引用本文： 秦勝男, 王文, 傅世銓, 程玉姍, 陳鴻輝, 董飛, 陳啟明, 李愛國. 大鼠肌腱干細胞的分離培養鑒定及拉力對其Sox-9表達的影響. 中國修復重建外科雜志, 2015, 29(7): 884-888. doi: 10.7507/1002-1892.20150190 復制
拉力是影響肌腱組織的主要力學因素，其對肌腱組織的損傷和修復均具有很大影響。肌腱干細胞（tendon stem cells，TSCs）是一種來源于肌腱組織的MSCs，其具備多向分化能力。我們在前期動物研究中發現，肌肉收縮產生的拉力促進了骨-肌腱接點處細胞的纖維軟骨分化，進而促進了纖維軟骨帶的重建[1]。因此，拉力有可能促進骨-肌腱接點處的干細胞向纖維軟骨細胞分化。目前已知的骨-肌腱接點處具備分化能力的干細胞有BMSCs和TSCs。BMSCs被廣泛用作組織工程的種子細胞[2-3]，其優點在于容易取材和分離。但Tan等[4]發現與BMSCs相比，TSCs具有更好的克隆形成能力和增殖能力，軟骨相關基因和肌腱相關基因表達更高，具有更好的成骨、成脂和成軟骨能力。
Sox-9是軟骨細胞分化的重要因子[5-7]，是軟骨細胞分化的早期標記物，Sox-9表達升高會引起Ⅱ型膠原和糖胺多糖的表達。故本研究從大鼠髕腱中分離培養TSCs，鑒定其干細胞特性，同時觀察拉力對大鼠TSCs Sox-9基因和蛋白表達的影響，為進一步研究拉力促進TSCs的纖維軟骨分化奠定實驗基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
SPF級12周齡SD大鼠10只，雌雄不限，體重約250 g，購自廣東省實驗動物中心。
胰蛋白酶、低糖培養基、FBS、RNA提取試劑盒、一步法cDNA合成試劑盒、反轉錄試劑盒、SYBR （Life Technology公司，美國）；Ⅰ型膠原酶、結晶紫染料（Sigma公司，美國）；CD29、CD44、CD90、CD45抗體（BD公司，美國）；蛋白裂解液、ECL試劑盒（Thermo公司，美國）；BCA蛋白定量試劑盒（Pierce Biotechnology公司，美國）；聚偏氟乙烯膜（Millipore公司，美國）；Sox-9、β-actin（Santa Cruz公司，美國）；辣根過氧化酶標記山羊抗兔抗體（GE Healthcare公司，英國）。ST-140-10體外力學加載儀（B-Bridge公司，日本）；流式細胞儀（BD公司，美國）；倒置相差顯微鏡（Leica公司，德國）；正置顯微鏡（Olympus公司，日本）；核酸蛋白分析儀（Backman公司，美國）；熒光定量PCR儀（Applied Biosystem公司，美國）。
1.2 大鼠TSCs分離、培養及鑒定
1.2.1 大鼠TSCs分離、培養
按文獻[8]方法分離培養TSCs。取SD大鼠，腹腔注射0.06 g/L戊巴比妥鈉10 mL麻醉致死。取兩側髕腱，PBS沖洗3次，0.25%胰蛋白酶將整條肌腱預消化15 min；PBS沖洗1次，加入3 mg/mLⅠ型膠原酶；將肌腱盡量剪碎，按每100毫克肌腱加入3 mLⅠ型膠原酶比例消化2 h。消化結束后，用70 μm小濾器濾去未消化完的纖維，PBS反復沖洗，300×g離心5 min。用含10%FBS的低糖培養基重懸，以50個/cm2密度接種于6孔板，于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養；3 d后換液，以后每周換液2次；7 d后將細胞固定或用0.25%胰蛋白酶消化后傳代培養。倒置相差顯微鏡觀察細胞形態變化。
1.2.2 大鼠TSCs鑒定
① 細胞克隆形成能力檢測：將原代細胞以50個/cm2或500個/ cm2接種于6孔板中，于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養，7 d后行結晶紫染色，計算直徑＞1 mm的克隆數。正置顯微鏡觀察克隆形態。② 流式細胞術檢測干細胞表面標記：將5×105個第6代細胞于1 μg PE或FITC標記的CD29、CD44、CD90、CD45抗體中室溫孵育45 min，PBS洗1次，12 000×g離心5 min，重懸于300 μL預冷的PBS中，熒光激活分選分析。采用流式細胞儀程序計算陽性表達細胞百分率。以PE或FITC標記同型匹配的IgG1作為陰性對照。
1.3 拉力對大鼠TSCs Sox-9表達的影響
1.3.1 實驗分組及方法
按文獻[9]方法進行實驗，實驗分為2組。實驗組將4×104個第3代TSCs接種于體外力學加載儀專用硅膠膜（面積4 cm2）上，為促進細胞黏附，接種前1 d用4 mg/mLⅠ型膠原包被硅膠膜12 h。待細胞黏附24 h后，體外力學加載儀以4%、0.17 Hz的拉力加載于接種細胞，分別于加載4 h和24 h收集細胞進行基因或蛋白表達檢測。接種于硅膠膜但不加載拉力的TSCs作為對照組。
1.3.2 實時熒光定量PCR檢測
按文獻[9]方法檢測。收集兩組各時間點TSCs，用RNA提取試劑盒提取總RNA，核酸蛋白分析儀測定總RNA濃度。取300 ng RNA，一步法cDNA合成試劑盒將RNA反轉錄為cDNA。 cDNA合成條件：65℃、5 min，然后立即置于冰上；然后37℃、2 min，42℃、50 min，72℃、15 min。熒光定量PCR儀檢測Sox-9基因表達情況，反應體系20 μL：10 μmol/L正向引物0.5 μL，10 μmol/L反向引物0.5 μL，SYBR 10 μL，1∶20稀釋的cDNA 5 μL，雙蒸水4 μL。反應條件：95℃變性10 min；95℃、10 s，60℃、30 s，72℃、30 s，40個循環；最后以0.1℃/s加熱速率從60℃加至95℃。基因引物序列：Sox-9正向引物5'-AGAGCGTTGCTCGGAACTGT-3'，反向引物5'-TCCTGGACCGAAACTGGTAAA-3'，退火溫度60℃；β-actin正向引物5'-ATCGTGGGCCGCCCTAGGCA-3'，反向引物5'-TGGCCTTAGGGTTCAGAGGGG-3'，退火溫度52℃。采用2-ΔΔCt計算基因相對表達量，實驗重復3次，取均值。
1.3.3 Western
blot法檢測蛋白表達取兩組各時間點TSCs，加入蛋白裂解液后，以12 000×g離心10 min，取上清。BCA蛋白分析法測定蛋白濃度，蛋白變性后，取10 μg蛋白上樣跑膠，蛋白轉至0.22 μm聚偏氟乙烯膜；5%脫脂牛奶室溫封閉1 h；加入Sox-9或β-actin一抗（均為1∶200）孵育過夜；TBST洗3次，加入二抗（1∶3 000）室溫孵育1 h。TBST洗3次，ECL顯影測定免疫反應條帶。Image J軟件測定條帶灰度值，作為蛋白表達量。
1.4 統計學方法
采用SPSS16.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 大鼠TSCs分離培養及鑒定
2.1.1 大鼠TSCs形態學觀察
倒置相差顯微鏡觀察示，分離出的細胞第2天開始貼壁，5～7 d有克隆形成，原代細胞主要呈星狀，第1代細胞呈纖維細胞狀。見圖 1。
圖1
大鼠TSCs形態學觀察（倒置相差顯微鏡×100） ? 原代細胞 ? 第1代細胞 ? ?2.1.2 細胞克隆形成能力檢測
7 d后有1%～2%細胞長成單克隆，形成的細胞克隆呈相對致密或相對疏松的不同形態。見圖 2。
2.1.3 流式細胞術檢測干細胞表面標記
從大鼠髕腱分離出的細胞CD44、CD90、CD29表達陽性，CD45表達陰性，與MSCs表面標記因子表達相符。見圖 3。
2.2 拉力對大鼠TSCs Sox-9表達的影響
2.2.1 實時熒光定量PCR檢測
對照組及實驗組4、24 h Sox-9基因相對表達量分別為0.006 851±0.000 397及0.004 474±0.000 471、0.010 336±0.000 307。與對照組相比，實驗組拉力加載后4 h Sox-9基因水平下調，24 h Sox-9基因水平上調，差異均有統計學意義（t=6.683，P=0.003；t= -12.024，P=0.000）。
2.2.2 Western
blot法檢測蛋白表達對照組及實驗組4、24 h Sox-9蛋白表達量分別為14.19±0.99及5.81±0.21、18.01±0.94。與對照組相比，實驗組拉力加載后4 h Sox-9蛋白表達明顯降低，24 h Sox-9蛋白表達明顯增多，差異均有統計學意義（t=14.304，P=0.000；t= -4.839，P=0.008）。見圖 4。
圖4
Western blot法檢測大鼠TSCs Sox-9蛋白表達 1：對照組 2：實驗組4 h 3：實驗組24 h
Figure4.
Sox-9 protein expression of rat TSCs by Western blot 1: Control group 2: Experimental group at 4 hours after stretching 3: Experimental group at 24 hours after stretching
3 討論
TSCs是存在于肌腱組織中的一種MSCs，其成功分離為肌腱疾病或肌腱組織修復的細胞及分子生物學機制提供了新思路。本研究成功分離大鼠TSCs，該細胞具有干細胞特性，如多向分化能力、克隆形成能力以及部分干細胞表面標記物，如CD44陽性、CD45陰性，不同的是其CD90陽性，而BMSCs的CD90陰性，這與文獻報道一致[10]。
力學環境對肌腱組織有著至關重要的作用，合適的力學刺激對肌腱組織的新生、發展和修復均有重要作用[11-12]。Rui等[9]發現拉力可促進TSCs BMP-2的表達；Zhang等[13]則發現低強度拉力引起TSCs向肌腱細胞分化，而高強度拉力引起TSCs向軟骨或骨分化。我們前期研究中發現，肌肉收縮產生的拉力傳導至肌腱組織，進一步促進骨-肌腱接點纖維軟骨帶的損傷修復和愈合[1]。Sox-9作為軟骨細胞的核轉錄因子，是評價軟骨分化主要的早期指標[14-15]。因此，本研究觀察了拉力對TSCs Sox-9基因和蛋白表達的影響。結果顯示，與正常培養細胞相比，拉力加載后4 h Sox-9基因和蛋白表達均明顯減少，而24 h后Sox-9基因和蛋白表達則明顯增多。表明加載拉力后早期會抑制大鼠TSCs Sox-9的表達，拉力消失24 h后，Sox-9表達發生負反饋。
既往有報道低強度拉力會抑制干細胞的Sox-9基因表達，從而抑制干細胞向軟骨細胞方向分化[13]，這與本研究發現的加載拉力后早期會抑制Sox-9表達的結果相一致。雖然拉力抑制了Sox-9的表達，但并不是持續性的，說明拉力是一短期瞬時的作用；當拉力消失24 h后，基因和蛋白表達會逐漸恢復至正常水平。但我們發現拉力消失24 h后，Sox-9的基因和蛋白水平反而高于正常培養細胞，說明拉力促進了Sox-9基因和蛋白的表達。這有可能是因為拉力抑制了Sox-9基因和蛋白的表達，細胞為了彌補Sox-9 表達的降低，激活了其他細胞通路，分泌一些能夠促進Sox-9基因和蛋白表達的因子，從而在拉力消失后反而刺激了Sox-9的表達。至于是哪種通路激活并刺激了Sox-9的表達，將在后續實驗中進一步研究。本研究也存在局限性，例如未繼續觀察靜止培養更長時間（如48 h）后細胞的Sox-9水平是否恢復至正常表達水平，也會在后續實驗中研究。
拉力是影響肌腱組織的主要力學因素，其對肌腱組織的損傷和修復均具有很大影響。肌腱干細胞（tendon stem cells，TSCs）是一種來源于肌腱組織的MSCs，其具備多向分化能力。我們在前期動物研究中發現，肌肉收縮產生的拉力促進了骨-肌腱接點處細胞的纖維軟骨分化，進而促進了纖維軟骨帶的重建[1]。因此，拉力有可能促進骨-肌腱接點處的干細胞向纖維軟骨細胞分化。目前已知的骨-肌腱接點處具備分化能力的干細胞有BMSCs和TSCs。BMSCs被廣泛用作組織工程的種子細胞[2-3]，其優點在于容易取材和分離。但Tan等[4]發現與BMSCs相比，TSCs具有更好的克隆形成能力和增殖能力，軟骨相關基因和肌腱相關基因表達更高，具有更好的成骨、成脂和成軟骨能力。
Sox-9是軟骨細胞分化的重要因子[5-7]，是軟骨細胞分化的早期標記物，Sox-9表達升高會引起Ⅱ型膠原和糖胺多糖的表達。故本研究從大鼠髕腱中分離培養TSCs，鑒定其干細胞特性，同時觀察拉力對大鼠TSCs Sox-9基因和蛋白表達的影響，為進一步研究拉力促進TSCs的纖維軟骨分化奠定實驗基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
SPF級12周齡SD大鼠10只，雌雄不限，體重約250 g，購自廣東省實驗動物中心。
胰蛋白酶、低糖培養基、FBS、RNA提取試劑盒、一步法cDNA合成試劑盒、反轉錄試劑盒、SYBR （Life Technology公司，美國）；Ⅰ型膠原酶、結晶紫染料（Sigma公司，美國）；CD29、CD44、CD90、CD45抗體（BD公司，美國）；蛋白裂解液、ECL試劑盒（Thermo公司，美國）；BCA蛋白定量試劑盒（Pierce Biotechnology公司，美國）；聚偏氟乙烯膜（Millipore公司，美國）；Sox-9、β-actin（Santa Cruz公司，美國）；辣根過氧化酶標記山羊抗兔抗體（GE Healthcare公司，英國）。ST-140-10體外力學加載儀（B-Bridge公司，日本）；流式細胞儀（BD公司，美國）；倒置相差顯微鏡（Leica公司，德國）；正置顯微鏡（Olympus公司，日本）；核酸蛋白分析儀（Backman公司，美國）；熒光定量PCR儀（Applied Biosystem公司，美國）。
1.2 大鼠TSCs分離、培養及鑒定
1.2.1 大鼠TSCs分離、培養
按文獻[8]方法分離培養TSCs。取SD大鼠，腹腔注射0.06 g/L戊巴比妥鈉10 mL麻醉致死。取兩側髕腱，PBS沖洗3次，0.25%胰蛋白酶將整條肌腱預消化15 min；PBS沖洗1次，加入3 mg/mLⅠ型膠原酶；將肌腱盡量剪碎，按每100毫克肌腱加入3 mLⅠ型膠原酶比例消化2 h。消化結束后，用70 μm小濾器濾去未消化完的纖維，PBS反復沖洗，300×g離心5 min。用含10%FBS的低糖培養基重懸，以50個/cm2密度接種于6孔板，于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養；3 d后換液，以后每周換液2次；7 d后將細胞固定或用0.25%胰蛋白酶消化后傳代培養。倒置相差顯微鏡觀察細胞形態變化。
1.2.2 大鼠TSCs鑒定
① 細胞克隆形成能力檢測：將原代細胞以50個/cm2或500個/ cm2接種于6孔板中，于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養，7 d后行結晶紫染色，計算直徑＞1 mm的克隆數。正置顯微鏡觀察克隆形態。② 流式細胞術檢測干細胞表面標記：將5×105個第6代細胞于1 μg PE或FITC標記的CD29、CD44、CD90、CD45抗體中室溫孵育45 min，PBS洗1次，12 000×g離心5 min，重懸于300 μL預冷的PBS中，熒光激活分選分析。采用流式細胞儀程序計算陽性表達細胞百分率。以PE或FITC標記同型匹配的IgG1作為陰性對照。
1.3 拉力對大鼠TSCs Sox-9表達的影響
1.3.1 實驗分組及方法
按文獻[9]方法進行實驗，實驗分為2組。實驗組將4×104個第3代TSCs接種于體外力學加載儀專用硅膠膜（面積4 cm2）上，為促進細胞黏附，接種前1 d用4 mg/mLⅠ型膠原包被硅膠膜12 h。待細胞黏附24 h后，體外力學加載儀以4%、0.17 Hz的拉力加載于接種細胞，分別于加載4 h和24 h收集細胞進行基因或蛋白表達檢測。接種于硅膠膜但不加載拉力的TSCs作為對照組。
1.3.2 實時熒光定量PCR檢測
按文獻[9]方法檢測。收集兩組各時間點TSCs，用RNA提取試劑盒提取總RNA，核酸蛋白分析儀測定總RNA濃度。取300 ng RNA，一步法cDNA合成試劑盒將RNA反轉錄為cDNA。 cDNA合成條件：65℃、5 min，然后立即置于冰上；然后37℃、2 min，42℃、50 min，72℃、15 min。熒光定量PCR儀檢測Sox-9基因表達情況，反應體系20 μL：10 μmol/L正向引物0.5 μL，10 μmol/L反向引物0.5 μL，SYBR 10 μL，1∶20稀釋的cDNA 5 μL，雙蒸水4 μL。反應條件：95℃變性10 min；95℃、10 s，60℃、30 s，72℃、30 s，40個循環；最后以0.1℃/s加熱速率從60℃加至95℃。基因引物序列：Sox-9正向引物5'-AGAGCGTTGCTCGGAACTGT-3'，反向引物5'-TCCTGGACCGAAACTGGTAAA-3'，退火溫度60℃；β-actin正向引物5'-ATCGTGGGCCGCCCTAGGCA-3'，反向引物5'-TGGCCTTAGGGTTCAGAGGGG-3'，退火溫度52℃。采用2-ΔΔCt計算基因相對表達量，實驗重復3次，取均值。
1.3.3 Western
blot法檢測蛋白表達取兩組各時間點TSCs，加入蛋白裂解液后，以12 000×g離心10 min，取上清。BCA蛋白分析法測定蛋白濃度，蛋白變性后，取10 μg蛋白上樣跑膠，蛋白轉至0.22 μm聚偏氟乙烯膜；5%脫脂牛奶室溫封閉1 h；加入Sox-9或β-actin一抗（均為1∶200）孵育過夜；TBST洗3次，加入二抗（1∶3 000）室溫孵育1 h。TBST洗3次，ECL顯影測定免疫反應條帶。Image J軟件測定條帶灰度值，作為蛋白表達量。
1.4 統計學方法
采用SPSS16.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 大鼠TSCs分離培養及鑒定
2.1.1 大鼠TSCs形態學觀察
倒置相差顯微鏡觀察示，分離出的細胞第2天開始貼壁，5～7 d有克隆形成，原代細胞主要呈星狀，第1代細胞呈纖維細胞狀。見圖 1。
圖1
大鼠TSCs形態學觀察（倒置相差顯微鏡×100） ? 原代細胞 ? 第1代細胞 ? ?2.1.2 細胞克隆形成能力檢測
7 d后有1%～2%細胞長成單克隆，形成的細胞克隆呈相對致密或相對疏松的不同形態。見圖 2。
2.1.3 流式細胞術檢測干細胞表面標記
從大鼠髕腱分離出的細胞CD44、CD90、CD29表達陽性，CD45表達陰性，與MSCs表面標記因子表達相符。見圖 3。
2.2 拉力對大鼠TSCs Sox-9表達的影響
2.2.1 實時熒光定量PCR檢測
對照組及實驗組4、24 h Sox-9基因相對表達量分別為0.006 851±0.000 397及0.004 474±0.000 471、0.010 336±0.000 307。與對照組相比，實驗組拉力加載后4 h Sox-9基因水平下調，24 h Sox-9基因水平上調，差異均有統計學意義（t=6.683，P=0.003；t= -12.024，P=0.000）。
2.2.2 Western
blot法檢測蛋白表達對照組及實驗組4、24 h Sox-9蛋白表達量分別為14.19±0.99及5.81±0.21、18.01±0.94。與對照組相比，實驗組拉力加載后4 h Sox-9蛋白表達明顯降低，24 h Sox-9蛋白表達明顯增多，差異均有統計學意義（t=14.304，P=0.000；t= -4.839，P=0.008）。見圖 4。
圖4
Western blot法檢測大鼠TSCs Sox-9蛋白表達 1：對照組 2：實驗組4 h 3：實驗組24 h
Figure4.
Sox-9 protein expression of rat TSCs by Western blot 1: Control group 2: Experimental group at 4 hours after stretching 3: Experimental group at 24 hours after stretching
3 討論
TSCs是存在于肌腱組織中的一種MSCs，其成功分離為肌腱疾病或肌腱組織修復的細胞及分子生物學機制提供了新思路。本研究成功分離大鼠TSCs，該細胞具有干細胞特性，如多向分化能力、克隆形成能力以及部分干細胞表面標記物，如CD44陽性、CD45陰性，不同的是其CD90陽性，而BMSCs的CD90陰性，這與文獻報道一致[10]。
力學環境對肌腱組織有著至關重要的作用，合適的力學刺激對肌腱組織的新生、發展和修復均有重要作用[11-12]。Rui等[9]發現拉力可促進TSCs BMP-2的表達；Zhang等[13]則發現低強度拉力引起TSCs向肌腱細胞分化，而高強度拉力引起TSCs向軟骨或骨分化。我們前期研究中發現，肌肉收縮產生的拉力傳導至肌腱組織，進一步促進骨-肌腱接點纖維軟骨帶的損傷修復和愈合[1]。Sox-9作為軟骨細胞的核轉錄因子，是評價軟骨分化主要的早期指標[14-15]。因此，本研究觀察了拉力對TSCs Sox-9基因和蛋白表達的影響。結果顯示，與正常培養細胞相比，拉力加載后4 h Sox-9基因和蛋白表達均明顯減少，而24 h后Sox-9基因和蛋白表達則明顯增多。表明加載拉力后早期會抑制大鼠TSCs Sox-9的表達，拉力消失24 h后，Sox-9表達發生負反饋。
既往有報道低強度拉力會抑制干細胞的Sox-9基因表達，從而抑制干細胞向軟骨細胞方向分化[13]，這與本研究發現的加載拉力后早期會抑制Sox-9表達的結果相一致。雖然拉力抑制了Sox-9的表達，但并不是持續性的，說明拉力是一短期瞬時的作用；當拉力消失24 h后，基因和蛋白表達會逐漸恢復至正常水平。但我們發現拉力消失24 h后，Sox-9的基因和蛋白水平反而高于正常培養細胞，說明拉力促進了Sox-9基因和蛋白的表達。這有可能是因為拉力抑制了Sox-9基因和蛋白的表達，細胞為了彌補Sox-9 表達的降低，激活了其他細胞通路，分泌一些能夠促進Sox-9基因和蛋白表達的因子，從而在拉力消失后反而刺激了Sox-9的表達。至于是哪種通路激活并刺激了Sox-9的表達，將在后續實驗中進一步研究。本研究也存在局限性，例如未繼續觀察靜止培養更長時間（如48 h）后細胞的Sox-9水平是否恢復至正常表達水平，也會在后續實驗中研究。
