引用本文： 周建新, 楊曉斐, 李陽, 丁朋, 蔣逸秋, 桂鑒超. 軟骨前體細胞的分離鑒定及IL-1β對其成軟骨分化的影響. 中國修復重建外科雜志, 2015, 29(7): 863-869. doi: 10.7507/1002-1892.20150187 復制
關節軟骨由于自身組織無血管，其自身修復能力極為有限[1-2]，一旦損傷往往會遺留疼痛或功能障礙，最后易致關節退變及骨性關節炎[3]。目前，臨床上對關節軟骨損傷的主要治療方法有骨髓刺激技術（以微骨折術為代表[4-5]）、骨軟骨移植技術（以馬賽克技術為代表[6]）等，但結果均不令人滿意。組織工程學技術的興起令人們再次看到軟骨修復的希望。組織工程學涉及種子細胞、支架材料、生長因子3個主要因素。自體軟骨細胞移植已在臨床上應用[7]，但體外培養的軟骨細胞很容易發生去分化 [8-9]，而且得到的修復組織只能是纖維軟骨，而不是正常透明軟骨。BMSCs也曾被用作軟骨損傷修復的種子細胞，但其來源于骨髓而不是軟骨組織本身，并且具有自發向成骨分化的傾向，即使在體外誘導軟骨分化條件下，合成的基質仍主要是Ⅰ型膠原。近年來軟骨前體細胞的發現可能為我們揭示了早期軟骨損傷修復的本質[10-12]，目前對其研究已成為熱點[13-14]，但國內仍鮮有這方面報道。
軟骨在損傷后的修復過程中，細胞均處于一種炎性環境，炎性因子的釋放可能是導致軟骨損傷后修復困難的因素。近年來，人們對細胞外支架進行了許多研究，試圖通過改良支架來減輕炎性因子對植入種子細胞的抑制作用[15-16]；也有研究直接探討炎性因子對BMSCs、脂肪干細胞增殖、分化的影響[17-19]，以期減輕這種不利影響。Joos等[20]研究表明IL-1β對軟骨前體細胞的遷移有抑制作用。但目前尚未見關于IL-1β對軟骨前體細胞分化影響的研究。本研究從正常軟骨組織中消化并通過纖連蛋白粘連實驗分離出軟骨前體細胞，進行流式細胞鑒定、三系分化，并揭示不同濃度IL-1β對軟骨前體細胞向軟骨細胞分化的影響，以期為軟骨前體細胞在炎性環境下進行軟骨修復的研究奠定實驗基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
健康5月齡雄性新西蘭大白兔1只，體重3.1 kg，由南京醫科大學附屬南京醫院動物實驗中心所提供。動物飼養于晝夜循環、無限量水和食物供應的動物設施中；實驗方案經南京醫科大學附屬南京醫院倫理委員會批準。
Ⅱ型膠原抗體（Acris公司，美國）；纖連蛋白（GIBCO公司，美國）；IL-1β、TNF-α（Perprotech公司，美國）；成骨誘導分化培養基、成脂誘導分化培養基（Cyagen Bioscience公司，美國）；TGF-β3（Life公司，美國）；Ⅹ型膠原抗體、CD34、CD45、CD90、CD105、CD49e（Abcam公司，英國）；Hoechst 33258染料（Anaspec公司，美國）；Trizol （Invitrogen公司，美國）；cDNA第1鏈合成試劑盒（Fermentas公司，立陶宛）；OneStep SYBR? PrimerScript? RT-PCR試劑盒（Takara公司，日本）。
MCO-20AIC CO2培養箱（SANYO公司，日本）；
SW-CJ-1FB超凈臺（蘇州凈化設備有限公司）；BX53倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；LDZX-75KB立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫療器械廠）；FACS Calibur流式細胞儀（BD公司，美國）；Model1680酶聯免疫檢測儀（Bio-Rad公司，美國）；DA7600熒光定量PCR循環儀（中山大學達安基因股份有限公司）。
1.2 軟骨前體細胞的分離培養及相關觀測
1.2.1 軟骨前體細胞的分離培養
取新西蘭大白兔后肢膝關節面軟骨組織，用Ⅱ型膠原酶消化分離得到軟骨細胞[20]。將含軟骨細胞的DMEM培養液平均分配至處理好的培養皿（培養皿底部在實驗前1 d涂一層含10 mg/mL纖連蛋白、1 mmol/L MgCl2、1 mmol/L CaCl2的PBS液，并于4℃中過夜），放入37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養20 min；然后移除培養液及未粘連的細胞，在培養皿中加入適量含10%FBS的DMEM培養液，于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養，每3天換液1次，細胞在培養皿中生長至80%～90%融合時傳代。
1.2.2 流式細胞儀鑒定
取第3代生長良好的細胞，用0.02%EDTA-0.05%胰蛋白酶消化3 min，加入含10%FBS的DMEM培養液終止消化，收集細胞懸液至離心管，離心洗滌2次（每次均以1 500×g離心5 min），制成單細胞懸液。任選一管不加任何標記作為空白對照，其余數管分別加入FITC標記的CD34、CD45、CD90、CD105、CD49e。4℃條件下孵育1 h，PBS洗滌，多聚甲醛固定，上流式細胞儀分析。
1.2.3 細胞生長情況觀察
取第3代軟骨前體細胞單層培養，將1 000個細胞接種于培養皿中，加入含10%FBS的DMEM培養液，于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養，每3天換液1次，培養15 d，倒置相差顯微鏡觀察軟骨前體細胞生長情況。
1.2.4 軟骨前體細胞的三系分化檢測
① 成骨細胞分化與鑒定：將第3代軟骨前體細胞在成骨誘導分化培養基（含10%FBS、80 U/mL青霉素、0.08 mg/mL鏈霉素、10 mmol/mL β-甘油磷脂鈉、100 nmol/L地塞米松、0.1 mmol/L抗壞血酸磷酸鹽的H-DMEM培養基）培養，每周2次換全液，3周后4%甲醛固定，行茜素紅染色鑒定。
② 成脂肪細胞分化與鑒定：待第3代軟骨前體細胞接近完全融合時，繼續用含10%FBS的DMEM培養液培養3～7 d，然后用成脂誘導分化培養基（含1.0 μmol/mL地塞米松、0.5 mmol/mL 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、100 μmol/mL吲哚美辛、10 mg/L胰島素的H-DMEM培養基）培養48 h后，換液繼續培養48 h；再用成脂肪細胞維持體系（含10%FBS、10 mg/ L胰島素的H-DMEM培養基）繼續培養1周，吸除培養皿底部培養液，PBS洗滌細胞3次后加入4%多聚甲醛室溫下固定60 min，70%乙醇洗滌。油紅O染色后光鏡下觀察成脂肪細胞分化情況。
③ 成軟骨細胞分化與鑒定：取第3代生長良好的軟骨前體細胞，用0.02%EDTA-0.05%胰蛋白酶消化3 min，后加入含10%FBS的DMEM培養液終止消化，收集細胞懸液至離心管，以1 500×g離心5 min；棄上清液，同上法離心洗滌2次；然后用生理鹽水稀釋成1×105 個 / mL，取5 mL置入15 mL離心管中，以2 000×g離心5 min，小心移除上清液，細胞沉聚于離心管底部。在含細胞團塊的離心管中沿管壁緩慢注入成軟骨誘導分化培養基（含80 U/ mL青霉素、0.08 mg/mL鏈霉素、10 μg/mL胰島素、5.5 μg/ mL轉鐵蛋白、5 ng/ mL硒、0.1 μmol/mL地塞米松、 50 μg/ mL L-抗壞血酸、40 μg/mL脯氨酸、100 μg/mL丙酮酸、2.5 ng/ mL TGF-β3的H-DMEM培養基）5 mL，于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養24 h；細胞團塊懸起，每2～3天換全液，3周后細胞團塊呈軟骨樣組織。取該組織甲醛固定，作組織學切片（片厚5 μm），行Ⅱ型膠原免疫組織化學染色鑒定。
1.3 不同濃度IL-1β對軟骨前體細胞成軟骨分化的影響
根據使用的培養基不同將實驗分為4組，A組為普通DMEM培養基，B組為成軟骨誘導分化培養基，C組為成軟骨誘導分化培養基+0.1 ng/mL IL-1β，D組為成軟骨誘導分化培養基+1.0 ng/mL IL-1β。取軟骨前體細胞，分別放入各組相應培養基中，于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養24 h，每3天換全液，3周后進行以下觀測。
1.3.1 組織學及免疫組織化學染色觀察
取各組細胞團塊，10%甲醛固定，石蠟包埋，制作石蠟切片（片厚5 μm）。常規行HE染色、番紅O染色及Ⅱ型膠原和Ⅹ型膠原免疫組織化學染色觀察。
1.3.2 生物化學成分測定
各組取20 mg組織標本，酶標儀上于656 nm波長下檢測糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）相對含量，555 nm波長下檢測總膠原相對含量，260 nm波長下檢測DNA相對含量[21]，并計算GAG/DNA比值。
1.3.3 實時熒光定量PCR檢測基因表達
用Trizol試劑提取各組軟骨組織中的總RNA，利用OneStep SYBR? PrimeScript? RT-PCR試劑盒檢測Ⅱ型膠原、Ⅹ型膠原、Sox-9、Runx-2、基質金屬蛋白酶13（matrix metalloproteinase 13，MMP-13）軟骨相關基因的表達，GAPDH為看家基因。各基因引物序列見表 1。以2-ΔΔCt法檢測各基因相對表達量，每個樣本設3個復孔。
表1
各基因引物序列
Table1.
Primer sequences of genes
1.4 統計學方法
采用SPSS18.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 軟骨前體細胞的分離培養及相關觀測
2.1.1 流式細胞儀鑒定
流式細胞儀檢測示，所培養細胞CD34（1.7%±0.2%）、CD45（2.6%±0.3%）呈陰性表達，CD90（91.0%±1.1%）、CD105（92.7%±1.1%）呈陽性表達，CD49e（96.7%±0.9%）呈高陽性表達。
2.1.2 軟骨前體細胞生長情況觀察
倒置相差顯微鏡觀察示，軟骨前體細胞呈現與干細胞相似的梭形形態，呈明顯集落樣克隆生長（圖 1），并且整個細胞集落隨時間推移逐漸增大。
圖1
軟骨前體細胞形態學觀察（倒置相差顯微鏡×100） ? ?2.1.3 軟骨前體細胞三系分化鑒定
茜素紅染色示成骨分化細胞被染成紅色；油紅O染色示成脂分化細胞出現紅染的脂肪滴；Ⅱ型膠原免疫組織化學染色呈陽性表現，成軟骨分化細胞細胞質及細胞外基質呈黃色。見圖 2。
2.2 不同濃度IL-1β對軟骨前體細胞分化的影響
2.2.1 組織學和免疫組織化學染色觀察
① HE染色示，B組細胞團塊明顯大于A組，C、D組明顯小于A組。A組中呈類圓形并生長于軟骨陷凹中的細胞明顯少于B組，而C、D組中可見較多肥大樣細胞，且D組肥大樣細胞多于C組，各組細胞密度未見明顯異常。② 番紅O染色示，B組紅染明顯深于A組，C、D組紅染均淺于B組，且D組淺于C組。③ Ⅱ型膠原及Ⅹ型膠原免疫組織化學染色示，B組染色均深于A組，C、D組染色均淺于B組，且D組淺于C組。見圖 3～6。
圖5
各組細胞團塊Ⅱ型膠原免疫組織化學染色觀察（×100） ? A組 ? B組 ? C組 ? D組 圖 6 各組細胞團塊Ⅹ型膠原免疫組織化學染色觀察（×100） ? A組 ? B組 ? C組 ? D組
Figure5.
Expressions of collagen type II with immunohistochemical staining (×100) ? Group A ? Group B ? Group C ? Group D Fig. 6 Expressions of collagen type X with immunohistochemical staining (×100) ? Group A ? Group B ? Group C ? Group D
2.2.2 生物化學成分測定
B組細胞外基質中GAG、總膠原相對含量及GAG/DNA比值均顯著高于A組，C、D組顯著低于B組，D組顯著低于C組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。B組DNA相對含量則明顯低于A組，C、D組明顯高于B組，差異有統計學意義（P＜0.05）；而C、D組間差異無統計學意義（P＞0.05）。 見表 2。
表2
各組細胞團塊生物化學成分測定（n=3，2.2.3 實時熒光定量PCR檢測
B組Ⅱ型膠原、Ⅹ型膠原、Sox-9 mRNA相對表達量均顯著高于A組，C、D組顯著低于B組，D組顯著低于C組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。而B組Runx-2和MMP-13 mRNA相對表達量均顯著低于A組，C、D組顯著高于B組，D組顯著高于C組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表 3。
表3
實時熒光定量PCR檢測各基因相對表達量
Table3.
Relative mRNA expressions of genes by real-time fluorescence quantitative PCR
3 討論
軟骨前體細胞作為組織工程軟骨修復的種子細胞，已得到廣泛關注[22]。本研究中，我們在兔正常軟骨細胞中通過纖連蛋白粘連分離出軟骨前體細胞。通過流式細胞儀細胞表型特征鑒定發現，軟骨前體細胞對CD34、CD45陰性表達可排除其造血系來源，對CD90、CD105均為陽性表達；這些特征均與2006年國際細胞移植學會對BMSCs的標準定義相似[23]，表現出干細胞的特征。但軟骨前體細胞對CD49e表現出高陽性特征，這可能是其特征性的一個標記[24]。在軟骨前體細胞的單克隆增殖培養中，細胞呈集落樣團簇生長，集落隨時間推移不斷增大，也反映出其單克隆特性。并且在其三系分化實驗中，我們發現軟骨前體細胞在不同培養基中可順利向成軟骨、成脂、成骨細胞分化。以上實驗揭示了軟骨前體細胞有與干細胞的自我克隆增殖相似的特性，是位于軟骨組織內的原始細胞，它具有自我增殖的能力。由于其自然存在于軟骨組織中，并具有自發向軟骨分化的潛能[25]，可能在軟骨受損時，比BMSCs、脂肪干細胞、滑膜干細胞[22, 26]更容易遷移至受損部位進行修復。因此，軟骨細胞在軟骨受損的修復過程中起著有限作用，而軟骨前體細胞則可能擔當了主要修復者的角色。
既往研究發現，軟骨損傷后修復效果差與其炎性環境有關[27]，臨床上也已用抗炎性介質藥物來減輕炎性介質對軟骨損傷后修復的抑制作用[28]。在IL-1β對軟骨前體細胞成軟骨分化影響的研究中，我們發現軟骨前體細胞經成軟骨誘導分化培養基誘導后，總膠原、GAG等細胞外基質成分合成均明顯增加，在組織學上有更多細胞呈軟骨細胞樣生長于軟骨陷凹中。然而IL-1β對細胞團塊中Ⅱ型膠原、GAG有明顯抑制作用，并且隨IL-1β的濃度增高，抑制作用明顯增強。這種作用在Ⅱ型膠原mRNA相對表達量的檢測中也得到驗證，因此我們認為IL-1β對Ⅱ型膠原的抑制作用是在合成水平進行抑制。MMP-13對Ⅱ型膠原有分解作用，而MMP-13在加入IL-1β的C、D組實時熒光定量PCR檢測中升高明顯，表明IL-1β對Ⅱ型膠原在細胞外的分解中起促進作用。IL-1β促使軟骨前體細胞在分化過程中對Ⅱ型膠原合成減少及分解增加的共同作用，使得細胞外基質Ⅱ型膠原含量下降。在對C、D組的檢測中發現，Sox-9作為一個必要的成軟骨轉錄因子[29]，其含量隨IL-1β濃度增高而明顯降低，Runx-2則表現出相反趨勢，表明IL-1β對持續誘導的軟骨前體細胞的成軟骨分化有明顯抑制作用，并且呈一定的濃度相關性。我們在組織學檢測中發現，IL-1β使持續誘導的軟骨前體細胞出現明顯肥大樣改變，這種細胞形態與軟骨細胞成骨時的肥大比較相似。由此我們推測，IL-1β對軟骨前體細胞的持續成軟骨誘導分化有抑制作用，并且有促進肥大的趨勢，進而提示有成骨分化可能，這與骨性關節炎患者的骨贅形成有相似之處[30]。
綜上述，本研究結果顯示，在正常軟骨中存在一種有干細胞特性的軟骨前體細胞，并且有克隆和潛在分化能力；IL-1β對軟骨前體細胞的成軟骨分化有抑制作用，并有促進成骨的可能。但我們的研究仍有不足之處：對軟骨前體細胞的分離是在正常軟骨中進行的，而在急性或慢性損傷的軟骨中未對其中軟骨前體細胞的生物學特性進一步研究。我們在炎性介質對軟骨前體細胞的分化影響研究中，僅取了 IL-1β 在0.1、1.0 ng/mL兩個濃度以及在3周時間點進行檢測，未進行更多濃度和時間點的研究，并且對另一重要炎性介質TNF-β未做相關實驗。下一步將對以上方面進行相應的深入研究。
關節軟骨由于自身組織無血管，其自身修復能力極為有限[1-2]，一旦損傷往往會遺留疼痛或功能障礙，最后易致關節退變及骨性關節炎[3]。目前，臨床上對關節軟骨損傷的主要治療方法有骨髓刺激技術（以微骨折術為代表[4-5]）、骨軟骨移植技術（以馬賽克技術為代表[6]）等，但結果均不令人滿意。組織工程學技術的興起令人們再次看到軟骨修復的希望。組織工程學涉及種子細胞、支架材料、生長因子3個主要因素。自體軟骨細胞移植已在臨床上應用[7]，但體外培養的軟骨細胞很容易發生去分化 [8-9]，而且得到的修復組織只能是纖維軟骨，而不是正常透明軟骨。BMSCs也曾被用作軟骨損傷修復的種子細胞，但其來源于骨髓而不是軟骨組織本身，并且具有自發向成骨分化的傾向，即使在體外誘導軟骨分化條件下，合成的基質仍主要是Ⅰ型膠原。近年來軟骨前體細胞的發現可能為我們揭示了早期軟骨損傷修復的本質[10-12]，目前對其研究已成為熱點[13-14]，但國內仍鮮有這方面報道。
軟骨在損傷后的修復過程中，細胞均處于一種炎性環境，炎性因子的釋放可能是導致軟骨損傷后修復困難的因素。近年來，人們對細胞外支架進行了許多研究，試圖通過改良支架來減輕炎性因子對植入種子細胞的抑制作用[15-16]；也有研究直接探討炎性因子對BMSCs、脂肪干細胞增殖、分化的影響[17-19]，以期減輕這種不利影響。Joos等[20]研究表明IL-1β對軟骨前體細胞的遷移有抑制作用。但目前尚未見關于IL-1β對軟骨前體細胞分化影響的研究。本研究從正常軟骨組織中消化并通過纖連蛋白粘連實驗分離出軟骨前體細胞，進行流式細胞鑒定、三系分化，并揭示不同濃度IL-1β對軟骨前體細胞向軟骨細胞分化的影響，以期為軟骨前體細胞在炎性環境下進行軟骨修復的研究奠定實驗基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
健康5月齡雄性新西蘭大白兔1只，體重3.1 kg，由南京醫科大學附屬南京醫院動物實驗中心所提供。動物飼養于晝夜循環、無限量水和食物供應的動物設施中；實驗方案經南京醫科大學附屬南京醫院倫理委員會批準。
Ⅱ型膠原抗體（Acris公司，美國）；纖連蛋白（GIBCO公司，美國）；IL-1β、TNF-α（Perprotech公司，美國）；成骨誘導分化培養基、成脂誘導分化培養基（Cyagen Bioscience公司，美國）；TGF-β3（Life公司，美國）；Ⅹ型膠原抗體、CD34、CD45、CD90、CD105、CD49e（Abcam公司，英國）；Hoechst 33258染料（Anaspec公司，美國）；Trizol （Invitrogen公司，美國）；cDNA第1鏈合成試劑盒（Fermentas公司，立陶宛）；OneStep SYBR? PrimerScript? RT-PCR試劑盒（Takara公司，日本）。
MCO-20AIC CO2培養箱（SANYO公司，日本）；
SW-CJ-1FB超凈臺（蘇州凈化設備有限公司）；BX53倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；LDZX-75KB立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫療器械廠）；FACS Calibur流式細胞儀（BD公司，美國）；Model1680酶聯免疫檢測儀（Bio-Rad公司，美國）；DA7600熒光定量PCR循環儀（中山大學達安基因股份有限公司）。
1.2 軟骨前體細胞的分離培養及相關觀測
1.2.1 軟骨前體細胞的分離培養
取新西蘭大白兔后肢膝關節面軟骨組織，用Ⅱ型膠原酶消化分離得到軟骨細胞[20]。將含軟骨細胞的DMEM培養液平均分配至處理好的培養皿（培養皿底部在實驗前1 d涂一層含10 mg/mL纖連蛋白、1 mmol/L MgCl2、1 mmol/L CaCl2的PBS液，并于4℃中過夜），放入37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養20 min；然后移除培養液及未粘連的細胞，在培養皿中加入適量含10%FBS的DMEM培養液，于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養，每3天換液1次，細胞在培養皿中生長至80%～90%融合時傳代。
1.2.2 流式細胞儀鑒定
取第3代生長良好的細胞，用0.02%EDTA-0.05%胰蛋白酶消化3 min，加入含10%FBS的DMEM培養液終止消化，收集細胞懸液至離心管，離心洗滌2次（每次均以1 500×g離心5 min），制成單細胞懸液。任選一管不加任何標記作為空白對照，其余數管分別加入FITC標記的CD34、CD45、CD90、CD105、CD49e。4℃條件下孵育1 h，PBS洗滌，多聚甲醛固定，上流式細胞儀分析。
1.2.3 細胞生長情況觀察
取第3代軟骨前體細胞單層培養，將1 000個細胞接種于培養皿中，加入含10%FBS的DMEM培養液，于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養，每3天換液1次，培養15 d，倒置相差顯微鏡觀察軟骨前體細胞生長情況。
1.2.4 軟骨前體細胞的三系分化檢測
① 成骨細胞分化與鑒定：將第3代軟骨前體細胞在成骨誘導分化培養基（含10%FBS、80 U/mL青霉素、0.08 mg/mL鏈霉素、10 mmol/mL β-甘油磷脂鈉、100 nmol/L地塞米松、0.1 mmol/L抗壞血酸磷酸鹽的H-DMEM培養基）培養，每周2次換全液，3周后4%甲醛固定，行茜素紅染色鑒定。
② 成脂肪細胞分化與鑒定：待第3代軟骨前體細胞接近完全融合時，繼續用含10%FBS的DMEM培養液培養3～7 d，然后用成脂誘導分化培養基（含1.0 μmol/mL地塞米松、0.5 mmol/mL 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、100 μmol/mL吲哚美辛、10 mg/L胰島素的H-DMEM培養基）培養48 h后，換液繼續培養48 h；再用成脂肪細胞維持體系（含10%FBS、10 mg/ L胰島素的H-DMEM培養基）繼續培養1周，吸除培養皿底部培養液，PBS洗滌細胞3次后加入4%多聚甲醛室溫下固定60 min，70%乙醇洗滌。油紅O染色后光鏡下觀察成脂肪細胞分化情況。
③ 成軟骨細胞分化與鑒定：取第3代生長良好的軟骨前體細胞，用0.02%EDTA-0.05%胰蛋白酶消化3 min，后加入含10%FBS的DMEM培養液終止消化，收集細胞懸液至離心管，以1 500×g離心5 min；棄上清液，同上法離心洗滌2次；然后用生理鹽水稀釋成1×105 個 / mL，取5 mL置入15 mL離心管中，以2 000×g離心5 min，小心移除上清液，細胞沉聚于離心管底部。在含細胞團塊的離心管中沿管壁緩慢注入成軟骨誘導分化培養基（含80 U/ mL青霉素、0.08 mg/mL鏈霉素、10 μg/mL胰島素、5.5 μg/ mL轉鐵蛋白、5 ng/ mL硒、0.1 μmol/mL地塞米松、 50 μg/ mL L-抗壞血酸、40 μg/mL脯氨酸、100 μg/mL丙酮酸、2.5 ng/ mL TGF-β3的H-DMEM培養基）5 mL，于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養24 h；細胞團塊懸起，每2～3天換全液，3周后細胞團塊呈軟骨樣組織。取該組織甲醛固定，作組織學切片（片厚5 μm），行Ⅱ型膠原免疫組織化學染色鑒定。
1.3 不同濃度IL-1β對軟骨前體細胞成軟骨分化的影響
根據使用的培養基不同將實驗分為4組，A組為普通DMEM培養基，B組為成軟骨誘導分化培養基，C組為成軟骨誘導分化培養基+0.1 ng/mL IL-1β，D組為成軟骨誘導分化培養基+1.0 ng/mL IL-1β。取軟骨前體細胞，分別放入各組相應培養基中，于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養24 h，每3天換全液，3周后進行以下觀測。
1.3.1 組織學及免疫組織化學染色觀察
取各組細胞團塊，10%甲醛固定，石蠟包埋，制作石蠟切片（片厚5 μm）。常規行HE染色、番紅O染色及Ⅱ型膠原和Ⅹ型膠原免疫組織化學染色觀察。
1.3.2 生物化學成分測定
各組取20 mg組織標本，酶標儀上于656 nm波長下檢測糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）相對含量，555 nm波長下檢測總膠原相對含量，260 nm波長下檢測DNA相對含量[21]，并計算GAG/DNA比值。
1.3.3 實時熒光定量PCR檢測基因表達
用Trizol試劑提取各組軟骨組織中的總RNA，利用OneStep SYBR? PrimeScript? RT-PCR試劑盒檢測Ⅱ型膠原、Ⅹ型膠原、Sox-9、Runx-2、基質金屬蛋白酶13（matrix metalloproteinase 13，MMP-13）軟骨相關基因的表達，GAPDH為看家基因。各基因引物序列見表 1。以2-ΔΔCt法檢測各基因相對表達量，每個樣本設3個復孔。
表1
各基因引物序列
Table1.
Primer sequences of genes
1.4 統計學方法
采用SPSS18.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 軟骨前體細胞的分離培養及相關觀測
2.1.1 流式細胞儀鑒定
流式細胞儀檢測示，所培養細胞CD34（1.7%±0.2%）、CD45（2.6%±0.3%）呈陰性表達，CD90（91.0%±1.1%）、CD105（92.7%±1.1%）呈陽性表達，CD49e（96.7%±0.9%）呈高陽性表達。
2.1.2 軟骨前體細胞生長情況觀察
倒置相差顯微鏡觀察示，軟骨前體細胞呈現與干細胞相似的梭形形態，呈明顯集落樣克隆生長（圖 1），并且整個細胞集落隨時間推移逐漸增大。
圖1
軟骨前體細胞形態學觀察（倒置相差顯微鏡×100） ? ?2.1.3 軟骨前體細胞三系分化鑒定
茜素紅染色示成骨分化細胞被染成紅色；油紅O染色示成脂分化細胞出現紅染的脂肪滴；Ⅱ型膠原免疫組織化學染色呈陽性表現，成軟骨分化細胞細胞質及細胞外基質呈黃色。見圖 2。
2.2 不同濃度IL-1β對軟骨前體細胞分化的影響
2.2.1 組織學和免疫組織化學染色觀察
① HE染色示，B組細胞團塊明顯大于A組，C、D組明顯小于A組。A組中呈類圓形并生長于軟骨陷凹中的細胞明顯少于B組，而C、D組中可見較多肥大樣細胞，且D組肥大樣細胞多于C組，各組細胞密度未見明顯異常。② 番紅O染色示，B組紅染明顯深于A組，C、D組紅染均淺于B組，且D組淺于C組。③ Ⅱ型膠原及Ⅹ型膠原免疫組織化學染色示，B組染色均深于A組，C、D組染色均淺于B組，且D組淺于C組。見圖 3～6。
圖5
各組細胞團塊Ⅱ型膠原免疫組織化學染色觀察（×100） ? A組 ? B組 ? C組 ? D組 圖 6 各組細胞團塊Ⅹ型膠原免疫組織化學染色觀察（×100） ? A組 ? B組 ? C組 ? D組
Figure5.
Expressions of collagen type II with immunohistochemical staining (×100) ? Group A ? Group B ? Group C ? Group D Fig. 6 Expressions of collagen type X with immunohistochemical staining (×100) ? Group A ? Group B ? Group C ? Group D
2.2.2 生物化學成分測定
B組細胞外基質中GAG、總膠原相對含量及GAG/DNA比值均顯著高于A組，C、D組顯著低于B組，D組顯著低于C組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。B組DNA相對含量則明顯低于A組，C、D組明顯高于B組，差異有統計學意義（P＜0.05）；而C、D組間差異無統計學意義（P＞0.05）。 見表 2。
表2
各組細胞團塊生物化學成分測定（n=3，2.2.3 實時熒光定量PCR檢測
B組Ⅱ型膠原、Ⅹ型膠原、Sox-9 mRNA相對表達量均顯著高于A組，C、D組顯著低于B組，D組顯著低于C組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。而B組Runx-2和MMP-13 mRNA相對表達量均顯著低于A組，C、D組顯著高于B組，D組顯著高于C組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表 3。
表3
實時熒光定量PCR檢測各基因相對表達量
Table3.
Relative mRNA expressions of genes by real-time fluorescence quantitative PCR
3 討論
軟骨前體細胞作為組織工程軟骨修復的種子細胞，已得到廣泛關注[22]。本研究中，我們在兔正常軟骨細胞中通過纖連蛋白粘連分離出軟骨前體細胞。通過流式細胞儀細胞表型特征鑒定發現，軟骨前體細胞對CD34、CD45陰性表達可排除其造血系來源，對CD90、CD105均為陽性表達；這些特征均與2006年國際細胞移植學會對BMSCs的標準定義相似[23]，表現出干細胞的特征。但軟骨前體細胞對CD49e表現出高陽性特征，這可能是其特征性的一個標記[24]。在軟骨前體細胞的單克隆增殖培養中，細胞呈集落樣團簇生長，集落隨時間推移不斷增大，也反映出其單克隆特性。并且在其三系分化實驗中，我們發現軟骨前體細胞在不同培養基中可順利向成軟骨、成脂、成骨細胞分化。以上實驗揭示了軟骨前體細胞有與干細胞的自我克隆增殖相似的特性，是位于軟骨組織內的原始細胞，它具有自我增殖的能力。由于其自然存在于軟骨組織中，并具有自發向軟骨分化的潛能[25]，可能在軟骨受損時，比BMSCs、脂肪干細胞、滑膜干細胞[22, 26]更容易遷移至受損部位進行修復。因此，軟骨細胞在軟骨受損的修復過程中起著有限作用，而軟骨前體細胞則可能擔當了主要修復者的角色。
既往研究發現，軟骨損傷后修復效果差與其炎性環境有關[27]，臨床上也已用抗炎性介質藥物來減輕炎性介質對軟骨損傷后修復的抑制作用[28]。在IL-1β對軟骨前體細胞成軟骨分化影響的研究中，我們發現軟骨前體細胞經成軟骨誘導分化培養基誘導后，總膠原、GAG等細胞外基質成分合成均明顯增加，在組織學上有更多細胞呈軟骨細胞樣生長于軟骨陷凹中。然而IL-1β對細胞團塊中Ⅱ型膠原、GAG有明顯抑制作用，并且隨IL-1β的濃度增高，抑制作用明顯增強。這種作用在Ⅱ型膠原mRNA相對表達量的檢測中也得到驗證，因此我們認為IL-1β對Ⅱ型膠原的抑制作用是在合成水平進行抑制。MMP-13對Ⅱ型膠原有分解作用，而MMP-13在加入IL-1β的C、D組實時熒光定量PCR檢測中升高明顯，表明IL-1β對Ⅱ型膠原在細胞外的分解中起促進作用。IL-1β促使軟骨前體細胞在分化過程中對Ⅱ型膠原合成減少及分解增加的共同作用，使得細胞外基質Ⅱ型膠原含量下降。在對C、D組的檢測中發現，Sox-9作為一個必要的成軟骨轉錄因子[29]，其含量隨IL-1β濃度增高而明顯降低，Runx-2則表現出相反趨勢，表明IL-1β對持續誘導的軟骨前體細胞的成軟骨分化有明顯抑制作用，并且呈一定的濃度相關性。我們在組織學檢測中發現，IL-1β使持續誘導的軟骨前體細胞出現明顯肥大樣改變，這種細胞形態與軟骨細胞成骨時的肥大比較相似。由此我們推測，IL-1β對軟骨前體細胞的持續成軟骨誘導分化有抑制作用，并且有促進肥大的趨勢，進而提示有成骨分化可能，這與骨性關節炎患者的骨贅形成有相似之處[30]。
綜上述，本研究結果顯示，在正常軟骨中存在一種有干細胞特性的軟骨前體細胞，并且有克隆和潛在分化能力；IL-1β對軟骨前體細胞的成軟骨分化有抑制作用，并有促進成骨的可能。但我們的研究仍有不足之處：對軟骨前體細胞的分離是在正常軟骨中進行的，而在急性或慢性損傷的軟骨中未對其中軟骨前體細胞的生物學特性進一步研究。我們在炎性介質對軟骨前體細胞的分化影響研究中，僅取了 IL-1β 在0.1、1.0 ng/mL兩個濃度以及在3周時間點進行檢測，未進行更多濃度和時間點的研究，并且對另一重要炎性介質TNF-β未做相關實驗。下一步將對以上方面進行相應的深入研究。
