引用本文： 施劍明, 曹俊, 殷明, 殷嫦嫦, 程細高, 謝榮輝, 林思文, 徐浚懷. 白血病抑制因子聯合bFGF對人BMSCs增殖及分化的影響. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(9): 1150-1155. doi: 10.7507/1002-1892.20140249 復制
干細胞可廣泛應用于組織工程、細胞工程、藥物篩選等領域，獲得大量多能干細胞是近十年研究的熱點；通過轉基因手段將成纖維細胞轉化為誘導性多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPS）是該領域的重大突破[1]，但由于具有高致瘤性等安全性問題，iPS還不能作為替代細胞用于生物治療[2]，因此研究如何獲得大量可作為替代細胞用途的干細胞具有重要意義。BMSCs具有強大的多向分化潛能，在不同條件下可向多個胚層的細胞分化[3-6]，且具有來源廣、安全性高等優點，因而可作為替代細胞用于組織工程及細胞工程領域的研究。然而研究發現[7-9]，經多次傳代后，BMSCs會出現不同程度的衰老、分化征象，導致增殖效率及分化潛能隨之下降，限制了其在上述領域的應用。因此如何快速體外擴增BMSCs并盡量維持其多向分化潛能具有重要意義。bFGF作為一種內源性多肽生長因子，已被證實具有強大的促進BMSCs增殖作用[10]；然而我們既往研究顯示，bFGF在促進BMSCs增殖的同時會導致其不同程度向神經細胞分化[11-12]。白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）是IL-6細胞因子家族中的一員，其在BMSCs中的表達量隨著BMSCs的分化而下降，提示LIF是一種抑制BMSCs分化的生長因子[13]。本次實驗我們聯合LIF和bFGF作用于體外培養的人BMSCs（human BMSCs，hBMSCs），以尋求建立一種體外快速、大量擴增hBMSCs的新方法。
1 材料與方法
1.1 實驗材料及主要試劑、儀器
hBMSCs（江陰齊氏生物科技有限公司），取第2代細胞用于實驗。α-MEM培養基（HyClone公司，美國）；FBS（GIBCO公司，美國）；0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液、胰蛋白酶粉及青、鏈霉素混合液（北京索萊寶科技有限公司）；bFGF、LIF（Peprotech公司，美國）；CD44-FITC、CD90-PE、CD19-PE、CD34-FITC、HLA-DR-FITC、IgG-PE單抗（Abcam公司，英國）；細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8；上海經科化學科技有限公司）；25 cm2塑料培養瓶、96孔板（Corning公司，美國）。倒置相差顯微鏡（Nikon公司，日本）；CO2恒溫培養箱（SIM公司，美國）；Model680酶標儀（Bio-Rad公司，美國）；流式細胞儀（BD公司，美國）。
1.2 hBMSCs的擴增、純化及鑒定
取第2代hBMSCs，用含10%FBS及1%雙抗的α-MEM培養基常規貼壁培養，每3天換液1次，待貼壁細胞融合達90%后按1：3比例傳代，取換液、傳代純化后的第4代hBMSCs進行鑒定。用0.25%胰蛋白酶（不含EDTA）消化第4代hBMSCs后，以含10%FBS的PBS離心（離心半徑10 cm、1 000 r/min離心5 min）洗滌2遍，再用含10%FBS的PBS重懸細胞，調整細胞密度為1×106個/mL，分裝至5個1.5 mL EP管中，每管80 μL；分別加入CD44-FITC、CD90-PE、CD19-PE、CD34-FITC單抗20 μL，其中CD19-PE、CD34-FITC加入同一管細胞中，并設置同型對照組（含HLA-DR-FITC、IgG-PE單抗）、空白對照組，室溫避光孵育30 min后同上法離心洗滌2遍，去除未結合抗體，2 h內流式細胞儀檢測鑒定。
1.3 CCK-8測定不同培養條件下hBMSCs生長曲線
取對數生長期的第4代hBMSCs常規消化后，按1×104個/mL密度接種于96孔板中，每孔200 μL，共接種7塊板。根據培養條件不同分為4組：A組為對照組，加入完全培養基（含10%FBS的α-MEM培養基）常規繼續培養；B組為LIF組，加入含10 ng/mL LIF的完全培養基；C組為bFGF組，加入含10 ng/mL bFGF的完全培養基；D組為LIF + bFGF組，加入含10 ng/mL LIF和10 ng/mL bFGF的完全培養基。每組設4個復孔及藥物空白孔，每3天換液1次。分別于培養1、3、5、7、9、11、13 d各取1塊培養板行CCK-8檢測。每孔加入20 μL CCK-8試劑，CO2恒溫培養箱中孵育2 h后取出，于酶標儀450 nm波長處測定其吸光度（A）值，繪制生長曲線。
1.4 倒置相差顯微鏡觀察不同培養條件下hBMSCs形態變化
取第4代hBMSCs種植于25 cm2塑料培養瓶中，同1.3方法分組，每組各1瓶。每3天換液1次，待貼壁細胞融合達90%后按1：3比例傳代，倒置相差顯微鏡連續觀察細胞形態變化。
1.5 流式細胞術檢測不同培養條件下hBMSCs表面標志變化
取第4代hBMSCs同1.3方法分組后培養傳代至第8代，同1.2方法于流式細胞儀上檢測各組hBMSCs表面標志CD44、CD90、CD19、CD34的表達。
1.6 統計學方法
采用SPSS19.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Scheffe檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 hBMSCs的擴增、純化及鑒定
第2代細胞貼壁后形態多樣，大部分呈典型的多角形、長梭形（圖 1a）；約2周后細胞呈緊密的漩渦樣及魚群樣集落，融合達90%。傳至第3代后細胞形態以長梭形或扁平形為主，但仍含有少量雜細胞（圖 1b）。第4代細胞形態基本呈單一成纖維細胞樣，呈漩渦狀貼壁生長（圖 1c）。
圖1
hBMSCs形態學觀察（倒置相差顯微鏡× 100）?第2代細胞培養1 d ?第3代細胞培養7 d ?第4代細胞培養14 d ??圖 2流式細胞術鑒定第4代hBMSCs表面標志?空白對照?CD44 ?CD90 ?CD19/34
Figure1.
Morphology observation of hBMSCs (Inverted phase contrast microscope×100) ?hBMSCs at passage 2 cultured for 1 day ?hBMSCs at passage 3 cultured for 7 days ?hBMSCs at passage 4 cultured for 14 days ??Fig. 2 Surface markers of hBMSCs at passage 4 by flow cytometry ?Blank control group ?CD44 ?CD90 ?CD19/34
第4代細胞經流式細胞術檢測示，細胞表面骨髓基質標志CD44、CD90表達呈陽性，分別為98.24%、95.89%；而造血細胞標志CD19、CD34表達呈陰性，合計陽性率僅為1.91%。見圖 2。
2.2 CCK-8測定不同培養條件下hBMSCs生長曲線
4組細胞生長曲線均近似S形。A、B組細胞接種5 d內增殖相對緩慢，處于潛伏期；于5 d開始進入對數生長期，7～13 d時B組A值高于A組，差異有統計學意義（P < 0.05）；A、B組分別于11 d和9 d后進入平臺期。C、D組均于3 d即進入對數生長期，3～13 d時C、D組A值均高于A組，差異有統計學意義（P < 0.05）；5～13 d時C組A值高于B組，差異有統計學意義（P < 0.05）；3～13 d時D組A值高于B組，差異有統計學意義（P < 0.05）；3～11 d時D組A值高于C組，差異有統計學意義（P < 0.05）；C、D組分別于9 d和7 d進入平臺期。見圖 3。
圖3
各組hBMSCs生長曲線
Figure3.
The growth curves of hBMSCs in different groups
2.3 不同培養條件下hBMSCs形態變化
倒置相差顯微鏡觀察示，A組hBMSCs生長緩慢，傳至第6代后細胞即出現不同程度的衰老、分化征象，表現為細胞胞體變大、立體感減弱、細胞間間隔不清、部分細胞呈扁平狀、細胞形狀趨向多樣（似枯樹皮樣），且培養基中漂浮碎末狀物質；傳至第10代后細胞逐漸停止生長，大量細胞脫離培養瓶呈漂浮狀態。C組第4代細胞表現出較快的增殖速率；傳至第5、6代后早期可觀察到少量細胞呈神經樣細胞分化，表現為細胞體積變小、胞體呈圓形或橢圓形、向周圍伸出突起、折光性增強，但增殖速率仍較快；傳至第10代后細胞出現不同程度老化現象，神經樣細胞逐漸消失。D組細胞增殖迅速，傳至第10代后大多數細胞仍能維持hBMSCs的形態特點。B組細胞與C、D組比較生長相對緩慢，傳至第10代后部分細胞呈扁平狀，似衰老細胞。見圖 4。
圖4
倒置相差顯微鏡觀察各組細胞形態學變化?A組第4代（× 100）?B組第4代（× 100）?C組第4代（× 100）?D組第4代（× 100）?A組第6代（× 100）?B組第6代（× 100）?C組第6代（× 200）箭頭示神經樣細胞?D組第6代（× 100）?A組第8代（× 100）?B組第8代（× 100）?C組第8代（× 100）箭頭示神經樣細胞?D組第8代（× 100）?A組第10代（× 100）?B組第10代（× 100）?C組第10代（× 100）?D組第10代（×100）
Figure4.
Morphology observation of hBMSCs by inverted phase contrast microscope ?hBMSCs at passage 4 in group A (× 100) ?hBMSCs at passage 4 in group B (× 100) ?hBMSCs at passage 4 in group C (× 100) ?hBMSCs at passage 4 in group D (× 100) ?hBMSCs at passage 6 in group A (× 100) ?hBMSCs at passage 6 in group B (× 100) ?hBMSCs at passage 6 in group C (× 200) Arrow indicated nerve-like cells ?hBMSCs at passage 6 in group D (× 100) ?hBMSCs at passage 8 in group A (× 100) ?hBMSCs at passage 8 in group B (× 100) ?hBMSCs at passage 8 in group C (× 100) Arrow indicated nerve-like cells ?hBMSCs at passage 8 in group D (× 100) ?hBMSCs at passage 10 in group A (× 100) ?hBMSCs at passage 10 in group B (× 100) ?hBMSCs at passage 10 in group C (× 100) ?hBMSCs at passage 10 in group D (× 100)
2.4 流式細胞術檢測不同培養條件下hBMSCs表面標志變化
各組第8代細胞流式細胞術檢測示，與第4代細胞相比，A、C組骨髓基質標志CD44、CD90表達明顯下降；而B、D組均能維持較高表達。各組造血細胞標志CD19、CD34均呈陰性，組間差異不明顯。見圖 5。
圖5
流式細胞術檢測各組第8代hBMSCs表面標志?A組CD44 ?B組CD44 ?C組CD44 ?D組CD44 ?A組CD90 ?B組CD90 ?C組CD90 ?D組CD90 ?A組CD19/34 ?B組CD19/34 ?C組CD19/34 ?D組CD19/34
Figure5.
Surface markers of hBMSCs at passage 8 by flow cytometry ?Expression of CD44 in group A ?Expression of CD44 in group B ?Expression of CD44 in group C ?Expression of CD44 in group D ?Expression of CD90 in group A ?Expression of CD90 in group B ?Expression of CD90 in group C ?Expression of CD90 in group D ?Expression of CD19/34 in group A ?Expression of CD19/34 in group B ?Expression of CD19/34 in group C ?Expression of CD19/34 in group D
3 討論
由于骨髓中BMSCs含量極少，僅占骨髓單核細胞的0.001%～0.01%，要獲得足夠的BMSCs就必須實現其體外快速有效擴增。體內BMSCs處于精確復雜的微環境中，具有強大的自我增殖能力及多向分化潛能；但體外培養的BMSCs因失去了機體的神經體液調節，無法獲得足夠維持其干性及增殖所需的細胞因子，且由體內多種不同類型細胞相互影響變成了單一細胞接觸，導致BMSCs增殖效率及分化潛能下降。因此，如何在體外培養BMSCs過程中通過合理添加細胞因子對細胞進行調控，提高其增殖能力、保留分化潛能是目前研究的主要問題。
bFGF是一種含118～155個氨基酸的促有絲分裂的陽離子多肽，具有很強的促細胞分裂增殖及抑制細胞凋亡作用。LIF在調節細胞存活、增殖和分化方面發揮著重要作用[14]，因其能夠抑制胚胎干細胞分化已廣泛用于胚胎干細胞的體外培養[15]；而LIF對于BMSCs的作用尚不清楚。Gimble等[16]和Malaval等[17]分別報道了LIF能夠抑制BMSCs向脂肪細胞及成骨細胞分化；Whitney等[13]的研究從基因水平證實隨著BMSCs的傳代及分化，LIF表達量逐漸下降。因此，我們認為LIF對BMSCs可能具有類似于其對胚胎干細胞抑制分化的作用。而這一作用可能是通過作用于細胞表面的LIF受體及gp130受體，從而激活JAK-STAT信號途徑來發揮作用的[14]。
增殖和分化是hBMSCs自我更新過程中相互制約的兩種細胞特性。本實驗將LIF及bFGF單獨或聯合作用于hBMSCs，通過CCK-8法測得LIF和bFGF均有促進hBMSCs增殖的作用，且兩者聯合時作用更明顯。細胞形態學觀察及流式細胞術鑒定結果均表明LIF能夠抑制hBMSCs分化，而LIF對hBMSCs的促增殖作用可能與hBMSCs分化減少有關。hBMSCs在bFGF作用一段時間后，出現少量細胞呈神經樣細胞分化，這與文獻報道[18-20]一致，但仍以促細胞增殖作用為主，這可能與血清濃度有關。因前期實驗中我們發現，bFGF對BMSCs的作用在較低血清濃度（1%）主要表現為誘導細胞分化[12]，而在本次實驗采用較高血清濃度（10%）培養時主要表現為促細胞增殖。LIF聯合bFGF作用于hBMSCs，不僅具有明顯的促增殖作用，而且能夠抑制其分化，兩種細胞因子存在協同效應。
綜上述，本實驗結果表明LIF聯合bFGF不僅可以維持hBMSCs的生物學特性，而且能夠促進hBMSCs的快速增殖，是一種理想的體外擴增hBMSCs方法，可為組織工程、細胞治療和基因治療等領域提供大量具有生物學活性的種子細胞。
干細胞可廣泛應用于組織工程、細胞工程、藥物篩選等領域，獲得大量多能干細胞是近十年研究的熱點；通過轉基因手段將成纖維細胞轉化為誘導性多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPS）是該領域的重大突破[1]，但由于具有高致瘤性等安全性問題，iPS還不能作為替代細胞用于生物治療[2]，因此研究如何獲得大量可作為替代細胞用途的干細胞具有重要意義。BMSCs具有強大的多向分化潛能，在不同條件下可向多個胚層的細胞分化[3-6]，且具有來源廣、安全性高等優點，因而可作為替代細胞用于組織工程及細胞工程領域的研究。然而研究發現[7-9]，經多次傳代后，BMSCs會出現不同程度的衰老、分化征象，導致增殖效率及分化潛能隨之下降，限制了其在上述領域的應用。因此如何快速體外擴增BMSCs并盡量維持其多向分化潛能具有重要意義。bFGF作為一種內源性多肽生長因子，已被證實具有強大的促進BMSCs增殖作用[10]；然而我們既往研究顯示，bFGF在促進BMSCs增殖的同時會導致其不同程度向神經細胞分化[11-12]。白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）是IL-6細胞因子家族中的一員，其在BMSCs中的表達量隨著BMSCs的分化而下降，提示LIF是一種抑制BMSCs分化的生長因子[13]。本次實驗我們聯合LIF和bFGF作用于體外培養的人BMSCs（human BMSCs，hBMSCs），以尋求建立一種體外快速、大量擴增hBMSCs的新方法。
1 材料與方法
1.1 實驗材料及主要試劑、儀器
hBMSCs（江陰齊氏生物科技有限公司），取第2代細胞用于實驗。α-MEM培養基（HyClone公司，美國）；FBS（GIBCO公司，美國）；0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液、胰蛋白酶粉及青、鏈霉素混合液（北京索萊寶科技有限公司）；bFGF、LIF（Peprotech公司，美國）；CD44-FITC、CD90-PE、CD19-PE、CD34-FITC、HLA-DR-FITC、IgG-PE單抗（Abcam公司，英國）；細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8；上海經科化學科技有限公司）；25 cm2塑料培養瓶、96孔板（Corning公司，美國）。倒置相差顯微鏡（Nikon公司，日本）；CO2恒溫培養箱（SIM公司，美國）；Model680酶標儀（Bio-Rad公司，美國）；流式細胞儀（BD公司，美國）。
1.2 hBMSCs的擴增、純化及鑒定
取第2代hBMSCs，用含10%FBS及1%雙抗的α-MEM培養基常規貼壁培養，每3天換液1次，待貼壁細胞融合達90%后按1：3比例傳代，取換液、傳代純化后的第4代hBMSCs進行鑒定。用0.25%胰蛋白酶（不含EDTA）消化第4代hBMSCs后，以含10%FBS的PBS離心（離心半徑10 cm、1 000 r/min離心5 min）洗滌2遍，再用含10%FBS的PBS重懸細胞，調整細胞密度為1×106個/mL，分裝至5個1.5 mL EP管中，每管80 μL；分別加入CD44-FITC、CD90-PE、CD19-PE、CD34-FITC單抗20 μL，其中CD19-PE、CD34-FITC加入同一管細胞中，并設置同型對照組（含HLA-DR-FITC、IgG-PE單抗）、空白對照組，室溫避光孵育30 min后同上法離心洗滌2遍，去除未結合抗體，2 h內流式細胞儀檢測鑒定。
1.3 CCK-8測定不同培養條件下hBMSCs生長曲線
取對數生長期的第4代hBMSCs常規消化后，按1×104個/mL密度接種于96孔板中，每孔200 μL，共接種7塊板。根據培養條件不同分為4組：A組為對照組，加入完全培養基（含10%FBS的α-MEM培養基）常規繼續培養；B組為LIF組，加入含10 ng/mL LIF的完全培養基；C組為bFGF組，加入含10 ng/mL bFGF的完全培養基；D組為LIF + bFGF組，加入含10 ng/mL LIF和10 ng/mL bFGF的完全培養基。每組設4個復孔及藥物空白孔，每3天換液1次。分別于培養1、3、5、7、9、11、13 d各取1塊培養板行CCK-8檢測。每孔加入20 μL CCK-8試劑，CO2恒溫培養箱中孵育2 h后取出，于酶標儀450 nm波長處測定其吸光度（A）值，繪制生長曲線。
1.4 倒置相差顯微鏡觀察不同培養條件下hBMSCs形態變化
取第4代hBMSCs種植于25 cm2塑料培養瓶中，同1.3方法分組，每組各1瓶。每3天換液1次，待貼壁細胞融合達90%后按1：3比例傳代，倒置相差顯微鏡連續觀察細胞形態變化。
1.5 流式細胞術檢測不同培養條件下hBMSCs表面標志變化
取第4代hBMSCs同1.3方法分組后培養傳代至第8代，同1.2方法于流式細胞儀上檢測各組hBMSCs表面標志CD44、CD90、CD19、CD34的表達。
1.6 統計學方法
采用SPSS19.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Scheffe檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 hBMSCs的擴增、純化及鑒定
第2代細胞貼壁后形態多樣，大部分呈典型的多角形、長梭形（圖 1a）；約2周后細胞呈緊密的漩渦樣及魚群樣集落，融合達90%。傳至第3代后細胞形態以長梭形或扁平形為主，但仍含有少量雜細胞（圖 1b）。第4代細胞形態基本呈單一成纖維細胞樣，呈漩渦狀貼壁生長（圖 1c）。
圖1
hBMSCs形態學觀察（倒置相差顯微鏡× 100）?第2代細胞培養1 d ?第3代細胞培養7 d ?第4代細胞培養14 d ??圖 2流式細胞術鑒定第4代hBMSCs表面標志?空白對照?CD44 ?CD90 ?CD19/34
Figure1.
Morphology observation of hBMSCs (Inverted phase contrast microscope×100) ?hBMSCs at passage 2 cultured for 1 day ?hBMSCs at passage 3 cultured for 7 days ?hBMSCs at passage 4 cultured for 14 days ??Fig. 2 Surface markers of hBMSCs at passage 4 by flow cytometry ?Blank control group ?CD44 ?CD90 ?CD19/34
第4代細胞經流式細胞術檢測示，細胞表面骨髓基質標志CD44、CD90表達呈陽性，分別為98.24%、95.89%；而造血細胞標志CD19、CD34表達呈陰性，合計陽性率僅為1.91%。見圖 2。
2.2 CCK-8測定不同培養條件下hBMSCs生長曲線
4組細胞生長曲線均近似S形。A、B組細胞接種5 d內增殖相對緩慢，處于潛伏期；于5 d開始進入對數生長期，7～13 d時B組A值高于A組，差異有統計學意義（P < 0.05）；A、B組分別于11 d和9 d后進入平臺期。C、D組均于3 d即進入對數生長期，3～13 d時C、D組A值均高于A組，差異有統計學意義（P < 0.05）；5～13 d時C組A值高于B組，差異有統計學意義（P < 0.05）；3～13 d時D組A值高于B組，差異有統計學意義（P < 0.05）；3～11 d時D組A值高于C組，差異有統計學意義（P < 0.05）；C、D組分別于9 d和7 d進入平臺期。見圖 3。
圖3
各組hBMSCs生長曲線
Figure3.
The growth curves of hBMSCs in different groups
2.3 不同培養條件下hBMSCs形態變化
倒置相差顯微鏡觀察示，A組hBMSCs生長緩慢，傳至第6代后細胞即出現不同程度的衰老、分化征象，表現為細胞胞體變大、立體感減弱、細胞間間隔不清、部分細胞呈扁平狀、細胞形狀趨向多樣（似枯樹皮樣），且培養基中漂浮碎末狀物質；傳至第10代后細胞逐漸停止生長，大量細胞脫離培養瓶呈漂浮狀態。C組第4代細胞表現出較快的增殖速率；傳至第5、6代后早期可觀察到少量細胞呈神經樣細胞分化，表現為細胞體積變小、胞體呈圓形或橢圓形、向周圍伸出突起、折光性增強，但增殖速率仍較快；傳至第10代后細胞出現不同程度老化現象，神經樣細胞逐漸消失。D組細胞增殖迅速，傳至第10代后大多數細胞仍能維持hBMSCs的形態特點。B組細胞與C、D組比較生長相對緩慢，傳至第10代后部分細胞呈扁平狀，似衰老細胞。見圖 4。
圖4
倒置相差顯微鏡觀察各組細胞形態學變化?A組第4代（× 100）?B組第4代（× 100）?C組第4代（× 100）?D組第4代（× 100）?A組第6代（× 100）?B組第6代（× 100）?C組第6代（× 200）箭頭示神經樣細胞?D組第6代（× 100）?A組第8代（× 100）?B組第8代（× 100）?C組第8代（× 100）箭頭示神經樣細胞?D組第8代（× 100）?A組第10代（× 100）?B組第10代（× 100）?C組第10代（× 100）?D組第10代（×100）
Figure4.
Morphology observation of hBMSCs by inverted phase contrast microscope ?hBMSCs at passage 4 in group A (× 100) ?hBMSCs at passage 4 in group B (× 100) ?hBMSCs at passage 4 in group C (× 100) ?hBMSCs at passage 4 in group D (× 100) ?hBMSCs at passage 6 in group A (× 100) ?hBMSCs at passage 6 in group B (× 100) ?hBMSCs at passage 6 in group C (× 200) Arrow indicated nerve-like cells ?hBMSCs at passage 6 in group D (× 100) ?hBMSCs at passage 8 in group A (× 100) ?hBMSCs at passage 8 in group B (× 100) ?hBMSCs at passage 8 in group C (× 100) Arrow indicated nerve-like cells ?hBMSCs at passage 8 in group D (× 100) ?hBMSCs at passage 10 in group A (× 100) ?hBMSCs at passage 10 in group B (× 100) ?hBMSCs at passage 10 in group C (× 100) ?hBMSCs at passage 10 in group D (× 100)
2.4 流式細胞術檢測不同培養條件下hBMSCs表面標志變化
各組第8代細胞流式細胞術檢測示，與第4代細胞相比，A、C組骨髓基質標志CD44、CD90表達明顯下降；而B、D組均能維持較高表達。各組造血細胞標志CD19、CD34均呈陰性，組間差異不明顯。見圖 5。
圖5
流式細胞術檢測各組第8代hBMSCs表面標志?A組CD44 ?B組CD44 ?C組CD44 ?D組CD44 ?A組CD90 ?B組CD90 ?C組CD90 ?D組CD90 ?A組CD19/34 ?B組CD19/34 ?C組CD19/34 ?D組CD19/34
Figure5.
Surface markers of hBMSCs at passage 8 by flow cytometry ?Expression of CD44 in group A ?Expression of CD44 in group B ?Expression of CD44 in group C ?Expression of CD44 in group D ?Expression of CD90 in group A ?Expression of CD90 in group B ?Expression of CD90 in group C ?Expression of CD90 in group D ?Expression of CD19/34 in group A ?Expression of CD19/34 in group B ?Expression of CD19/34 in group C ?Expression of CD19/34 in group D
3 討論
由于骨髓中BMSCs含量極少，僅占骨髓單核細胞的0.001%～0.01%，要獲得足夠的BMSCs就必須實現其體外快速有效擴增。體內BMSCs處于精確復雜的微環境中，具有強大的自我增殖能力及多向分化潛能；但體外培養的BMSCs因失去了機體的神經體液調節，無法獲得足夠維持其干性及增殖所需的細胞因子，且由體內多種不同類型細胞相互影響變成了單一細胞接觸，導致BMSCs增殖效率及分化潛能下降。因此，如何在體外培養BMSCs過程中通過合理添加細胞因子對細胞進行調控，提高其增殖能力、保留分化潛能是目前研究的主要問題。
bFGF是一種含118～155個氨基酸的促有絲分裂的陽離子多肽，具有很強的促細胞分裂增殖及抑制細胞凋亡作用。LIF在調節細胞存活、增殖和分化方面發揮著重要作用[14]，因其能夠抑制胚胎干細胞分化已廣泛用于胚胎干細胞的體外培養[15]；而LIF對于BMSCs的作用尚不清楚。Gimble等[16]和Malaval等[17]分別報道了LIF能夠抑制BMSCs向脂肪細胞及成骨細胞分化；Whitney等[13]的研究從基因水平證實隨著BMSCs的傳代及分化，LIF表達量逐漸下降。因此，我們認為LIF對BMSCs可能具有類似于其對胚胎干細胞抑制分化的作用。而這一作用可能是通過作用于細胞表面的LIF受體及gp130受體，從而激活JAK-STAT信號途徑來發揮作用的[14]。
增殖和分化是hBMSCs自我更新過程中相互制約的兩種細胞特性。本實驗將LIF及bFGF單獨或聯合作用于hBMSCs，通過CCK-8法測得LIF和bFGF均有促進hBMSCs增殖的作用，且兩者聯合時作用更明顯。細胞形態學觀察及流式細胞術鑒定結果均表明LIF能夠抑制hBMSCs分化，而LIF對hBMSCs的促增殖作用可能與hBMSCs分化減少有關。hBMSCs在bFGF作用一段時間后，出現少量細胞呈神經樣細胞分化，這與文獻報道[18-20]一致，但仍以促細胞增殖作用為主，這可能與血清濃度有關。因前期實驗中我們發現，bFGF對BMSCs的作用在較低血清濃度（1%）主要表現為誘導細胞分化[12]，而在本次實驗采用較高血清濃度（10%）培養時主要表現為促細胞增殖。LIF聯合bFGF作用于hBMSCs，不僅具有明顯的促增殖作用，而且能夠抑制其分化，兩種細胞因子存在協同效應。
綜上述，本實驗結果表明LIF聯合bFGF不僅可以維持hBMSCs的生物學特性，而且能夠促進hBMSCs的快速增殖，是一種理想的體外擴增hBMSCs方法，可為組織工程、細胞治療和基因治療等領域提供大量具有生物學活性的種子細胞。
