MSCs向軟骨分化，結果發現置于2%O2比置于21%O2細胞培養微環境下向軟骨分化率低。有文獻報道[10]，HIF-2α在人關節軟骨退變過程中是一個重要的病理始動因子，其功能在于誘導血管的侵入，因此可導致鈣鹽的沉積與軟骨內成骨分化，最終發展為骨性關節炎[15]。因HIF-1α與2α在結構上差別較小，在總體表達水平維持不變的情況下，HIF-1α與2α存在mRNA水平的剪切競爭調控。所以，我們認為在干細胞成軟骨分化過程中，抑制HIF-2α將有利于HIF-1α基因水平的表達；而HIF本身存在不同的異構體也提示機體針對于細胞生存與分化的微環境已發展出更加精細的調控方式，這有利于適應機體不同器官功能側重的需要。
綜上述，HIF-1α在誘導干細胞成軟骨分化過程中表達上調，而HIF-2α表達持續抑制，提示HIF-1α可促進干細胞成軟骨分化，而HIF-2α可能會抑制該分化。但HIF在干細胞分化，過程中的具體作用仍未完全闡明，本文為揭示HIF-2α在成軟骨分化過程中的作用進行了初步探索，其具體生物功能還有待進一步研究。
