引用本文： 施劍明, 殷明. 人BMSCs成神經分化過程中Wnt/β-catenin信號通路調控作用研究. 中國修復重建外科雜志, 2023, 37(10): 1276-1283. doi: 10.7507/1002-1892.202306017 復制
目前，神經細胞移植是中樞神經系統疾病或神經損傷最佳治療方法，但種子細胞來源問題尚未解決。胚胎干細胞和神經干細胞可分化為成熟神經細胞[1-2]，但因涉及倫理、免疫和分離提取等問題，應用受到一定限制。在特定實驗條件下，BMSCs能夠克服生殖胚層障礙，從內胚層分化為肝細胞[3]和從外胚層分化為神經細胞[4-5]，在組織工程和基因治療方面具有廣闊應用前景。
研究表明，bFGF和EGF均能誘導BMSCs分化為神經細胞[6-8]，但兩者是否具有協同作用及具體作用機制尚未明確。研究發現Wnt/β-catenin信號通路在維持中樞神經系統功能及胚胎干細胞、神經干細胞的成神經分化中發揮重要作用[9-10]，但是否參與人BMSCs（human BMSCs，hBMSCs）成神經分化尚不清楚。為此，本研究擬探討bFGF和/或EGF誘導hBMSCs成神經分化的效果，并在此基礎上明確Wnt/β-catenin信號通路在分化過程中的作用，以期為臨床應用hBMSCs修復神經缺損提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
第2代hBMSCs（江陰齊氏生物科技有限公司）。α-MEM培養基、FBS（GIBCO公司，美國）；Dickkopf相關蛋白1（Dickkopf-related protein 1，DKK-1；Wnt/β-catenin 通路抑制劑）、bFGF、EGF（Peprotech公司，美國）；GREENspin細胞RNA快速提取試劑盒（北京莊盟國際生物基因科技有限公司）；HiFi-MMLV cDNA 逆轉錄試劑盒、高靈敏度化學發光檢測試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司）；總蛋白提取試劑盒（北京普利萊生物有限公司）；NE-PER核蛋白-胞漿蛋白抽提試劑盒、BCA蛋白定量分析試劑盒（Thermo Scientific公司，美國）；DyLight 488-SABC免疫組織化學染色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；兔抗神經元特異性烯醇化酶 （neuron-specific enolase，NSE）、膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）、β-catenin一抗（Proteintech公司，美國）；鼠抗β肌動蛋白（β-actin）一抗、辣根過氧化物酶標記山羊抗鼠二抗、DAPI（Sigma-Aldrich公司，美國）；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗（Jackson公司，美國）；兔抗磷酸化β-catenin（phosphorylation β-catenin，P-β-catenin；Ser33/37/Thr41）、β-微管蛋白（β-tubulin）一抗（CST公司，美國）。引物合成由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。
TS100-F倒置熒光相差顯微鏡（Nikon公司，日本）；BIO-BEST200E凝膠成像系統、恒溫細胞培養箱（SIM公司，美國）；PCR基因擴增儀（西安天隆科技有限公司）。
1.2 實驗分組及方法
將第2代hBMSCs復蘇后進行傳代培養，取第4代經鑒定的hBMSCs[11]接種于6孔板，每孔1×104個細胞。根據不同誘導條件分為對照組（A組）、EGF誘導組（B組）、bFGF誘導組（C組）、EGF+bFGF誘導組（D組）以及EGF+bFGF+DKK-1誘導組（E組）。其中，A組采用正常誘導培養基（含1% FBS的α-MEM培養基）；B～E組在正常誘導培養基中分別加入20 ng/mL EGF、20 ng/mL bFGF、20 ng/mL EGF+20 ng/mL bFGF，以及20 ng/mL EGF+20 ng/mL bFGF+100 ng/mLDKK-1。置于37℃、5%CO2細胞培養箱中貼壁培養，每2天換液1次，誘導培養7 d后取各組細胞行以下觀測。
1.3 觀測指標
1.3.1 細胞形態觀察
倒置熒光相差顯微鏡下觀察各組細胞形態變化。
1.3.2 RT-PCR檢測
采用RT-PCR檢測神經干細胞標志巢蛋白（Nestin）、神經細胞標志NSE和微管相關蛋白 2 （microtubule-associated protein 2，MAP-2）、神經膠質細胞標志GFAP，以及Wnt/β-catenin信號通路關鍵組件β-catenin和Cyclin D1基因表達變化。取各組細胞采用GREENspin細胞RNA快速提取試劑盒提取總RNA，并通過HiFi-MMLV cDNA 逆轉錄試劑盒、高靈敏度化學發光檢測試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA，進行PCR擴增反應。反應條件：94℃預變性1.5 min；94℃變性30 s，55～60℃退火30 s，72℃延伸1 min（重復28～36個循壞）；72℃延伸5 min。擴增后產物經1.0%瓊脂糖凝膠100 V恒壓電泳20～40 min，置于凝膠成像系統拍照，Image-Pro Plus 6.0軟件進行灰度值分析，以目的基因與內參基因（β-actin）的灰度比值作為目的基因相對表達量。引物序列、產物大小及反應條件見表1。實驗重復3次。
表1
RT-PCR引物序列和反應條件
Table1.
Primer sequence and reaction conditions of RT-PCR
1.3.3 細胞免疫熒光染色觀察
采用細胞免疫熒光染色觀察神經細胞標志蛋白（NSE、GFAP）表達變化。將各組細胞依次以4%多聚甲醛溶液固定30 min、0.3% TritonX-100通透細胞膜10 min、PBS洗滌3次后，10%正常山羊血清室溫封閉20 min；添加兔抗NSE、GFAP一抗（均以1∶50稀釋）于4℃孵育過夜，然后更換生物素標記山羊抗兔IgG二抗（1∶100稀釋）室溫孵育2 h，DyLight 488-SABC以緩沖液1∶200稀釋室溫孵育30 min后，加入DAPI染細胞核。倒置熒光相差顯微鏡下觀察，并隨機選擇10個非重疊視野，分別計算NSE、GFAP表達陽性細胞比例（陽性率）。實驗重復3次。
1.3.4 Western blot檢測
采用Western blot檢測神經細胞（NSE、GFAP）及Wnt/β-catenin信號通路關鍵組件 ［β-catenin、P-β-catenin、細胞胞質β-catenin（Cytoplasmic β-catenin）及細胞核內β-catenin（Nuclear β-catenin）］ 蛋白水平表達變化。采用總蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白、采用NE-PER核蛋白-胞漿蛋白抽提試劑盒提取細胞質蛋白及核蛋白，并通過BCA蛋白定量分析試劑盒測定蛋白濃度，每孔蛋白上樣30 μg后進行SDS-PAGE凝膠電泳。5%脫脂牛奶封閉2 h后一抗（稀釋比例：兔抗NSE 1∶500、兔抗GFAP 1∶100、兔抗β-catenin 1∶2 000、兔抗P-β-catenin 1∶500、小鼠抗β-actin 1∶5 000、兔抗β-tubulin 1∶500）4℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標記二抗工作液（山羊抗兔1∶10 000、山羊抗小鼠1∶5 000）室溫孵育2 h后曝光，采用Image-Pro Plus 6.0軟件進行灰度分析，以目的蛋白和對應內參蛋白灰度值比值作為目的蛋白相對表達量。同時計算β-catenin核質比（Nuclear β-catenin/Cytoplasmic β-catenin）。實驗重復3次。
1.4 統計學方法
采用SPSS26.0統計軟件進行分析。計量資料經正態性檢驗，均符合正態分布，以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 細胞形態觀察
誘導培養7 d后A、B組細胞仍為長梭形，呈漩渦狀排列；C～E組部分細胞胞體變小、呈雙極和復雜多極，折光性增強，逐漸向四周伸出突起且與相鄰細胞突觸連接，提示hBMSCs分化成典型神經樣細胞形態；D組細胞上述變化較C、E組更明顯。見圖1。
圖1
誘導培養7 d倒置熒光相差顯微鏡觀察
a～e. A～E組細胞形態（×200）；f. D組細胞間可見突觸連接（箭頭）（×400）
Figure1. Cell morphology observation by inverted fluorescence phase contrast microscopy after 7 days of induced culturea-e. Cell morphology of groups A-E, respectively (×200); f. Synaptic connections (arrow) were clearly visible between neural-like cells in group D (×400)
2.2 RT-PCR檢測
2.2.1 神經細胞相關基因
與A組比較，C～E組Nestin、NSE、MAP-2，D、E組GFAP及B組NSE基因相對表達量升高，差異有統計學意義（P<0.05）。與C組比較，D組NSE、MAP-2、GFAP基因相對表達量升高，Nestin基因相對表達量下降；與E組比較，D組Nestin、NSE、MAP-2、GFAP基因相對表達量均升高；差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖2a～d。
圖2
RT-PCR檢測各組神經細胞以及Wnt/β-catenin信號通路相關基因表達
a. Nestin；b. NSE；c. MAP-2；d. GFAP；e. β-catenin；f. Cyclin D1
Figure2. Expressions of genes related to neural cells and Wnt/β-catenin signaling pathway in each group by RT-PCRa. Nestin; b. NSE; c. MAP-2; d. GFAP; e. β-catenin; f. Cyclin D1
2.2.2 Wnt/β-catenin信號通路相關基因
與A組比較，C、D組β-catenin以及B~D組Cyclin D1基因相對表達量升高，差異有統計學意義（P<0.05）。與E組比較，D組β-catenin、Cyclin D1基因相對表達量升高，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖2e、f。
2.3 細胞免疫熒光染色觀察
倒置熒光相差顯微鏡觀察示，C～E組均有部分細胞發出綠色熒光信號。與A組比較，C～E組NSE、GFAP陽性率均升高，差異有統計學意義（P<0.05）；D組兩指標均高于C、E組，差異亦有統計學意義（P<0.05）。見圖3。
圖3
各組細胞免疫熒光染色觀察
a. NSE免疫熒光染色（倒置熒光相差顯微鏡×200） 從左至右分別為A～E組，從上至下分別為NSE染色、DAPI染色以及兩者重疊；b. NSE陽性率；c. GFAP免疫熒光染色（倒置熒光相差顯微鏡×200） 從左至右分別為A～E組，從上至下分別為GFAP染色、DAPI染色以及兩者重疊；d. GFAP陽性率
Figure3. Observation of cellular immunofluorescence staining for each groupa. NSE immunofluorescence staining (Inverted fluorescence phase contrast microscopy×200) From left to right for groups A-E, respectively; from top to bottom for NSE staining, DAPI staining, and merge of NSE and DAPI staining, respectively; b. Ratio of NSE-positive cells; c. GFAP immunofluorescence staining (Inverted fluorescence phase contrast microscopy×200) From left to right for groups A-E, respectively; from top to bottom for GFAP staining, DAPI staining, and merge of GFAP and DAPI staining, respectively; d. Ratio of GFAP-positive cells
2.4 Western blot檢測
2.4.1 神經細胞標志蛋白
與A組比較，C、D組NSE蛋白及C～E組GFAP蛋白相對表達量升高，差異有統計學意義（P<0.05）。與C組比較，D組NSE蛋白相對表達量升高；與E組比較，D組NSE、GFAP蛋白相對表達量均升高；差異有統計學意義（P<0.05）。見圖4a、b。
圖4
Western blot檢測各組神經細胞標志蛋白以及Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白表達
1～5：A～E組 a、b. 神經細胞標志蛋白電泳圖及相對表達量；c、d. Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白電泳圖及相對表達量
Figure4. Expressions of proteins related to neural cells and Wnt/β-catenin signaling pathway detected by Western blot1-5: Groups A-E a, b. Electropherogram and relative expressions for proteins related to neural cells; c, d. Electropherogram and relative expressions for proteins related to Wnt/β-catenin signaling pathway
2.4.2 Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白
與A組比較，C、D組β-catenin、Cytoplasmic β-catenin、Nuclear β-catenin蛋白相對表達量以及β-catenin核質比均升高，P-β-catenin蛋白相對表達量下降，差異均有統計學意義（P<0.05）。與E組比較，D組β-catenin、Cytoplasmic β-catenin、Nuclear β-catenin蛋白相對表達量以及β-catenin核質比均升高，P-β-catenin蛋白相對表達量下降，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖4c、d。
3 討論
創傷性神經損傷、中風和許多神經系統疾病多伴隨神經細胞丟失或功能喪失。雖然研究已證實神經干細胞的存在，但由于其遷移性差及自我更新和分化能力低，使得受損神經組織自我恢復能力非常有限。因此，干細胞療法被認為是治療神經退行性疾病和神經損傷的有效方法[12]。研究表明，BMSCs可以在體內外分化為神經樣細胞，因此BMSCs成神經分化條件及其機制研究備受關注。
作為重要的有絲分裂和神經營養因子，bFGF和EGF在促進神經干細胞自我更新、調控神經干細胞分化和多能干細胞神經樣細胞分化中起重要作用[13-14]。因此，眾多學者利用bFGF和/或EGF刺激多能干細胞向神經樣細胞分化[8, 13, 15]。本研究發現與A組比較，C、D組神經細胞標志基因均升高（C組GFAP除外），B組則無明顯變化（除NSE輕度升高外）；與C組比較，D組神經干細胞標志基因Nestin表達下調，神經細胞標志基因NSE、MAP-2和神經膠質細胞標志基因GFAP表達上調。提示bFGF可單獨誘導hBMSCs成神經細胞分化，而EGF無此作用，但EGF可增強bFGF誘導hBMSCs成神經細胞分化表型。這可能是因為bFGF促進神經干細胞自我更新[16]和分化[17]，主要用于誘導多能干細胞向神經細胞分化。而EGF主要用于促進神經前體細胞分化及軸突生長[18]，且這一過程中EGF通過與神經前體細胞中的EGF響應元件EGFR結合而發揮作用。有研究發現， BMSCs被誘導成神經細胞分化后EGFR表達水平顯著增加，且bFGF的存在也可促進EGF與EGFR的結合[19]。這一定程度上解釋了我們研究發現EGF不具備單獨誘導hBMSCs向神經細胞分化，但可協同增強bFGF誘導hBMSCs向神經細胞分化。雖然如此，bFGF單獨或聯合EGF誘導hBMSCs向神經細胞分化的具體作用機制仍有待進一步研究。
研究表明，Wnt/β-catenin信號通路在BMSCs增殖、衰老及分化中發揮著重要作用[20-21]。此外，該通路還參與調控神經發育多個方面，如神經導管形成、神經干細胞增殖及分化、軸突及樹突的發生和突觸間連接的建立[22-23]。β-catenin在Wnt/β-catenin信號通路中起著至關重要作用。在缺乏Wnt信號情況下，游離細胞質β-catenin被磷酸化，然后被泛素-蛋白酶體系統降解。在Wnt信號存在情況下，未磷酸化的β-catenin在細胞質中積累并易位到細胞核中，促進多種靶基因（如C-myc和Cyclin D1）的轉錄[24]。為了明確Wnt/β-catenin信號通路與hBMSCs成神經分化之間的關系，我們通過RT-PCR和Western blot檢測了β-catenin 基因和蛋白的表達。結果表明，與A組比較，C、D組細胞質和細胞核中β-catenin的表達均增加，且細胞核與細胞質表達比值升高，支持了Wnt/β-catenin信號通路激活介導bFGF單獨或聯合EGF誘導hBMSCs向神經細胞分化的假設。與A組比較，D、E組神經標志基因及蛋白表達均升高，且D組高于E組，提示對Wnt/β-catenin信號通路通過特異性阻滯劑DKK-1進行阻滯后，bFGF聯合EGF誘導hBMSCs成神經分化作用削弱但不完全抑制，提示除Wnt/β-catenin信號通路外，可能存在其他信號通路參與bFGF單獨或聯合EGF誘導hBMSCs成神經分化，這有待進一步研究。
綜上述，bFGF可誘導hBMSCs向神經細胞分化，EGF則不能，但EGF能夠增強bFGF誘導作用；Wnt/β-catenin信號通路在這一過程發揮正向調控作用。本研究結果為hBMSCs運用于臨床神經退行性疾病治療和神經損傷修復提供了新靶點。
利益沖突 在課題研究及文章撰寫過程中不存在利益沖突
作者貢獻聲明 施劍明：研究設計及實驗，數據收集及統計分析，論文撰寫；殷明：研究設計并對文章的知識性內容進行批評性審閱
目前，神經細胞移植是中樞神經系統疾病或神經損傷最佳治療方法，但種子細胞來源問題尚未解決。胚胎干細胞和神經干細胞可分化為成熟神經細胞[1-2]，但因涉及倫理、免疫和分離提取等問題，應用受到一定限制。在特定實驗條件下，BMSCs能夠克服生殖胚層障礙，從內胚層分化為肝細胞[3]和從外胚層分化為神經細胞[4-5]，在組織工程和基因治療方面具有廣闊應用前景。
研究表明，bFGF和EGF均能誘導BMSCs分化為神經細胞[6-8]，但兩者是否具有協同作用及具體作用機制尚未明確。研究發現Wnt/β-catenin信號通路在維持中樞神經系統功能及胚胎干細胞、神經干細胞的成神經分化中發揮重要作用[9-10]，但是否參與人BMSCs（human BMSCs，hBMSCs）成神經分化尚不清楚。為此，本研究擬探討bFGF和/或EGF誘導hBMSCs成神經分化的效果，并在此基礎上明確Wnt/β-catenin信號通路在分化過程中的作用，以期為臨床應用hBMSCs修復神經缺損提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
第2代hBMSCs（江陰齊氏生物科技有限公司）。α-MEM培養基、FBS（GIBCO公司，美國）；Dickkopf相關蛋白1（Dickkopf-related protein 1，DKK-1；Wnt/β-catenin 通路抑制劑）、bFGF、EGF（Peprotech公司，美國）；GREENspin細胞RNA快速提取試劑盒（北京莊盟國際生物基因科技有限公司）；HiFi-MMLV cDNA 逆轉錄試劑盒、高靈敏度化學發光檢測試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司）；總蛋白提取試劑盒（北京普利萊生物有限公司）；NE-PER核蛋白-胞漿蛋白抽提試劑盒、BCA蛋白定量分析試劑盒（Thermo Scientific公司，美國）；DyLight 488-SABC免疫組織化學染色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；兔抗神經元特異性烯醇化酶 （neuron-specific enolase，NSE）、膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）、β-catenin一抗（Proteintech公司，美國）；鼠抗β肌動蛋白（β-actin）一抗、辣根過氧化物酶標記山羊抗鼠二抗、DAPI（Sigma-Aldrich公司，美國）；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗（Jackson公司，美國）；兔抗磷酸化β-catenin（phosphorylation β-catenin，P-β-catenin；Ser33/37/Thr41）、β-微管蛋白（β-tubulin）一抗（CST公司，美國）。引物合成由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。
TS100-F倒置熒光相差顯微鏡（Nikon公司，日本）；BIO-BEST200E凝膠成像系統、恒溫細胞培養箱（SIM公司，美國）；PCR基因擴增儀（西安天隆科技有限公司）。
1.2 實驗分組及方法
將第2代hBMSCs復蘇后進行傳代培養，取第4代經鑒定的hBMSCs[11]接種于6孔板，每孔1×104個細胞。根據不同誘導條件分為對照組（A組）、EGF誘導組（B組）、bFGF誘導組（C組）、EGF+bFGF誘導組（D組）以及EGF+bFGF+DKK-1誘導組（E組）。其中，A組采用正常誘導培養基（含1% FBS的α-MEM培養基）；B～E組在正常誘導培養基中分別加入20 ng/mL EGF、20 ng/mL bFGF、20 ng/mL EGF+20 ng/mL bFGF，以及20 ng/mL EGF+20 ng/mL bFGF+100 ng/mLDKK-1。置于37℃、5%CO2細胞培養箱中貼壁培養，每2天換液1次，誘導培養7 d后取各組細胞行以下觀測。
1.3 觀測指標
1.3.1 細胞形態觀察
倒置熒光相差顯微鏡下觀察各組細胞形態變化。
1.3.2 RT-PCR檢測
采用RT-PCR檢測神經干細胞標志巢蛋白（Nestin）、神經細胞標志NSE和微管相關蛋白 2 （microtubule-associated protein 2，MAP-2）、神經膠質細胞標志GFAP，以及Wnt/β-catenin信號通路關鍵組件β-catenin和Cyclin D1基因表達變化。取各組細胞采用GREENspin細胞RNA快速提取試劑盒提取總RNA，并通過HiFi-MMLV cDNA 逆轉錄試劑盒、高靈敏度化學發光檢測試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA，進行PCR擴增反應。反應條件：94℃預變性1.5 min；94℃變性30 s，55～60℃退火30 s，72℃延伸1 min（重復28～36個循壞）；72℃延伸5 min。擴增后產物經1.0%瓊脂糖凝膠100 V恒壓電泳20～40 min，置于凝膠成像系統拍照，Image-Pro Plus 6.0軟件進行灰度值分析，以目的基因與內參基因（β-actin）的灰度比值作為目的基因相對表達量。引物序列、產物大小及反應條件見表1。實驗重復3次。
表1
RT-PCR引物序列和反應條件
Table1.
Primer sequence and reaction conditions of RT-PCR
1.3.3 細胞免疫熒光染色觀察
采用細胞免疫熒光染色觀察神經細胞標志蛋白（NSE、GFAP）表達變化。將各組細胞依次以4%多聚甲醛溶液固定30 min、0.3% TritonX-100通透細胞膜10 min、PBS洗滌3次后，10%正常山羊血清室溫封閉20 min；添加兔抗NSE、GFAP一抗（均以1∶50稀釋）于4℃孵育過夜，然后更換生物素標記山羊抗兔IgG二抗（1∶100稀釋）室溫孵育2 h，DyLight 488-SABC以緩沖液1∶200稀釋室溫孵育30 min后，加入DAPI染細胞核。倒置熒光相差顯微鏡下觀察，并隨機選擇10個非重疊視野，分別計算NSE、GFAP表達陽性細胞比例（陽性率）。實驗重復3次。
1.3.4 Western blot檢測
采用Western blot檢測神經細胞（NSE、GFAP）及Wnt/β-catenin信號通路關鍵組件 ［β-catenin、P-β-catenin、細胞胞質β-catenin（Cytoplasmic β-catenin）及細胞核內β-catenin（Nuclear β-catenin）］ 蛋白水平表達變化。采用總蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白、采用NE-PER核蛋白-胞漿蛋白抽提試劑盒提取細胞質蛋白及核蛋白，并通過BCA蛋白定量分析試劑盒測定蛋白濃度，每孔蛋白上樣30 μg后進行SDS-PAGE凝膠電泳。5%脫脂牛奶封閉2 h后一抗（稀釋比例：兔抗NSE 1∶500、兔抗GFAP 1∶100、兔抗β-catenin 1∶2 000、兔抗P-β-catenin 1∶500、小鼠抗β-actin 1∶5 000、兔抗β-tubulin 1∶500）4℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標記二抗工作液（山羊抗兔1∶10 000、山羊抗小鼠1∶5 000）室溫孵育2 h后曝光，采用Image-Pro Plus 6.0軟件進行灰度分析，以目的蛋白和對應內參蛋白灰度值比值作為目的蛋白相對表達量。同時計算β-catenin核質比（Nuclear β-catenin/Cytoplasmic β-catenin）。實驗重復3次。
1.4 統計學方法
采用SPSS26.0統計軟件進行分析。計量資料經正態性檢驗，均符合正態分布，以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 細胞形態觀察
誘導培養7 d后A、B組細胞仍為長梭形，呈漩渦狀排列；C～E組部分細胞胞體變小、呈雙極和復雜多極，折光性增強，逐漸向四周伸出突起且與相鄰細胞突觸連接，提示hBMSCs分化成典型神經樣細胞形態；D組細胞上述變化較C、E組更明顯。見圖1。
圖1
誘導培養7 d倒置熒光相差顯微鏡觀察
a～e. A～E組細胞形態（×200）；f. D組細胞間可見突觸連接（箭頭）（×400）
Figure1. Cell morphology observation by inverted fluorescence phase contrast microscopy after 7 days of induced culturea-e. Cell morphology of groups A-E, respectively (×200); f. Synaptic connections (arrow) were clearly visible between neural-like cells in group D (×400)
2.2 RT-PCR檢測
2.2.1 神經細胞相關基因
與A組比較，C～E組Nestin、NSE、MAP-2，D、E組GFAP及B組NSE基因相對表達量升高，差異有統計學意義（P<0.05）。與C組比較，D組NSE、MAP-2、GFAP基因相對表達量升高，Nestin基因相對表達量下降；與E組比較，D組Nestin、NSE、MAP-2、GFAP基因相對表達量均升高；差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖2a～d。
圖2
RT-PCR檢測各組神經細胞以及Wnt/β-catenin信號通路相關基因表達
a. Nestin；b. NSE；c. MAP-2；d. GFAP；e. β-catenin；f. Cyclin D1
Figure2. Expressions of genes related to neural cells and Wnt/β-catenin signaling pathway in each group by RT-PCRa. Nestin; b. NSE; c. MAP-2; d. GFAP; e. β-catenin; f. Cyclin D1
2.2.2 Wnt/β-catenin信號通路相關基因
與A組比較，C、D組β-catenin以及B~D組Cyclin D1基因相對表達量升高，差異有統計學意義（P<0.05）。與E組比較，D組β-catenin、Cyclin D1基因相對表達量升高，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖2e、f。
2.3 細胞免疫熒光染色觀察
倒置熒光相差顯微鏡觀察示，C～E組均有部分細胞發出綠色熒光信號。與A組比較，C～E組NSE、GFAP陽性率均升高，差異有統計學意義（P<0.05）；D組兩指標均高于C、E組，差異亦有統計學意義（P<0.05）。見圖3。
圖3
各組細胞免疫熒光染色觀察
a. NSE免疫熒光染色（倒置熒光相差顯微鏡×200） 從左至右分別為A～E組，從上至下分別為NSE染色、DAPI染色以及兩者重疊；b. NSE陽性率；c. GFAP免疫熒光染色（倒置熒光相差顯微鏡×200） 從左至右分別為A～E組，從上至下分別為GFAP染色、DAPI染色以及兩者重疊；d. GFAP陽性率
Figure3. Observation of cellular immunofluorescence staining for each groupa. NSE immunofluorescence staining (Inverted fluorescence phase contrast microscopy×200) From left to right for groups A-E, respectively; from top to bottom for NSE staining, DAPI staining, and merge of NSE and DAPI staining, respectively; b. Ratio of NSE-positive cells; c. GFAP immunofluorescence staining (Inverted fluorescence phase contrast microscopy×200) From left to right for groups A-E, respectively; from top to bottom for GFAP staining, DAPI staining, and merge of GFAP and DAPI staining, respectively; d. Ratio of GFAP-positive cells
2.4 Western blot檢測
2.4.1 神經細胞標志蛋白
與A組比較，C、D組NSE蛋白及C～E組GFAP蛋白相對表達量升高，差異有統計學意義（P<0.05）。與C組比較，D組NSE蛋白相對表達量升高；與E組比較，D組NSE、GFAP蛋白相對表達量均升高；差異有統計學意義（P<0.05）。見圖4a、b。
圖4
Western blot檢測各組神經細胞標志蛋白以及Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白表達
1～5：A～E組 a、b. 神經細胞標志蛋白電泳圖及相對表達量；c、d. Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白電泳圖及相對表達量
Figure4. Expressions of proteins related to neural cells and Wnt/β-catenin signaling pathway detected by Western blot1-5: Groups A-E a, b. Electropherogram and relative expressions for proteins related to neural cells; c, d. Electropherogram and relative expressions for proteins related to Wnt/β-catenin signaling pathway
2.4.2 Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白
與A組比較，C、D組β-catenin、Cytoplasmic β-catenin、Nuclear β-catenin蛋白相對表達量以及β-catenin核質比均升高，P-β-catenin蛋白相對表達量下降，差異均有統計學意義（P<0.05）。與E組比較，D組β-catenin、Cytoplasmic β-catenin、Nuclear β-catenin蛋白相對表達量以及β-catenin核質比均升高，P-β-catenin蛋白相對表達量下降，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖4c、d。
3 討論
創傷性神經損傷、中風和許多神經系統疾病多伴隨神經細胞丟失或功能喪失。雖然研究已證實神經干細胞的存在，但由于其遷移性差及自我更新和分化能力低，使得受損神經組織自我恢復能力非常有限。因此，干細胞療法被認為是治療神經退行性疾病和神經損傷的有效方法[12]。研究表明，BMSCs可以在體內外分化為神經樣細胞，因此BMSCs成神經分化條件及其機制研究備受關注。
作為重要的有絲分裂和神經營養因子，bFGF和EGF在促進神經干細胞自我更新、調控神經干細胞分化和多能干細胞神經樣細胞分化中起重要作用[13-14]。因此，眾多學者利用bFGF和/或EGF刺激多能干細胞向神經樣細胞分化[8, 13, 15]。本研究發現與A組比較，C、D組神經細胞標志基因均升高（C組GFAP除外），B組則無明顯變化（除NSE輕度升高外）；與C組比較，D組神經干細胞標志基因Nestin表達下調，神經細胞標志基因NSE、MAP-2和神經膠質細胞標志基因GFAP表達上調。提示bFGF可單獨誘導hBMSCs成神經細胞分化，而EGF無此作用，但EGF可增強bFGF誘導hBMSCs成神經細胞分化表型。這可能是因為bFGF促進神經干細胞自我更新[16]和分化[17]，主要用于誘導多能干細胞向神經細胞分化。而EGF主要用于促進神經前體細胞分化及軸突生長[18]，且這一過程中EGF通過與神經前體細胞中的EGF響應元件EGFR結合而發揮作用。有研究發現， BMSCs被誘導成神經細胞分化后EGFR表達水平顯著增加，且bFGF的存在也可促進EGF與EGFR的結合[19]。這一定程度上解釋了我們研究發現EGF不具備單獨誘導hBMSCs向神經細胞分化，但可協同增強bFGF誘導hBMSCs向神經細胞分化。雖然如此，bFGF單獨或聯合EGF誘導hBMSCs向神經細胞分化的具體作用機制仍有待進一步研究。
研究表明，Wnt/β-catenin信號通路在BMSCs增殖、衰老及分化中發揮著重要作用[20-21]。此外，該通路還參與調控神經發育多個方面，如神經導管形成、神經干細胞增殖及分化、軸突及樹突的發生和突觸間連接的建立[22-23]。β-catenin在Wnt/β-catenin信號通路中起著至關重要作用。在缺乏Wnt信號情況下，游離細胞質β-catenin被磷酸化，然后被泛素-蛋白酶體系統降解。在Wnt信號存在情況下，未磷酸化的β-catenin在細胞質中積累并易位到細胞核中，促進多種靶基因（如C-myc和Cyclin D1）的轉錄[24]。為了明確Wnt/β-catenin信號通路與hBMSCs成神經分化之間的關系，我們通過RT-PCR和Western blot檢測了β-catenin 基因和蛋白的表達。結果表明，與A組比較，C、D組細胞質和細胞核中β-catenin的表達均增加，且細胞核與細胞質表達比值升高，支持了Wnt/β-catenin信號通路激活介導bFGF單獨或聯合EGF誘導hBMSCs向神經細胞分化的假設。與A組比較，D、E組神經標志基因及蛋白表達均升高，且D組高于E組，提示對Wnt/β-catenin信號通路通過特異性阻滯劑DKK-1進行阻滯后，bFGF聯合EGF誘導hBMSCs成神經分化作用削弱但不完全抑制，提示除Wnt/β-catenin信號通路外，可能存在其他信號通路參與bFGF單獨或聯合EGF誘導hBMSCs成神經分化，這有待進一步研究。
綜上述，bFGF可誘導hBMSCs向神經細胞分化，EGF則不能，但EGF能夠增強bFGF誘導作用；Wnt/β-catenin信號通路在這一過程發揮正向調控作用。本研究結果為hBMSCs運用于臨床神經退行性疾病治療和神經損傷修復提供了新靶點。
利益沖突 在課題研究及文章撰寫過程中不存在利益沖突
作者貢獻聲明 施劍明：研究設計及實驗，數據收集及統計分析，論文撰寫；殷明：研究設計并對文章的知識性內容進行批評性審閱
