引用本文： 閆成, 薛改, 吳麗穎, 劉建芳, 侯艷寧. 大鼠纖維化肝組織勻漿上清液誘導人臍帶間充質干細胞向肝細胞分化的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2015, 29(7): 878-883. doi: 10.7507/1002-1892.20150189 復制
干細胞是一類未分化的細胞或原始細胞，具有很強的自我復制能力及向多種類型細胞分化的潛能[1]。近年來，隨著組織工程技術的進展，干細胞移植在治療肝臟疾病、心臟疾病、腎臟疾病、內分泌系統疾病等方面取得了喜人的成果[2-5]。其中，人臍帶間充質干細胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，HUCMSCs）由于來源廣泛、免疫原性低，且對其研究不涉及倫理道德和法律問題，逐漸成為干細胞的研究熱點。大量臨床試驗及動物研究證實干細胞移植可改善肝纖維化患者及動物的肝功能，促進病情好轉，然而確切的治療機制尚不明確[6-9]。多項研究表明，干細胞所處的組織微環境對其存活、增殖、分化等有非常重要的影響，干細胞移植后可歸巢至受損組織器官并向受損組織細胞分化，這可能是干細胞治療的機制之一[10-12]。本研究應用肝纖維化大鼠肝組織勻漿上清液體外模擬肝纖維化微環境對HUCMSCs進行誘導，通過觀察細胞形態學變化，檢測甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）、細胞角蛋白18（cytokeratin 18，CK18）等肝細胞特異性標志物和代謝功能酶CYP3A4的表達，以及儲存糖原、合成尿素（blood urea nitrogen，BUN）、分泌白蛋白（albumin，ALB）等肝細胞相關功能，評估HUCMSCs在特定條件下的分化潛能，旨在為干細胞移植治療肝纖維化提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
42日齡健康雄性清潔級SD大鼠24只，體重180～220 g，購自河北省實驗動物中心，實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學要求。
QSG7701人肝細胞株（上海拜力生物科技有限公司）；DMEM/F12培養基、FBS（HyClone公司，美國）；抗AFP、抗CK18、抗CYP3A4兔多克隆抗體（天津美諾路生物技術有限公司）；抗β-actin鼠單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG、辣根過氧化物酶標記山羊抗鼠IgG（Proteintech公司，美國）；BUN測試盒（南京建成生物工程研究所）；ALB ELISA試劑盒（蘇州卡爾文生物科技有限公司）；糖原過碘酸-雪夫（periodic acid-schiff，PAS）染色液（細胞真菌專用，北京雷根生物技術有限公司）；硫代乙酰胺（Sigma公司，美國）。Elipse-Tis倒置顯微鏡（Nikon公司，日本）；BX41顯微圖像微機處理系統（Olympus公司，日本）；3K15臺式冷凍離心機（Sigma公司，美國）。
1.2 HUCMSCs的獲取
本實驗所用HUCMSCs為解放軍白求恩國際和平醫院藥劑科藥理學實驗室原代培養后凍存，原代HUCM SCs的獲取及鑒定方法見文獻[13]。將凍存于液氮的原代HUCMSCs取出后迅速于37℃水浴中融化，以離心半徑7 cm、800 r/min離心5 min，棄凍存液，用含10%FBS的DMEM/F12培養基進行傳代培養，取第3代細胞備用。
1.3 大鼠肝纖維化誘導培養基的制備
24只大鼠適應性飼養1周后，采用隨機數字表法分為2組：對照組6只，正常飼養；造模組18只，參照文獻[14]方法建立大鼠肝纖維化模型，即給予3%硫代乙酰胺生理鹽水溶液腹腔注射，每周2次，每次200 mg/kg，共4周。
4周時將所有大鼠于2%戊巴比妥鈉腹腔注射（0.3 mL/100 g）麻醉后開腹，用4℃預冷的生理鹽水自肝門靜脈進行肝臟灌流20 min，取肝組織進行病理學鑒定（HE染色法），觀察并比較對照組與造模組肝組織的染色結果，并取造模組纖維化肝組織用于制備肝纖維化誘導培養基。誘導培養基制備：纖維化肝組織稱取濕重，按50 g/L加入含10%FBS的DMEM/F12培養基，冰浴條件下用勻漿器將肝組織勻漿，再于4℃、15 000×g離心30 min，取上清液，用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，-70℃冰箱保存備用。
1.4 HUCMSCs向肝細胞誘導分化
實驗分為2組，實驗組取第3代HUCMSCs，以1×105個/mL密度接種于6孔板中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養，待細胞長至80%匯合時，吸棄培養液，加入肝纖維化誘導培養基誘導培養7 d；對照組取第3代HUCMSCs，僅以含10%FBS的DMEM/F12培養基培養。
1.4.1 細胞形態學觀察
培養期間倒置顯微鏡觀察兩組HUCMSCs的形態學變化。
1.4.2 Western
blot檢測收集誘導7 d的實驗組及對照組細胞，采用細胞裂解法提取細胞總蛋白，用BCA法進行總蛋白定量。SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，采用濕式電轉印法將蛋白轉至聚偏氟乙烯膜，用含5%脫脂奶粉的Tween-PBS封閉2 h后，分別加入AFP（1∶500）、CK18（1∶500）、CYP3A4（1∶1 000）、 β-actin （1∶2 000） 一抗，4℃搖動過夜；洗膜后加入對應二抗（1∶2 000），孵育2 h后進行顯影、曝光，膠片掃描后應用Image J軟件進行灰度分析，實驗重復測量3次，取均值。設定QSG7701人肝細胞株為陽性對照。
1.4.3 BUN合成功能測定
誘導7 d后棄各組培養液，每孔加入含5 mmol/L NH4Cl的無血清DMEM/F12培養液1.5 mL，于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱繼續孵育24 h，取上清液，參照BUN測試盒說明書采用二乙酰肟比色法測定BUN含量。
1.4.4 ALB分泌功能測定
誘導7 d后棄各組培養液，每孔加入無血清DMEM/F12培養液1.5 mL，于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱繼續孵育96 h，取上清液，參照ALB ELISA試劑盒說明書采用ELISA法測定ALB含量。
1.4.5 糖原PAS染色觀察
誘導7 d后棄各組培養液，參照PAS染色液說明書對細胞進行PAS染色，應用BX41顯微圖像微機處理系統觀察。
1.5 統計學方法
采用SPSS13.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 肝纖維化大鼠肝組織病理學觀察
HE染色示，與對照組正常肝組織相比，4周時造模組大鼠肝組織可見部分肝細胞壞死，大量炎性細胞浸潤，肝小葉結構破壞，膠原纖維增生明顯，部分區域假小葉形成。見圖 1。
圖1
4周時對照組及造模組大鼠肝組織病理學觀察 ? 對照組（HE×100） ? 造模組（HE×100） ? 對照組（HE×400） ? 造模組（HE×400） ? ?2.2 HUCMSCs向肝細胞誘導分化
2.2.1 細胞形態學觀察
倒置顯微鏡觀察示，對照組為密集排列的長梭形成纖維樣細胞，細胞核可見。實驗組誘導后1 d，可見細胞兩極回縮，胞體變短；2 d時胞體進一步變短、變圓；7 d時細胞呈不規則形或類圓形，胞體豐滿。見圖 2。
2.2.2 Western
blot檢測 Western blot檢測示，對照組細胞未見AFP、CK18、CYP3A4表達；實驗組和陽性對照組細胞可表達肝細胞特異性標志物AFP、CK18，并可表達與代謝功能相關的重要蛋白CYP3A4。見圖 3。灰度分析結果示，實驗組AFP、CK18、CYP3A4相對表達量分別為0.61±0.01、0.69±0.02、0.79±0.04，均低于陽性對照組的1.00± 0.03、1.00±0.02、1.00±0.05，差異均有統計學意義（t=21.360，P=0.000；t=18.980，P=0.000；t=5.680，P=0.005）。
2.2.3 BUN及ALB含量檢測
對照組上清液中BUN、ALB濃度分別為（0.43±0.07）mmol/L和（8.08±0.41）μg/mL，實驗組分別為（2.52±0.20） mmol/ L和（41.48±4.11）μg/mL，顯著高于對照組，比較差異均有統計學意義（t=24.160，P=0.000；t=19.810，P=0.000）。
2.2.4 糖原PAS染色觀察
對照組HUCMSCs細胞核呈深藍色，細胞質呈淡紫色；實驗組細胞整個胞體被染成深紫色，細胞核可見。見圖 4。
3 討論
肝硬化是在各種慢性損傷因素作用下逐漸進展的肝纖維化終末階段，是嚴重威脅人類身體健康的一種常見疾病，也是導致肝病患者死亡的常見原因。原位肝移植是傳統有效治療方案，但肝源緊張、免疫排斥等問題限制了其廣泛應用。生物人工肝及肝細胞移植具有良好應用前景，但二者仍需要大量肝細胞，同樣面臨來源短缺的問題[15-16]。隨著再生醫學蓬勃發展，干細胞療法在現代細胞治療中應用前景日益廣闊。MSCs作為干細胞的一種類型，具備很強的增殖能力和多向分化潛能，是繼胚胎干細胞、造血干細胞之后的又一研究熱點。目前已有大量臨床研究及動物實驗證實了HUCMSCs移植用于治療肝纖維化的有效性，并推測其作用機制可能與以下兩個方面有關：第一，HUCMSCs可分化為具有典型肝細胞功能的肝樣細胞，改善肝臟功能；第二，HUCM SCs可分泌多種細胞因子，通過旁分泌機制刺激宿主肝細胞再生[17]。目前已有動物實驗證實HUCMSCs在經靜脈移植后可遷移至受損肝組織并表達CK18、AFP等肝細胞特異性標志物[10-11]，然而尚無體外實驗證明干細胞在肝纖維化微環境下的分化能力。鑒于此，為進一步研究受損肝組織微環境對干細胞向肝細胞分化的誘導作用，我們提取肝纖維化條件下的組織勻漿上清模擬肝纖維化微環境，體外誘導HUCMSCs向肝細胞分化。
有研究報道，干細胞的增殖和分化除了受其內源性轉錄因子和基因的調控外，其所處局部微環境提供的外源性因素同樣至關重要。微環境通過提供必要的信號分子、細胞外基質、細胞間相互作用所需的化學物質等來維持干細胞增殖和分化之間的平衡[18-19]。不同組織細胞可提供不同的微環境，調控MSCs分化為不同細胞類型。目前已有大量研究通過在培養基中添加細胞因子、生長因子、激素等為其提供微環境，成功誘導MSCs向肝細胞分化，證實了體外獲取大量肝樣細胞的可行性，但以上體外誘導實驗所需時間較長，一般為3～4周，且花費較高[17, 20-21]。我們通過體外模擬肝纖維化組織微環境，結果表明HUCMSCs可在更短時間內分化為肝樣細胞，同時也為大量獲取肝樣細胞提供了一種更經濟的方法；而且相比于細胞因子、生長因子、激素等，我們用提取的肝纖維化組織勻漿上清模擬細胞外基質微環境，更接近于體內真實情況。我們在預實驗制備誘導培養基時，比較了不同纖維化肝組織勻漿濃度下的誘導效果，結果提示在50 g/L時誘導效果最好。對于肝樣細胞的鑒定，我們通過觀察誘導過程中HUCMSCs的形態學變化，發現肝樣細胞具備類似肝細胞的形態；通過采用Western blot檢測細胞蛋白，表明肝樣細胞可表達肝細胞標志物AFP、CK18及功能蛋白CYP3A4，提示肝樣細胞可能具備藥物代謝能力；通過PAS染色發現肝樣細胞較HUCMSCs儲存糖原的能力明顯增強。此外，由于肝細胞具備將氨轉化為BUN的能力，并可分泌ALB，故為進一步評價肝樣細胞的功能，我們采用以上兩種方法比較了肝樣細胞與HUCMSCs的差異，結果表明HUCMSCs具備合成少量BUN及ALB的能力，而肝樣細胞這兩方面的功能均較HUCMSCs顯著增強，與文獻報道一致[17, 20, 22]。
多項治療性研究表明，受試者（受試動物）在接受干細胞移植1～2周時即可見到癥狀改善，肝功能好轉[9, 23-24]；本實驗室前期研究亦表明在接受HUCMSCs尾靜脈移植48 h時，肝硬化大鼠肝臟組織中即可見到大量PKH26標記的HUCMSCs[10]。本實驗結果顯示，相比于目前體外研究采用的21 d甚至更長的誘導周期，肝勻漿上清液提供的微環境更有利于干細胞向肝細胞分化，HUCMSCs誘導7 d后形成的肝樣細胞可表達肝細胞標志物及代謝功能酶CYP3A4，并具備儲存糖原、合成BUN及分泌ALB的能力，可在體內通過細胞修復發揮替代治療作用，這可能是其體內移植改善肝功能的機制之一[25]。目前肝纖維化組織勻漿上清液的特定誘導活性成分尚不清楚，其誘導HUCMSCs分化的確切機制亦有待進一步闡明。
干細胞是一類未分化的細胞或原始細胞，具有很強的自我復制能力及向多種類型細胞分化的潛能[1]。近年來，隨著組織工程技術的進展，干細胞移植在治療肝臟疾病、心臟疾病、腎臟疾病、內分泌系統疾病等方面取得了喜人的成果[2-5]。其中，人臍帶間充質干細胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，HUCMSCs）由于來源廣泛、免疫原性低，且對其研究不涉及倫理道德和法律問題，逐漸成為干細胞的研究熱點。大量臨床試驗及動物研究證實干細胞移植可改善肝纖維化患者及動物的肝功能，促進病情好轉，然而確切的治療機制尚不明確[6-9]。多項研究表明，干細胞所處的組織微環境對其存活、增殖、分化等有非常重要的影響，干細胞移植后可歸巢至受損組織器官并向受損組織細胞分化，這可能是干細胞治療的機制之一[10-12]。本研究應用肝纖維化大鼠肝組織勻漿上清液體外模擬肝纖維化微環境對HUCMSCs進行誘導，通過觀察細胞形態學變化，檢測甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）、細胞角蛋白18（cytokeratin 18，CK18）等肝細胞特異性標志物和代謝功能酶CYP3A4的表達，以及儲存糖原、合成尿素（blood urea nitrogen，BUN）、分泌白蛋白（albumin，ALB）等肝細胞相關功能，評估HUCMSCs在特定條件下的分化潛能，旨在為干細胞移植治療肝纖維化提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
42日齡健康雄性清潔級SD大鼠24只，體重180～220 g，購自河北省實驗動物中心，實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學要求。
QSG7701人肝細胞株（上海拜力生物科技有限公司）；DMEM/F12培養基、FBS（HyClone公司，美國）；抗AFP、抗CK18、抗CYP3A4兔多克隆抗體（天津美諾路生物技術有限公司）；抗β-actin鼠單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG、辣根過氧化物酶標記山羊抗鼠IgG（Proteintech公司，美國）；BUN測試盒（南京建成生物工程研究所）；ALB ELISA試劑盒（蘇州卡爾文生物科技有限公司）；糖原過碘酸-雪夫（periodic acid-schiff，PAS）染色液（細胞真菌專用，北京雷根生物技術有限公司）；硫代乙酰胺（Sigma公司，美國）。Elipse-Tis倒置顯微鏡（Nikon公司，日本）；BX41顯微圖像微機處理系統（Olympus公司，日本）；3K15臺式冷凍離心機（Sigma公司，美國）。
1.2 HUCMSCs的獲取
本實驗所用HUCMSCs為解放軍白求恩國際和平醫院藥劑科藥理學實驗室原代培養后凍存，原代HUCM SCs的獲取及鑒定方法見文獻[13]。將凍存于液氮的原代HUCMSCs取出后迅速于37℃水浴中融化，以離心半徑7 cm、800 r/min離心5 min，棄凍存液，用含10%FBS的DMEM/F12培養基進行傳代培養，取第3代細胞備用。
1.3 大鼠肝纖維化誘導培養基的制備
24只大鼠適應性飼養1周后，采用隨機數字表法分為2組：對照組6只，正常飼養；造模組18只，參照文獻[14]方法建立大鼠肝纖維化模型，即給予3%硫代乙酰胺生理鹽水溶液腹腔注射，每周2次，每次200 mg/kg，共4周。
4周時將所有大鼠于2%戊巴比妥鈉腹腔注射（0.3 mL/100 g）麻醉后開腹，用4℃預冷的生理鹽水自肝門靜脈進行肝臟灌流20 min，取肝組織進行病理學鑒定（HE染色法），觀察并比較對照組與造模組肝組織的染色結果，并取造模組纖維化肝組織用于制備肝纖維化誘導培養基。誘導培養基制備：纖維化肝組織稱取濕重，按50 g/L加入含10%FBS的DMEM/F12培養基，冰浴條件下用勻漿器將肝組織勻漿，再于4℃、15 000×g離心30 min，取上清液，用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，-70℃冰箱保存備用。
1.4 HUCMSCs向肝細胞誘導分化
實驗分為2組，實驗組取第3代HUCMSCs，以1×105個/mL密度接種于6孔板中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養，待細胞長至80%匯合時，吸棄培養液，加入肝纖維化誘導培養基誘導培養7 d；對照組取第3代HUCMSCs，僅以含10%FBS的DMEM/F12培養基培養。
1.4.1 細胞形態學觀察
培養期間倒置顯微鏡觀察兩組HUCMSCs的形態學變化。
1.4.2 Western
blot檢測收集誘導7 d的實驗組及對照組細胞，采用細胞裂解法提取細胞總蛋白，用BCA法進行總蛋白定量。SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，采用濕式電轉印法將蛋白轉至聚偏氟乙烯膜，用含5%脫脂奶粉的Tween-PBS封閉2 h后，分別加入AFP（1∶500）、CK18（1∶500）、CYP3A4（1∶1 000）、 β-actin （1∶2 000） 一抗，4℃搖動過夜；洗膜后加入對應二抗（1∶2 000），孵育2 h后進行顯影、曝光，膠片掃描后應用Image J軟件進行灰度分析，實驗重復測量3次，取均值。設定QSG7701人肝細胞株為陽性對照。
1.4.3 BUN合成功能測定
誘導7 d后棄各組培養液，每孔加入含5 mmol/L NH4Cl的無血清DMEM/F12培養液1.5 mL，于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱繼續孵育24 h，取上清液，參照BUN測試盒說明書采用二乙酰肟比色法測定BUN含量。
1.4.4 ALB分泌功能測定
誘導7 d后棄各組培養液，每孔加入無血清DMEM/F12培養液1.5 mL，于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱繼續孵育96 h，取上清液，參照ALB ELISA試劑盒說明書采用ELISA法測定ALB含量。
1.4.5 糖原PAS染色觀察
誘導7 d后棄各組培養液，參照PAS染色液說明書對細胞進行PAS染色，應用BX41顯微圖像微機處理系統觀察。
1.5 統計學方法
采用SPSS13.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 肝纖維化大鼠肝組織病理學觀察
HE染色示，與對照組正常肝組織相比，4周時造模組大鼠肝組織可見部分肝細胞壞死，大量炎性細胞浸潤，肝小葉結構破壞，膠原纖維增生明顯，部分區域假小葉形成。見圖 1。
圖1
4周時對照組及造模組大鼠肝組織病理學觀察 ? 對照組（HE×100） ? 造模組（HE×100） ? 對照組（HE×400） ? 造模組（HE×400） ? ?2.2 HUCMSCs向肝細胞誘導分化
2.2.1 細胞形態學觀察
倒置顯微鏡觀察示，對照組為密集排列的長梭形成纖維樣細胞，細胞核可見。實驗組誘導后1 d，可見細胞兩極回縮，胞體變短；2 d時胞體進一步變短、變圓；7 d時細胞呈不規則形或類圓形，胞體豐滿。見圖 2。
2.2.2 Western
blot檢測 Western blot檢測示，對照組細胞未見AFP、CK18、CYP3A4表達；實驗組和陽性對照組細胞可表達肝細胞特異性標志物AFP、CK18，并可表達與代謝功能相關的重要蛋白CYP3A4。見圖 3。灰度分析結果示，實驗組AFP、CK18、CYP3A4相對表達量分別為0.61±0.01、0.69±0.02、0.79±0.04，均低于陽性對照組的1.00± 0.03、1.00±0.02、1.00±0.05，差異均有統計學意義（t=21.360，P=0.000；t=18.980，P=0.000；t=5.680，P=0.005）。
2.2.3 BUN及ALB含量檢測
對照組上清液中BUN、ALB濃度分別為（0.43±0.07）mmol/L和（8.08±0.41）μg/mL，實驗組分別為（2.52±0.20） mmol/ L和（41.48±4.11）μg/mL，顯著高于對照組，比較差異均有統計學意義（t=24.160，P=0.000；t=19.810，P=0.000）。
2.2.4 糖原PAS染色觀察
對照組HUCMSCs細胞核呈深藍色，細胞質呈淡紫色；實驗組細胞整個胞體被染成深紫色，細胞核可見。見圖 4。
3 討論
肝硬化是在各種慢性損傷因素作用下逐漸進展的肝纖維化終末階段，是嚴重威脅人類身體健康的一種常見疾病，也是導致肝病患者死亡的常見原因。原位肝移植是傳統有效治療方案，但肝源緊張、免疫排斥等問題限制了其廣泛應用。生物人工肝及肝細胞移植具有良好應用前景，但二者仍需要大量肝細胞，同樣面臨來源短缺的問題[15-16]。隨著再生醫學蓬勃發展，干細胞療法在現代細胞治療中應用前景日益廣闊。MSCs作為干細胞的一種類型，具備很強的增殖能力和多向分化潛能，是繼胚胎干細胞、造血干細胞之后的又一研究熱點。目前已有大量臨床研究及動物實驗證實了HUCMSCs移植用于治療肝纖維化的有效性，并推測其作用機制可能與以下兩個方面有關：第一，HUCMSCs可分化為具有典型肝細胞功能的肝樣細胞，改善肝臟功能；第二，HUCM SCs可分泌多種細胞因子，通過旁分泌機制刺激宿主肝細胞再生[17]。目前已有動物實驗證實HUCMSCs在經靜脈移植后可遷移至受損肝組織并表達CK18、AFP等肝細胞特異性標志物[10-11]，然而尚無體外實驗證明干細胞在肝纖維化微環境下的分化能力。鑒于此，為進一步研究受損肝組織微環境對干細胞向肝細胞分化的誘導作用，我們提取肝纖維化條件下的組織勻漿上清模擬肝纖維化微環境，體外誘導HUCMSCs向肝細胞分化。
有研究報道，干細胞的增殖和分化除了受其內源性轉錄因子和基因的調控外，其所處局部微環境提供的外源性因素同樣至關重要。微環境通過提供必要的信號分子、細胞外基質、細胞間相互作用所需的化學物質等來維持干細胞增殖和分化之間的平衡[18-19]。不同組織細胞可提供不同的微環境，調控MSCs分化為不同細胞類型。目前已有大量研究通過在培養基中添加細胞因子、生長因子、激素等為其提供微環境，成功誘導MSCs向肝細胞分化，證實了體外獲取大量肝樣細胞的可行性，但以上體外誘導實驗所需時間較長，一般為3～4周，且花費較高[17, 20-21]。我們通過體外模擬肝纖維化組織微環境，結果表明HUCMSCs可在更短時間內分化為肝樣細胞，同時也為大量獲取肝樣細胞提供了一種更經濟的方法；而且相比于細胞因子、生長因子、激素等，我們用提取的肝纖維化組織勻漿上清模擬細胞外基質微環境，更接近于體內真實情況。我們在預實驗制備誘導培養基時，比較了不同纖維化肝組織勻漿濃度下的誘導效果，結果提示在50 g/L時誘導效果最好。對于肝樣細胞的鑒定，我們通過觀察誘導過程中HUCMSCs的形態學變化，發現肝樣細胞具備類似肝細胞的形態；通過采用Western blot檢測細胞蛋白，表明肝樣細胞可表達肝細胞標志物AFP、CK18及功能蛋白CYP3A4，提示肝樣細胞可能具備藥物代謝能力；通過PAS染色發現肝樣細胞較HUCMSCs儲存糖原的能力明顯增強。此外，由于肝細胞具備將氨轉化為BUN的能力，并可分泌ALB，故為進一步評價肝樣細胞的功能，我們采用以上兩種方法比較了肝樣細胞與HUCMSCs的差異，結果表明HUCMSCs具備合成少量BUN及ALB的能力，而肝樣細胞這兩方面的功能均較HUCMSCs顯著增強，與文獻報道一致[17, 20, 22]。
多項治療性研究表明，受試者（受試動物）在接受干細胞移植1～2周時即可見到癥狀改善，肝功能好轉[9, 23-24]；本實驗室前期研究亦表明在接受HUCMSCs尾靜脈移植48 h時，肝硬化大鼠肝臟組織中即可見到大量PKH26標記的HUCMSCs[10]。本實驗結果顯示，相比于目前體外研究采用的21 d甚至更長的誘導周期，肝勻漿上清液提供的微環境更有利于干細胞向肝細胞分化，HUCMSCs誘導7 d后形成的肝樣細胞可表達肝細胞標志物及代謝功能酶CYP3A4，并具備儲存糖原、合成BUN及分泌ALB的能力，可在體內通過細胞修復發揮替代治療作用，這可能是其體內移植改善肝功能的機制之一[25]。目前肝纖維化組織勻漿上清液的特定誘導活性成分尚不清楚，其誘導HUCMSCs分化的確切機制亦有待進一步闡明。
