引用本文： 喬威, 周敏, 劉長建, 喬彤. 外周血早晚期內皮祖細胞的生物學特性及鑒定的初步研究. 中國修復重建外科雜志, 2015, 29(7): 870-877. doi: 10.7507/1002-1892.20150188 復制
內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）參與出生后血管發生是血管生物學領域的重大研究發現。EPCs可歸巢至血管新生處參與新生內皮化并分化為內皮細胞，其在血管新生、血管修復、腫瘤病理及組織工程等方面有很大應用前景[1-4]。Asahara等[5]于1997年首先在人外周血中發現了循環其中的EPCs，此后關于EPCs的研究逐步深入。相關研究表明EPCs起源于骨髓，后釋放至外周血，參與成人血管新生[6]。然而，目前關于EPCs的鑒定仍有爭議。現階段EPCs常用的鑒定方法是根據其細胞表面表達的標記物如VEGF受體2（KDR）、AC133、CXCR4、CD34、CD133、c-Kit的表達和造血干細胞標志物的缺失來進行[5, 7-9]。既往多數研究將CD34+CD133+KDR+細胞定義為EPCs[1, 5]，但近來研究認為CD34+CD133+KDR+細胞群是造血干細胞而并非EPCs[7]。此外，乙酰化低密度脂蛋白（acetylated low density lipoprotein，ac-LDL）攝取及異凝集素結合的雙陽性細胞也被用于EPCs鑒定[10-11]，但這一特性并非EPCs特有，單核細胞（mononuclear cells，MNCs）/巨噬細胞也具有該項特征。既往研究中應用有限的鑒定標記常會鑒定出表型不一的不同細胞亞群，故用何種表面標記或哪些表面標記組合來鑒定EPCs仍有很大爭議。
目前報道[8-9, 12]發現有兩大類細胞亞群在EPCs培養過程中出現：① 早期EPCs在培養4～7 d出現，呈紡錘狀，表現為內皮-單核/造血細胞表型；② 晚期EPCs在培養2～3周后出現，具有分化為內皮系細胞的前體細胞體征，具有高分化潛能，呈鵝卵石樣。兩種細胞均來源于MNCs，在動物實驗中發現，可誘導參與血管發生，并在其過程中具有協同作用。本研究中，我們通過人外周血分離培養早晚期EPCs，并鑒定比較其形態學特征、細胞表型及功能特征，通過對比了解兩類EPCs生物學特性，以期發現兩類EPCs穩定的共有特征應用于EPCs的鑒定，為EPCs的研究和應用提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
成熟人主動脈內皮細胞（human aortic endothelial cells，HAECs；Clonetics公司，美國）。人纖維連接蛋白、FITC標記的荊豆凝集素Ⅰ（ulex europaeus Ⅰ，UEA-Ⅰ）、非酶型細胞消化液（Sigma公司，美國）；Ficoll-Paque人淋巴細胞分離液（Amersham公司，瑞士）；DiI標記的ac-LDL（Molecular Probes 公司，美國）；內皮細胞全培養基（endothelial cell basal medium 2，EBM-2-MV；含EBM-2基礎培養基及12 μg/mL牛腦提取物、10 ng/mL VEGF、10 ng/mL人EGF、50 ng/mL IGF-1、1 μg/mL氫化可的松及5%FBS；Cambrex公司，美國）；新鮮FBS、胰蛋白酶（GIBCO公司，美國）；單克隆抗體CD31-PE、CD34-PE、CD144-PE（BD公司，英國）；CD14-FITC、CD45-FITC、CD146-FITC（Immunotech公司，英國）；CD133-PE、Flt-1-PE、KDR-PE、細胞因子ELISA分析試劑盒（R&D公司，美國）；Trizol試劑盒（Invitrogen公司，美國）；逆轉錄試劑盒（TOYOBO公司，日本）；人內皮型一氧化氮合成酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）抗體、β-actin一抗、辣根過氧化物酶標記驢抗兔二抗（Santa Cruz公司，美國）；一氧化氮（nitric oxide，NO）定量分析試劑盒（Active Motif公司，美國）。WinMDI分析軟件、熒光顯微鏡、FACSCalibur型流式細胞儀（BD公司，美國）；CK40倒置蛋白質垂直電泳槽、穩壓穩流電泳儀、Quantity One圖像分析軟件（Bio-Rad公司，美國）；Prism 7500實時定量PCR系統（ABI公司，美國）；倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）。
1.2 EPCs的分離和培養
7份外周血來源于7名健康志愿者，其中男4名，女3名；年齡20～33歲。該研究經南京大學醫學院附屬南京鼓樓醫院醫學倫理委員會批準，志愿者對實驗方案均知情同意。經外周靜脈抽取50 mL靜脈血，PBS等體積稀釋后，加入含Ficoll-Paque人淋巴細胞分離液的離心管上層（兩者高度比為4∶6），常溫下以離心半徑15 cm、2 000 r/min離心30 min，小心吸取中間白膜層細胞，PBS洗滌2次后，以離心半徑15 cm、1 500 r/min離心8 min獲取外周血MNCs（peripheral blood MNCs，PBMCs）。將PBMCs重懸于含10%FBS的EBM-2-MV，以1×106 個接種于預先包被好纖維連接蛋白（5 μg/ cm2）的25 cm2細胞培養瓶或培養板中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養，3 d后換液除去未貼壁懸浮細胞，貼壁細胞繼續培養，以后每3天換液1次[9, 13]。每天于倒置相差顯微鏡下觀察貼壁細胞的形態和數量變化，待出現紡錘樣或鵝卵石樣細胞簇生長時，按Mead等[9]方法應用克隆分離圓筒分離出早晚期EPCs，分別進行培養，細胞約80%融合后以1∶3比例傳代培養。
1.3 觀測指標
1.3.1 細胞增殖能力檢測
取首次分離出的早晚期EPCs進行培養及細胞計數后，種植于含10%FBS的EBM-2-MV的細胞培養皿中培養，每次待細胞約80%融合時，應用非酶型細胞消化液進行消化傳代培養。每周均應用非酶型細胞消化液消化貼壁生長細胞，進行細胞計數，按以下公式計算每周細胞倍增水平：ln（細胞計數/初始細胞數）/ln2。同時以成熟HAECs作為對照，將第3代HAECs以1×104個種植于EBM-2-MV同一環境中培養，評估其細胞增殖水平作為對比。
1.3.2 流式細胞儀檢測細胞表面標記
取培養1 周的早期EPCs、培養5周的晚期EPCs及第3代HAECs，為保護細胞膜表面標記，將培養細胞用非酶型細胞消化液進行消化。然后將細胞于4℃下分別與CD31-PE、CD144-PE、CD34-PE、CD146-FITC、CD14-FITC、CD45-FITC、CD133-PE、KDR-PE及Flt-1-PE單克隆抗體于飽和濃度下孵育30 min，再用流式細胞儀進行定量熒光分析，并用WinMDI軟件對結果進行分析處理。計算平均熒光強度（mean fluorescence intensity，MFI），MFI＞2為陽性表達[14]。
1.3.3 DiI-ac-LDL和FITC-UEA-Ⅰ雙熒光染色分析
取培養1周的早、晚期EPCs加入4 μg/mL DiI-ac-LDL，置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱孵育2 h，PBS洗3次，2%多聚甲醛固定10 min，PBS漂洗，胰蛋白酶消化后，4℃下將細胞與50 μg/mL FITC-UEA-Ⅰ孵育1 h，最后于熒光顯微鏡下觀察。
1.3.4 RT-PCR檢測內皮型表面標記表達
取培養1周的早期EPCs，培養3、5周的晚期EPCs，第3 代HAECs及初次分離的PBMCs，采用RT-PCR檢測內皮型表面標記血管內皮型鈣黏蛋白（vascular endothelial cadherin，VE-cadherin）、KDR、eNOS、血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）表達情況。按Trizol說明書方法提取RNA樣本，總RNA（5 μg）通過逆轉錄試劑盒提取轉錄cDNA。隨后對每個cDNA 樣本（2 μL）進行PCR擴增，各基因設計引物序列、退火溫度及產物長度見表 1。擴增過程的熱循環程序如下：94℃、2 min；94℃、30 s，退火溫度30 s，72℃、30 s，72℃、10 min，40個循環。PCR產物通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳后在紫外燈下觀測，用 Quantity One圖像分析軟件分析基因相對表達量。
表1
RT-PCR各基因引物序列、退火溫度及產物長度
Table1.
Primer sequences,annealing temperature,and product size of RT-PCR genes
1.3.5 Western
blot檢測eNOS表達取培養1周的早期EPCs，培養3、5周的晚期EPCs及第3代HAECs，予以細胞裂解緩沖液[含62.5 mmol/L Tris-HCl（pH7.6）、100 mmol/L NaCl、1%SDS、1 mol/L苯甲基磺酰氟及10 μg/mL亮肽素]處理。細胞裂解后用Lowry法測定蛋白含量。等量蛋白于95℃下煮沸5 min進行變性處理，后置于含2-巰基乙醇的SDS樣品緩沖液中，行PAGE電泳；后蛋白轉印至聚偏氟乙烯膜上并應用人eNOS抗體（1∶1 000）進行免疫印跡分析，辣根過氧化物酶標記的驢抗兔抗體（1∶2 000）作為二抗。加入ECL化學發光劑反應、曝光，β-actin為對照；采用Quantity One圖像分析軟件進行半定量分析。
1.3.6 體外毛細血管形成實驗
首先將300 μL Matrigel凝膠鋪于24孔板內，并于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱孵育30 min；隨后應用非酶型細胞消化液消化培養1周的早、晚期EPCs，以5×104個與300 μL EBM-2-MV混合重懸后加入24孔板內，于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱孵育12 h后，倒置相差顯微鏡下觀察毛細血管管腔樣結構形成情況。
1.3.7 ELISA法檢測細胞因子表達
取培養1周的早期EPCs及培養5周的晚期EPCs，用基礎培養基EBM-2培養72 h后收集上清液，應用ELISA試劑盒檢測VEGF、粒細胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）、IL-8濃度。
1.3.8 NO產物檢測
取培養1周的早期EPCs及培養5周的晚期EPCs接種于EBM-2-MV培養基中，于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱孵育24 h，收集上清液并置于- 80℃凍干24 h。凍干上清重懸于其原體積1/5的NO定量分析試劑緩沖液中，后按試劑盒操作說明檢測原始上清中亞硝酸鹽及硝酸鹽總量，即為NO含量。
1.4 統計學方法
采用SPSS13.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；兩組間比較采用t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 細胞形態學變化
倒置相差顯微鏡觀察示，種植培養時約20%圓形PBMCs黏附貼壁生長；3～4 d后細胞開始成簇生長；培養4～7 d時，呈紡錘樣外觀拉長的早期EPCs出現，早期EPCs數持續增長約2周后不再增殖，并在4周內逐步消失；培養2～3周時，呈鵝卵石樣外觀的晚期EPCs出現，可成簇生長融合成克隆細胞群，并呈指數級增殖。見圖 1。
圖1
培養細胞的形態學觀察（倒置相差顯微鏡×100） ? 種植培養時圓形 PBMCs ? 培養3 d紡錘樣黏附生長細胞形成細胞簇 ? 培養10 d紡錘樣外觀早期EPCs出現 ? 培養12 d鵝卵石樣外觀晚期EPCs出現 ? 培養3周晚期EPCs克隆細胞群出現 ? 晚期EPCs呈指數級增殖箭頭示外生生長方向 ? ?2.2 細胞增殖能力檢測
每個外生增殖的晚期EPCs可迅速增殖至3.8×1013個；相應其可在13周時達到細胞群倍增45倍，之后增殖減慢，最終可達到48倍倍增水平，并可維持培養超過16周。而早期EPCs僅能維持培養4 周，增殖潛能低并會逐步死亡消失。對照HAECs在同樣培養條件下可達16倍倍增，可在培養環境下維持生長8周。見圖 2。
2.3 流式細胞儀檢測細胞表面標記
早、晚期EPCs及HEACs均低表達CD144、CD146、Flt-1和KDR。早期EPCs低表達CD31，不表達CD34和造血細胞系標記CD133，而對于造血干細胞標記CD14和CD45表達卻呈陽性。相反，晚期EPCs對于內皮型表面標記CD31和CD34表現為強陽性，但CD14、CD45、CD133表達則呈陰性，其與HAECs表達趨勢一致。見表 2。
表2
流式細胞儀檢測早、晚期EPCs及HAECs表面標記表達的MFI（n=7，2.4 DiI-ac-LDL和FITC-UEA-Ⅰ雙熒光染色分析
熒光顯微鏡觀察示，早、晚期EPCs均能攝取ac-LDL，并能與UEA-Ⅰ結合，表現為雙染色陽性細胞（圖 3）。
2.5 RT-PCR檢測內皮型表面標記表達
PBMCs僅表達eNOS及vWF，而早、晚期EPCs及HAECs均可表達eNOS、vWF、KDR及VE-cadher in，但早期EPCs的KDR及VE-cadherin基因相對表達量顯著低于晚期EPCs及HAECs，差異有統計學意義（P＜0.05）；vWF及eNOS各組間基因相對表達量比較差異無統計學意義（P＞0.05）。而晚期EPCs各基因表達有隨培養時間延長而增強的趨勢，培養5 周時晚期EPCs各基因相對表達量已與HAECs相似，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖 4。
圖4
RT-PCR檢測各細胞內皮型表面標記基因表達情況 1：PBMCs 2：HAECs 3：早期EPCs 4：晚期EPCs（培養3周） 5：晚期EPCs（培養5周） ? 凝膠電泳圖 ? 各基因相對表達量比較 ? ?2.6 Western blot檢測eNOS表達
HAECs、培養1周的早期EPCs及晚期（培養3、5周） EPCs均可表達eNOS，表達量分別為1.54±0.35、0.13±0.12、0.31±0.17、0.50±0.19，HAECs的eNOS表達量顯著高于早、晚期EPCs，差異有統計學意義（P＜0.05）；晚期EPCs隨培養時間延長其eNOS表達能力逐步增強，培養5周時EPCs的eNOS表達量明顯高于早期EPCs，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖 5。
2.7 體外毛細血管形成實驗
倒置相差顯微鏡觀察示，兩類EPCs體外毛細血管形成能力有明顯差異。早期EPCs僅表現為細胞拉長形成紡錘樣外觀，但不能形成毛細血管管狀結構；而晚期EPCs已形成穩定的血管腔樣結構。見圖 6。
2.8 ELISA法檢測細胞因子表達
早期EPCs上清液中VEGF、IL-8和G-CSF濃度分別為（641.13±87.62）、（299.45±43.41）、（932.82±90.82）pg/106個，均明顯高于晚期EPCs的（47.95± 14.45）、（36.67±14.16）、（75.78±19.15）pg/106個，比較差異有統計學意義（t=6.679，P=0.001；t=5.755，P=0.001；t=8.128，P=0.000）。
2.9 NO產物檢測
早、晚期EPCs NO含量分別為（60.11±11.24）、（84.10±14.99）nmol/106個，比較差異無統計學意義（t=1.281，P=0.231）。
3 討論
EPCs參與出生后病理生理的新生血管形成過程，其在組織工程、再生醫學及腫瘤生理等領域具有重要意義，應用前景廣泛。Kassmeyer等[15]認為EPCs其實是一組從造血干細胞至內皮系分化過程中不同階段的細胞群體總稱。故關于EPCs在血管生物學方面的鑒定及描述仍有很多爭議。有研究認為人EPCs可通過以下3個方法定義[16-18]：① 培養方法和形態學標準；② 單克隆抗體及熒光激活細胞分選術分析來篩選特定細胞群；③ 體外細胞集落形成分析。但這些方法仍存在缺陷。大多數研究中將不同細胞表面標記聯合測定方法用于鑒定EPCs，但哪種表面標記或哪些表面標記聯合表達可明確定義EPCs存在極大爭議。因EPCs和MNCs及巨噬細胞的表型重疊現象十分常見[19]，現階段并無特定的表面標記可用于EPCs的鑒定。此外，細胞具備根據外周環境調整自生抗原表型的特點，使得應用特定表面標記鑒定EPCs的方法并不可取[16, 20-21]。因此Timmermans等[7]提出，無論細胞表型如何，研究者均應將任何可能的潛在EPCs進行體內外功能檢測來鑒定其類型。所以，本研究中我們對早、晚期EPCs的特定表型及功能特征進行了檢測和比較，以期能發現一些特異性特征并通過研究提出一相對可靠的EPCs鑒定方法。
本研究中，我們體外培養PBMCs，發現在不同培養階段出現了兩類異質性細胞。兩類EPCs具有不同形態，并且其表面標記及基因表達方面表現也不相同。早期EPCs增殖潛能低，生存周期約3、4周，而晚期EPCs具有強大增殖潛能且生存期較長。兩種EPCs均可表達CD31、CD146和KDR表面標記，均攝取DiI-ac-LDL并和FITC-UEA-Ⅰ結合。然而早期EPCs表達CD14及CD45，表現更像單核 /造血干細胞系表型特征；而晚期EPCs表達CD31、CD34、CD144、 CD146和KDR，呈現明顯的內皮系表型特征。但晚期EPCs與成熟HAECs在增殖速率及細胞衰老等方面仍存在差異。
本研究發現，早、晚期EPCs對vWF和eNOS的表達水平類似。而對于晚期EPCs，KDR及VE-cadherin表達水平明顯較高，并且其內皮型表面標記表達水平隨培養時間延長逐步提高。說明培養晚期EPCs可能正逐步向成熟內皮細胞分化。
本研究體外毛細血管形成實驗結果與既往研究結果相符[13, 22]。Mukai等[23]曾比較兩種細胞成血管能力，發現早期EPCs會導致預存在管狀結構裂解，而晚期EPCs參與血管新生時血管網管腔結構的形成。其他研究[24-25]則發現兩類細胞在新生血管中起到的作用不同，若將兩類細胞混合種植，通過細胞因子及基質金屬蛋白酶的作用，兩類細胞在成血管方面可呈現協同作用。
有研究表明EPCs可分泌大量細胞因子促進細胞增殖、遷移和生存[26-27]。本研究中，早期EPCs可分泌IL-8、G-CSF和VEGF這3種血管生成因子，其產量明顯高于晚期EPCs，該結果與既往研究類似[25, 28]。這些細胞因子可活化鄰近內皮細胞促進提高血管新生，可用于解釋兩類EPCs在血管新生方面的不同功能作用機制。
eNOS的表達及NO釋放是內皮細胞重要特征，研究認為[29]其在EPCs遷移、分化、增殖方面具有重要作用，本研究發現兩類EPCs均可表達eNOS并具備分泌NO的能力。RT-PCR檢測示，早、晚期EPCs的eNOS基因相對表達量相當；而Western blot分析顯示，兩類細胞均表達eNOS，但與HEACs相比表達強度較低。此外，兩類EPCs均可穩定分泌釋放NO。從功能層面講，EPCs需具有分化至內皮細胞并參與血管新生的能力，而作為內皮細胞的重要功能，分泌產生NO的能力可認為是EPCs最可信的鑒定指標。因此我們認為，eNOS表達及NO分泌作為其可靠的生物學特性，可用于EPCs的鑒定。
本研究中，我們通過人外周血分離培養出早期及晚期EPCs。通過鑒定發現，早晚期EPCs擁有一些共同表型特征，如表達一些內皮型抗原；但也發現兩類細胞在外形特征、表面標記、增殖能力、生存特性及基因表達方面存在明顯差異；而在體外功能特性方面，其在體外毛細血管形成能力及細胞因子分泌水平方面也存在不同。雖然存在很多不同特性，但實驗中我們也發現兩類細胞均可穩定表達eNOS，并具備分泌NO能力。至今仍無單一的鑒定方式定義EPCs，缺乏獨特的EPCs表面標記及EPCs的異質性導致定義EPCs十分困難[30]。因此，我們認為聯合多種方法的鑒定方式用于EPCs鑒定更為可行。就表面標記而言，鑒定EPCs的最佳途徑應囊括越多表面標記越好，并且需特定表面標記來定義不同亞群細胞；而另一方面，EPCs需要具備分化為內皮細胞參與血管新生的特性，使其可應用于不同研究領域。故我們認為，諸如eNOS表達、NO分泌、對生長因子反應以及分化為內皮細胞等方面的功能分析應引起重視，并應用于EPCs的鑒定。因而，我們推薦應用KDR、CD34及CD144表達聯合eNOS表達檢測用于EPCs的鑒定。
內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）參與出生后血管發生是血管生物學領域的重大研究發現。EPCs可歸巢至血管新生處參與新生內皮化并分化為內皮細胞，其在血管新生、血管修復、腫瘤病理及組織工程等方面有很大應用前景[1-4]。Asahara等[5]于1997年首先在人外周血中發現了循環其中的EPCs，此后關于EPCs的研究逐步深入。相關研究表明EPCs起源于骨髓，后釋放至外周血，參與成人血管新生[6]。然而，目前關于EPCs的鑒定仍有爭議。現階段EPCs常用的鑒定方法是根據其細胞表面表達的標記物如VEGF受體2（KDR）、AC133、CXCR4、CD34、CD133、c-Kit的表達和造血干細胞標志物的缺失來進行[5, 7-9]。既往多數研究將CD34+CD133+KDR+細胞定義為EPCs[1, 5]，但近來研究認為CD34+CD133+KDR+細胞群是造血干細胞而并非EPCs[7]。此外，乙酰化低密度脂蛋白（acetylated low density lipoprotein，ac-LDL）攝取及異凝集素結合的雙陽性細胞也被用于EPCs鑒定[10-11]，但這一特性并非EPCs特有，單核細胞（mononuclear cells，MNCs）/巨噬細胞也具有該項特征。既往研究中應用有限的鑒定標記常會鑒定出表型不一的不同細胞亞群，故用何種表面標記或哪些表面標記組合來鑒定EPCs仍有很大爭議。
目前報道[8-9, 12]發現有兩大類細胞亞群在EPCs培養過程中出現：① 早期EPCs在培養4～7 d出現，呈紡錘狀，表現為內皮-單核/造血細胞表型；② 晚期EPCs在培養2～3周后出現，具有分化為內皮系細胞的前體細胞體征，具有高分化潛能，呈鵝卵石樣。兩種細胞均來源于MNCs，在動物實驗中發現，可誘導參與血管發生，并在其過程中具有協同作用。本研究中，我們通過人外周血分離培養早晚期EPCs，并鑒定比較其形態學特征、細胞表型及功能特征，通過對比了解兩類EPCs生物學特性，以期發現兩類EPCs穩定的共有特征應用于EPCs的鑒定，為EPCs的研究和應用提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
成熟人主動脈內皮細胞（human aortic endothelial cells，HAECs；Clonetics公司，美國）。人纖維連接蛋白、FITC標記的荊豆凝集素Ⅰ（ulex europaeus Ⅰ，UEA-Ⅰ）、非酶型細胞消化液（Sigma公司，美國）；Ficoll-Paque人淋巴細胞分離液（Amersham公司，瑞士）；DiI標記的ac-LDL（Molecular Probes 公司，美國）；內皮細胞全培養基（endothelial cell basal medium 2，EBM-2-MV；含EBM-2基礎培養基及12 μg/mL牛腦提取物、10 ng/mL VEGF、10 ng/mL人EGF、50 ng/mL IGF-1、1 μg/mL氫化可的松及5%FBS；Cambrex公司，美國）；新鮮FBS、胰蛋白酶（GIBCO公司，美國）；單克隆抗體CD31-PE、CD34-PE、CD144-PE（BD公司，英國）；CD14-FITC、CD45-FITC、CD146-FITC（Immunotech公司，英國）；CD133-PE、Flt-1-PE、KDR-PE、細胞因子ELISA分析試劑盒（R&D公司，美國）；Trizol試劑盒（Invitrogen公司，美國）；逆轉錄試劑盒（TOYOBO公司，日本）；人內皮型一氧化氮合成酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）抗體、β-actin一抗、辣根過氧化物酶標記驢抗兔二抗（Santa Cruz公司，美國）；一氧化氮（nitric oxide，NO）定量分析試劑盒（Active Motif公司，美國）。WinMDI分析軟件、熒光顯微鏡、FACSCalibur型流式細胞儀（BD公司，美國）；CK40倒置蛋白質垂直電泳槽、穩壓穩流電泳儀、Quantity One圖像分析軟件（Bio-Rad公司，美國）；Prism 7500實時定量PCR系統（ABI公司，美國）；倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）。
1.2 EPCs的分離和培養
7份外周血來源于7名健康志愿者，其中男4名，女3名；年齡20～33歲。該研究經南京大學醫學院附屬南京鼓樓醫院醫學倫理委員會批準，志愿者對實驗方案均知情同意。經外周靜脈抽取50 mL靜脈血，PBS等體積稀釋后，加入含Ficoll-Paque人淋巴細胞分離液的離心管上層（兩者高度比為4∶6），常溫下以離心半徑15 cm、2 000 r/min離心30 min，小心吸取中間白膜層細胞，PBS洗滌2次后，以離心半徑15 cm、1 500 r/min離心8 min獲取外周血MNCs（peripheral blood MNCs，PBMCs）。將PBMCs重懸于含10%FBS的EBM-2-MV，以1×106 個接種于預先包被好纖維連接蛋白（5 μg/ cm2）的25 cm2細胞培養瓶或培養板中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養，3 d后換液除去未貼壁懸浮細胞，貼壁細胞繼續培養，以后每3天換液1次[9, 13]。每天于倒置相差顯微鏡下觀察貼壁細胞的形態和數量變化，待出現紡錘樣或鵝卵石樣細胞簇生長時，按Mead等[9]方法應用克隆分離圓筒分離出早晚期EPCs，分別進行培養，細胞約80%融合后以1∶3比例傳代培養。
1.3 觀測指標
1.3.1 細胞增殖能力檢測
取首次分離出的早晚期EPCs進行培養及細胞計數后，種植于含10%FBS的EBM-2-MV的細胞培養皿中培養，每次待細胞約80%融合時，應用非酶型細胞消化液進行消化傳代培養。每周均應用非酶型細胞消化液消化貼壁生長細胞，進行細胞計數，按以下公式計算每周細胞倍增水平：ln（細胞計數/初始細胞數）/ln2。同時以成熟HAECs作為對照，將第3代HAECs以1×104個種植于EBM-2-MV同一環境中培養，評估其細胞增殖水平作為對比。
1.3.2 流式細胞儀檢測細胞表面標記
取培養1 周的早期EPCs、培養5周的晚期EPCs及第3代HAECs，為保護細胞膜表面標記，將培養細胞用非酶型細胞消化液進行消化。然后將細胞于4℃下分別與CD31-PE、CD144-PE、CD34-PE、CD146-FITC、CD14-FITC、CD45-FITC、CD133-PE、KDR-PE及Flt-1-PE單克隆抗體于飽和濃度下孵育30 min，再用流式細胞儀進行定量熒光分析，并用WinMDI軟件對結果進行分析處理。計算平均熒光強度（mean fluorescence intensity，MFI），MFI＞2為陽性表達[14]。
1.3.3 DiI-ac-LDL和FITC-UEA-Ⅰ雙熒光染色分析
取培養1周的早、晚期EPCs加入4 μg/mL DiI-ac-LDL，置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱孵育2 h，PBS洗3次，2%多聚甲醛固定10 min，PBS漂洗，胰蛋白酶消化后，4℃下將細胞與50 μg/mL FITC-UEA-Ⅰ孵育1 h，最后于熒光顯微鏡下觀察。
1.3.4 RT-PCR檢測內皮型表面標記表達
取培養1周的早期EPCs，培養3、5周的晚期EPCs，第3 代HAECs及初次分離的PBMCs，采用RT-PCR檢測內皮型表面標記血管內皮型鈣黏蛋白（vascular endothelial cadherin，VE-cadherin）、KDR、eNOS、血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）表達情況。按Trizol說明書方法提取RNA樣本，總RNA（5 μg）通過逆轉錄試劑盒提取轉錄cDNA。隨后對每個cDNA 樣本（2 μL）進行PCR擴增，各基因設計引物序列、退火溫度及產物長度見表 1。擴增過程的熱循環程序如下：94℃、2 min；94℃、30 s，退火溫度30 s，72℃、30 s，72℃、10 min，40個循環。PCR產物通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳后在紫外燈下觀測，用 Quantity One圖像分析軟件分析基因相對表達量。
表1
RT-PCR各基因引物序列、退火溫度及產物長度
Table1.
Primer sequences,annealing temperature,and product size of RT-PCR genes
1.3.5 Western
blot檢測eNOS表達取培養1周的早期EPCs，培養3、5周的晚期EPCs及第3代HAECs，予以細胞裂解緩沖液[含62.5 mmol/L Tris-HCl（pH7.6）、100 mmol/L NaCl、1%SDS、1 mol/L苯甲基磺酰氟及10 μg/mL亮肽素]處理。細胞裂解后用Lowry法測定蛋白含量。等量蛋白于95℃下煮沸5 min進行變性處理，后置于含2-巰基乙醇的SDS樣品緩沖液中，行PAGE電泳；后蛋白轉印至聚偏氟乙烯膜上并應用人eNOS抗體（1∶1 000）進行免疫印跡分析，辣根過氧化物酶標記的驢抗兔抗體（1∶2 000）作為二抗。加入ECL化學發光劑反應、曝光，β-actin為對照；采用Quantity One圖像分析軟件進行半定量分析。
1.3.6 體外毛細血管形成實驗
首先將300 μL Matrigel凝膠鋪于24孔板內，并于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱孵育30 min；隨后應用非酶型細胞消化液消化培養1周的早、晚期EPCs，以5×104個與300 μL EBM-2-MV混合重懸后加入24孔板內，于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱孵育12 h后，倒置相差顯微鏡下觀察毛細血管管腔樣結構形成情況。
1.3.7 ELISA法檢測細胞因子表達
取培養1周的早期EPCs及培養5周的晚期EPCs，用基礎培養基EBM-2培養72 h后收集上清液，應用ELISA試劑盒檢測VEGF、粒細胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）、IL-8濃度。
1.3.8 NO產物檢測
取培養1周的早期EPCs及培養5周的晚期EPCs接種于EBM-2-MV培養基中，于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱孵育24 h，收集上清液并置于- 80℃凍干24 h。凍干上清重懸于其原體積1/5的NO定量分析試劑緩沖液中，后按試劑盒操作說明檢測原始上清中亞硝酸鹽及硝酸鹽總量，即為NO含量。
1.4 統計學方法
采用SPSS13.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；兩組間比較采用t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 細胞形態學變化
倒置相差顯微鏡觀察示，種植培養時約20%圓形PBMCs黏附貼壁生長；3～4 d后細胞開始成簇生長；培養4～7 d時，呈紡錘樣外觀拉長的早期EPCs出現，早期EPCs數持續增長約2周后不再增殖，并在4周內逐步消失；培養2～3周時，呈鵝卵石樣外觀的晚期EPCs出現，可成簇生長融合成克隆細胞群，并呈指數級增殖。見圖 1。
圖1
培養細胞的形態學觀察（倒置相差顯微鏡×100） ? 種植培養時圓形 PBMCs ? 培養3 d紡錘樣黏附生長細胞形成細胞簇 ? 培養10 d紡錘樣外觀早期EPCs出現 ? 培養12 d鵝卵石樣外觀晚期EPCs出現 ? 培養3周晚期EPCs克隆細胞群出現 ? 晚期EPCs呈指數級增殖箭頭示外生生長方向 ? ?2.2 細胞增殖能力檢測
每個外生增殖的晚期EPCs可迅速增殖至3.8×1013個；相應其可在13周時達到細胞群倍增45倍，之后增殖減慢，最終可達到48倍倍增水平，并可維持培養超過16周。而早期EPCs僅能維持培養4 周，增殖潛能低并會逐步死亡消失。對照HAECs在同樣培養條件下可達16倍倍增，可在培養環境下維持生長8周。見圖 2。
2.3 流式細胞儀檢測細胞表面標記
早、晚期EPCs及HEACs均低表達CD144、CD146、Flt-1和KDR。早期EPCs低表達CD31，不表達CD34和造血細胞系標記CD133，而對于造血干細胞標記CD14和CD45表達卻呈陽性。相反，晚期EPCs對于內皮型表面標記CD31和CD34表現為強陽性，但CD14、CD45、CD133表達則呈陰性，其與HAECs表達趨勢一致。見表 2。
表2
流式細胞儀檢測早、晚期EPCs及HAECs表面標記表達的MFI（n=7，2.4 DiI-ac-LDL和FITC-UEA-Ⅰ雙熒光染色分析
熒光顯微鏡觀察示，早、晚期EPCs均能攝取ac-LDL，并能與UEA-Ⅰ結合，表現為雙染色陽性細胞（圖 3）。
2.5 RT-PCR檢測內皮型表面標記表達
PBMCs僅表達eNOS及vWF，而早、晚期EPCs及HAECs均可表達eNOS、vWF、KDR及VE-cadher in，但早期EPCs的KDR及VE-cadherin基因相對表達量顯著低于晚期EPCs及HAECs，差異有統計學意義（P＜0.05）；vWF及eNOS各組間基因相對表達量比較差異無統計學意義（P＞0.05）。而晚期EPCs各基因表達有隨培養時間延長而增強的趨勢，培養5 周時晚期EPCs各基因相對表達量已與HAECs相似，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖 4。
圖4
RT-PCR檢測各細胞內皮型表面標記基因表達情況 1：PBMCs 2：HAECs 3：早期EPCs 4：晚期EPCs（培養3周） 5：晚期EPCs（培養5周） ? 凝膠電泳圖 ? 各基因相對表達量比較 ? ?2.6 Western blot檢測eNOS表達
HAECs、培養1周的早期EPCs及晚期（培養3、5周） EPCs均可表達eNOS，表達量分別為1.54±0.35、0.13±0.12、0.31±0.17、0.50±0.19，HAECs的eNOS表達量顯著高于早、晚期EPCs，差異有統計學意義（P＜0.05）；晚期EPCs隨培養時間延長其eNOS表達能力逐步增強，培養5周時EPCs的eNOS表達量明顯高于早期EPCs，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖 5。
2.7 體外毛細血管形成實驗
倒置相差顯微鏡觀察示，兩類EPCs體外毛細血管形成能力有明顯差異。早期EPCs僅表現為細胞拉長形成紡錘樣外觀，但不能形成毛細血管管狀結構；而晚期EPCs已形成穩定的血管腔樣結構。見圖 6。
2.8 ELISA法檢測細胞因子表達
早期EPCs上清液中VEGF、IL-8和G-CSF濃度分別為（641.13±87.62）、（299.45±43.41）、（932.82±90.82）pg/106個，均明顯高于晚期EPCs的（47.95± 14.45）、（36.67±14.16）、（75.78±19.15）pg/106個，比較差異有統計學意義（t=6.679，P=0.001；t=5.755，P=0.001；t=8.128，P=0.000）。
2.9 NO產物檢測
早、晚期EPCs NO含量分別為（60.11±11.24）、（84.10±14.99）nmol/106個，比較差異無統計學意義（t=1.281，P=0.231）。
3 討論
EPCs參與出生后病理生理的新生血管形成過程，其在組織工程、再生醫學及腫瘤生理等領域具有重要意義，應用前景廣泛。Kassmeyer等[15]認為EPCs其實是一組從造血干細胞至內皮系分化過程中不同階段的細胞群體總稱。故關于EPCs在血管生物學方面的鑒定及描述仍有很多爭議。有研究認為人EPCs可通過以下3個方法定義[16-18]：① 培養方法和形態學標準；② 單克隆抗體及熒光激活細胞分選術分析來篩選特定細胞群；③ 體外細胞集落形成分析。但這些方法仍存在缺陷。大多數研究中將不同細胞表面標記聯合測定方法用于鑒定EPCs，但哪種表面標記或哪些表面標記聯合表達可明確定義EPCs存在極大爭議。因EPCs和MNCs及巨噬細胞的表型重疊現象十分常見[19]，現階段并無特定的表面標記可用于EPCs的鑒定。此外，細胞具備根據外周環境調整自生抗原表型的特點，使得應用特定表面標記鑒定EPCs的方法并不可取[16, 20-21]。因此Timmermans等[7]提出，無論細胞表型如何，研究者均應將任何可能的潛在EPCs進行體內外功能檢測來鑒定其類型。所以，本研究中我們對早、晚期EPCs的特定表型及功能特征進行了檢測和比較，以期能發現一些特異性特征并通過研究提出一相對可靠的EPCs鑒定方法。
本研究中，我們體外培養PBMCs，發現在不同培養階段出現了兩類異質性細胞。兩類EPCs具有不同形態，并且其表面標記及基因表達方面表現也不相同。早期EPCs增殖潛能低，生存周期約3、4周，而晚期EPCs具有強大增殖潛能且生存期較長。兩種EPCs均可表達CD31、CD146和KDR表面標記，均攝取DiI-ac-LDL并和FITC-UEA-Ⅰ結合。然而早期EPCs表達CD14及CD45，表現更像單核 /造血干細胞系表型特征；而晚期EPCs表達CD31、CD34、CD144、 CD146和KDR，呈現明顯的內皮系表型特征。但晚期EPCs與成熟HAECs在增殖速率及細胞衰老等方面仍存在差異。
本研究發現，早、晚期EPCs對vWF和eNOS的表達水平類似。而對于晚期EPCs，KDR及VE-cadherin表達水平明顯較高，并且其內皮型表面標記表達水平隨培養時間延長逐步提高。說明培養晚期EPCs可能正逐步向成熟內皮細胞分化。
本研究體外毛細血管形成實驗結果與既往研究結果相符[13, 22]。Mukai等[23]曾比較兩種細胞成血管能力，發現早期EPCs會導致預存在管狀結構裂解，而晚期EPCs參與血管新生時血管網管腔結構的形成。其他研究[24-25]則發現兩類細胞在新生血管中起到的作用不同，若將兩類細胞混合種植，通過細胞因子及基質金屬蛋白酶的作用，兩類細胞在成血管方面可呈現協同作用。
有研究表明EPCs可分泌大量細胞因子促進細胞增殖、遷移和生存[26-27]。本研究中，早期EPCs可分泌IL-8、G-CSF和VEGF這3種血管生成因子，其產量明顯高于晚期EPCs，該結果與既往研究類似[25, 28]。這些細胞因子可活化鄰近內皮細胞促進提高血管新生，可用于解釋兩類EPCs在血管新生方面的不同功能作用機制。
eNOS的表達及NO釋放是內皮細胞重要特征，研究認為[29]其在EPCs遷移、分化、增殖方面具有重要作用，本研究發現兩類EPCs均可表達eNOS并具備分泌NO的能力。RT-PCR檢測示，早、晚期EPCs的eNOS基因相對表達量相當；而Western blot分析顯示，兩類細胞均表達eNOS，但與HEACs相比表達強度較低。此外，兩類EPCs均可穩定分泌釋放NO。從功能層面講，EPCs需具有分化至內皮細胞并參與血管新生的能力，而作為內皮細胞的重要功能，分泌產生NO的能力可認為是EPCs最可信的鑒定指標。因此我們認為，eNOS表達及NO分泌作為其可靠的生物學特性，可用于EPCs的鑒定。
本研究中，我們通過人外周血分離培養出早期及晚期EPCs。通過鑒定發現，早晚期EPCs擁有一些共同表型特征，如表達一些內皮型抗原；但也發現兩類細胞在外形特征、表面標記、增殖能力、生存特性及基因表達方面存在明顯差異；而在體外功能特性方面，其在體外毛細血管形成能力及細胞因子分泌水平方面也存在不同。雖然存在很多不同特性，但實驗中我們也發現兩類細胞均可穩定表達eNOS，并具備分泌NO能力。至今仍無單一的鑒定方式定義EPCs，缺乏獨特的EPCs表面標記及EPCs的異質性導致定義EPCs十分困難[30]。因此，我們認為聯合多種方法的鑒定方式用于EPCs鑒定更為可行。就表面標記而言，鑒定EPCs的最佳途徑應囊括越多表面標記越好，并且需特定表面標記來定義不同亞群細胞；而另一方面，EPCs需要具備分化為內皮細胞參與血管新生的特性，使其可應用于不同研究領域。故我們認為，諸如eNOS表達、NO分泌、對生長因子反應以及分化為內皮細胞等方面的功能分析應引起重視，并應用于EPCs的鑒定。因而，我們推薦應用KDR、CD34及CD144表達聯合eNOS表達檢測用于EPCs的鑒定。
