引用本文： 王永成, 孟昊業, 袁雪凌, 彭江, 郭全義, 盧世璧, 汪愛媛. 體外模擬壓應力三維動態培養構建組織工程軟骨的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(9): 1145-1149. doi: 10.7507/1002-1892.20140248 復制
關節軟骨損傷后如未及時接受適當的治療，可能導致永久性退行性病變[1]。為了防止軟骨病變的發展，尤其對于年輕患者，在發病早期即進行軟骨表面修復具有重要意義。近年來，組織工程學和細胞生物學的發展為關節軟骨損傷的修復提供了新選擇，應用組織工程技術修復軟骨缺損已成為研究熱點。然而大量實驗及臨床研究顯示，其修復效果仍存在不足之處，主要表現為修復組織與天然軟骨形態和成分不同[2]以及力學性能的差異[3-4]。因此，如何增強組織工程軟骨的功能，提高軟骨缺損修復效果，減少修復組織退變，已成為軟骨組織工程和再生醫學領域的焦點問題。目前，生物反應器已應用于軟骨組織工程的研究，其不僅能提供組織培養的“微環境”，而且可以模擬關節軟骨在體內復雜的生物力學狀態，為組織工程軟骨的三維構建提供良好條件[5-6]。在既往研究中[7-9]，我們對天然關節軟骨進行脫細胞處理去除其抗原性，采用冷凍干燥法成功制備了以關節軟骨細胞外基質（extracellular matrix，ECM）為原料的三維多孔支架，其具有合適的孔徑和孔隙率及良好的生物相容性，可作為軟骨組織工程理想的支架載體。本實驗以軟骨細胞作為種子細胞，接種于脫細胞關節軟骨ECM源性三維多孔支架上，通過比較經生物反應器內周期性壓應力刺激的動態培養與普通靜態培養構建的組織工程軟骨差異，探討力學刺激促進組織工程軟骨內部基質分泌和營養物質傳遞的效應，以及對其力學特性的影響，為體外組織工程軟骨的三維構建提供優化方案。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要材料、試劑、儀器
健康成年新西蘭大白兔3只，雌雄不限，體重2.5～3.0 kg，由解放軍總醫院動物實驗中心提供，實驗方案經過解放軍總醫院動物實驗管理委員會批準。
關節軟骨ECM源性三維多孔支架由解放軍總醫院全軍骨科研究所提供（圖 1），孔徑（155±35）μm，孔隙率89%～93%，直徑6 mm，高8 mm，60Co輻照消毒后密封保存。H-DMEM/F12培養基、FBS、0.25%胰蛋白酶（GIBCO公司，美國）；L-脯氨酸、抗壞血酸、胰島素、抑肽酶、Ⅱ型膠原酶、Hoechst 33258染色劑、二乙酸熒光素（fluorescein diacetate，FDA）、活-死細胞染色試劑盒（Sigma公司，美國）；非必需氨基酸（HyClone公司，美國）；羥脯氨酸試劑盒（南京建成生物工程研究所）。
圖1
關節軟骨ECM源性三維多孔支架外觀??圖 2第2代兔軟骨細胞培養1周（倒置相差顯微鏡× 200）??圖 3兩組細胞-支架復合物培養3周激光共聚焦顯微鏡觀察（× 20）? A組?B組??圖 4兩組細胞-支架復合物培養3周掃描電鏡觀察（× 500）? A組? B組
Figure1.
Macroscopic view of three-dimensional porous articular cartilage ECM scaffolds ??Fig. 2 Microscopic view of passage 2 rabbits' chondrocytes after 1 week of culturing (Inverted phase contrast microscopy×200) ??Fig. 3 Laser scanning confocal microscopy observation of cell-scaffold constructs of 2 groups after 3 weeks of culturing (× 20) ?Group A ?Group B ??Fig. 4 Scanning electron microscopy observation of cell-scaffold constructs of 2 groups after 3 weeks of culturing (× 500) ?Group A ?Group B
IX70倒置相差顯微鏡、BX-51激光共聚焦顯微鏡、DP70圖像采集系統（Olympus公司，日本）；BCPCAS4800掃描電鏡（Hitachi公司，日本）；L/S? 07523-90蠕動泵（Masterflex公司，美國）；BioDynamicTM生物反應器、Electro Force? 3220力學試驗機（Bose公司，美國）；DU-640紫外分光光度計（Beckman Coulter公司，美國）；M530游標卡尺（Mitutoyo公司，日本）。
1.2 軟骨細胞分離及培養
取3只新西蘭大白兔耳緣靜脈注射空氣栓塞處死，無菌條件下切取四肢關節表面軟骨，用D-Hank液沖洗多次，剪成1 mm×1 mm×1 mm大小顆粒，加入10倍體積的0.2%Ⅱ型膠原酶，37℃消化6 h，200目金屬網過濾，以離心半徑8 cm、1 700 r/min離心10 min，棄上清；D-Hank液洗滌細胞團，同上法離心，加入完全培養基（含10%FBS的H-DMEM培養基），制成細胞懸液，調整細胞密度為5×105個/mL，接種于50 cm2培養瓶中，于37℃、5%CO2及95%濕度培養箱中培養，隔天更換培養液，倒置相差顯微鏡下觀察兔軟骨細胞呈三角形或多角形，折光性好。原代細胞融合約90%時，以0.25%胰蛋白酶消化傳代擴增，取第2代軟骨細胞用于實驗（圖 2）。
1.3 細胞-支架復合物制備
取關節軟骨ECM源性三維多孔支架，于完全培養基中浸泡2 h，取出后用消毒吸水紙將水分盡量吸干，置入6孔板中備用。收集第2代兔關節軟骨細胞，以離心半徑8 cm、1 500 r/min離心5 min，將細胞制成密度為2×107個/mL的細胞懸液，每個支架接種1 mL細胞懸液，待完全吸附濕潤后放入37℃、5%CO2及95%濕度培養箱中，孵育2 h后取出放入培養瓶中，緩慢添加含10%FBS、50 μg/mL抗壞血酸、40 μg/mL脯氨酸、非必需氨基酸和500 U/mL抑肽酶的DMEM培養液，進行靜態預培養5 d。
1.4 實驗分組及培養方法
預培養5 d后將細胞-支架復合物隨機分為2組，均采用軟骨培養液（含10%FBS、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM/F12培養基）。A組繼續靜態培養3周，每周換液3次。B組采用模擬壓應力三維動態培養：將細胞-支架復合物置于生物反應器培養倉內，按設定條件行力學加載培養。為模擬人日常活動狀態，加壓條件為[10-11]：15%壓縮應變、頻率1 Hz；每天加載2次，每次1 h，間隔8 h，連續加載3周。蠕動泵驅動培養液循環，流速為3 mL/min。整個加載過程在37℃、95%濕度環境中進行；力學加載裝置在使用前對其零件均進行高溫高壓、60Co輻照等滅菌處理。培養3周后取出兩組樣本，進行以下檢測。
1.5 檢測指標
1.5.1 細胞活性檢測
采用活-死細胞染色試劑盒檢測細胞活性。兩組樣本棄培養基，經PBS清洗后，切取中央部分薄片（厚度1 mm），避光、20℃環境下，FDA（5×10-3 mg/mL）工作液反應5 min。棄去反應后液體，PBS清洗2次，激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞活性。
1.5.2 掃描電鏡觀察
兩組樣本PBS清洗后，2.5%戊二醛4℃恒溫下固定24 h，取出PBS清洗20 min×2次，1%四氧化鋨酸后固定2 h，PBS清洗，95%乙醇脫水過夜后，室溫干燥48 h，上機噴金，掃描電鏡觀察細胞在支架上的形態和分布。
1.5.3 生化成分分析
①糖胺聚糖（glycosaminog-lycan，GAG）含量測定：采用二甲基亞甲藍比色法，兩組各取4個樣本，凍干后稱重，加入木瓜蛋白酶裂解液，65℃裂解48 h，以離心半徑8 cm、1 500 r/min離心5 min。取裂解液100 μL加入3 mL二甲基亞甲藍，于紫外分光光度計480 nm波長下檢測吸光度（A）值，根據標準品濃度作標準曲線，計算GAG含量。②膠原蛋白含量測定：根據羥脯氨酸試劑盒說明，用紫外分光光度計測定樣本中羥脯氨酸含量后，換算成膠原蛋白含量。吸取①中制備的兩組木瓜蛋白酶裂解液0.5 mL，加試劑盒水解液1 mL水解20 min；調整pH值至6.0～6.8，加蒸餾水至10 mL，混勻；加適量活性炭，以離心半徑8 cm、3 500 r/min離心10 min，取1 mL上清加入5 μg/mL標準液1 mL，混勻，60℃水浴15 min；冷卻后以離心半徑8 cm、3 500 r/min離心10 min，取上清加入石英杯內，于紫外分光光度計550 nm波長處比色，蒸餾水調零，測各管A值，計算膠原蛋白含量。③ DNA含量檢測：以小牛胸腺DNA含量作為標準，兩組各取4個樣本，用熒光染料Hoechst 33258標記后，采用熒光測定法（激發波長355 nm，發射波長450 nm）分析DNA含量。
1.5.4 力學性能測試
兩組各取4個樣本，在濕潤狀態下采用非限制性靜態壓縮試驗測試彈性模量。用游標卡尺測量并記錄樣本的初始直徑和厚度，將其放置于金屬壓臺，連接力學試驗機，以0.05 mm/s位移速率進行壓縮，實時記錄測試樣本的載荷，計算相應的應力和應變，根據應力-應變曲線初始線性區域斜率得到樣本彈性模量。另取空白支架作為對照組。
1.6 統計學方法
采用SPSS16.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 細胞活性檢測
激光共聚焦顯微鏡觀察示，B組支架內綠色活細胞增殖旺盛，分布較均勻，排列緊密；A組細胞增殖較差，分布欠均勻，細胞多集中于支架邊緣，而中心區域失染。見圖 3。
2.2 掃描電鏡觀察
掃描電鏡觀察示，B組軟骨細胞在支架表面及內部均勻分布，支架孔隙被細胞及分泌的ECM填滿，細胞在支架上黏附、增殖、生長良好；而A組軟骨細胞明顯減少，且分布散亂，ECM分泌較少，未見融合成片。見圖 4。
2.3 生化成分分析
B組膠原蛋白、GAG及DNA含量分別為（675.85±27.93）μg/mg、（621.72±26.75）μg/mg、（16.98±3.23）μg/樣本，A組分別為（438.72±6.35）μg/mg、（301.63±30.51）μg/mg、（10.18±4.39）μg/樣本。B組各含量均明顯高于A組，比較差異均有統計學意義（t=18.512，P=0.000；t=17.640，P=0.000；t=2.790，P=0.024）。
2.4 力學性能測試
A、B組及對照組的彈性模量分別為（0.49±0.16）、（0.67±0.09）、（0.43±0.12）MPa，B組顯著高于A組和對照組，差異有統計學意義（P < 0.05）；A組和對照組間差異無統計學意義（P > 0.05）。
3 討論
雖然目前對力學刺激影響細胞發生反應的傳導機制尚不明確，但既往研究表明機械刺激在體內、外均對軟骨細胞的生長有重要調控作用[12]，對接種于載體的軟骨細胞給予一定力學負荷時，可促進細胞的合成代謝過程，從而提高ECM的分泌[13]。模擬關節軟骨細胞在體內的正常力學環境對體外構建組織工程軟骨有非常重要作用。本研究結果表明，周期性的動態壓縮應力刺激對兔關節軟骨細胞在脫細胞軟骨ECM源性三維多孔支架中的生長有明顯促進作用，與靜態培養相比，動態培養可維持細胞增殖，增加軟骨ECM的合成，促進組織工程軟骨組織的成熟。
三維支架系統如凝膠、海綿狀或纖維網狀等結構，可提供一種防止種子細胞去分化的環境[14]；然而三維立體培養雖可較好維持細胞表型，但靜態培養時由于支架材料空間內部的營養物質傳輸障礙，細胞增殖受限，組織塊中央出現細胞壞死的“空心”現象[15]，使組織工程構建受到了很大限制。本研究中靜態培養組也出現同樣結果，軟骨細胞在支架內的分布是表面多、中央少，可能與三維多孔支架結構表面所形成的黏滯阻力有關；而動態培養組的細胞在支架中分布較均勻，并保持良好活力。分析原因可能為細胞-支架復合物在生物反應器內所受的不僅是壓縮力，由于灌流狀態下培養液的交換，還可能受到低水平的流體剪切力等影響。這些力抵消或改變了支架表面的黏滯阻力，形成了局部復雜的力學生物學“微環境”，從而促進營養供應，刺激軟骨細胞在支架中的增殖和膠原、蛋白多糖等的合成。有研究發現，持續的循環載荷可增強軟骨細胞在支架內膠原蛋白啟動子的活性[16]；然而也有一些研究表明，機械負荷對軟骨細胞膠原的表達并無影響甚至有所降低[17-18]。這些相互矛盾的結果可能是與使用不同支架、細胞和力學刺激方案有關。
“功能性組織工程學”是上世紀末美國生物力學委員會提出的概念，并在組織工程學的基礎上逐漸發展起來，其重點強調了對組織工程組織的功能性進行評價。所有矯形外科組織工程的主要目的都是恢復其正常生物力學功能，構建功能性組織工程軟骨的目標是培養具有一定力學特性的組織，這些特性包括允許組織內間質液壓的形成、軟骨的應力松弛及蠕變特性、潤滑功能等[12, 19]。正常生理狀態下，關節軟骨承載不同機械負荷的能力依賴于其組織結構、生化成分和含水量。軟骨細胞合成的ECM包括GAG、膠原以及其他蛋白質與非蛋白質分子，它們是維持健康的功能性軟骨組織所必需條件。而且，生理性負荷通過包括壓縮、剪切、拉伸應變、靜水壓力、間質液流動、流動電位及對流性分子運輸等機械性電化學傳導介質影響軟骨細胞的新陳代謝活性和軟骨的組成、結構和功能[20]。本研究采用緩和的周期性壓力刺激軟骨細胞，頻率1 Hz相當于人行走時的膝關節受力頻率，結果顯示動態培養的細胞-支架復合物彈性模量顯著高于靜態培養及空白支架，表現出了良好的抗壓力學性能。
綜上述，體外模擬壓應力的三維動態培養可促進組織工程復合體的營養供應，并通過一定機械力學刺激增強其生化和生物力學特性。然而，本研究也存在一些局限性，未考慮種子細胞來源的物種、年齡，初始接種密度，不同彈性模量材料來源的支架，各種生長因子的添加及不同力學加載方案對細胞-支架復合物的綜合影響。下一步需探索最適合的組合方案，并結合動物體內實驗證明其轉化應用于臨床的可行性。
關節軟骨損傷后如未及時接受適當的治療，可能導致永久性退行性病變[1]。為了防止軟骨病變的發展，尤其對于年輕患者，在發病早期即進行軟骨表面修復具有重要意義。近年來，組織工程學和細胞生物學的發展為關節軟骨損傷的修復提供了新選擇，應用組織工程技術修復軟骨缺損已成為研究熱點。然而大量實驗及臨床研究顯示，其修復效果仍存在不足之處，主要表現為修復組織與天然軟骨形態和成分不同[2]以及力學性能的差異[3-4]。因此，如何增強組織工程軟骨的功能，提高軟骨缺損修復效果，減少修復組織退變，已成為軟骨組織工程和再生醫學領域的焦點問題。目前，生物反應器已應用于軟骨組織工程的研究，其不僅能提供組織培養的“微環境”，而且可以模擬關節軟骨在體內復雜的生物力學狀態，為組織工程軟骨的三維構建提供良好條件[5-6]。在既往研究中[7-9]，我們對天然關節軟骨進行脫細胞處理去除其抗原性，采用冷凍干燥法成功制備了以關節軟骨細胞外基質（extracellular matrix，ECM）為原料的三維多孔支架，其具有合適的孔徑和孔隙率及良好的生物相容性，可作為軟骨組織工程理想的支架載體。本實驗以軟骨細胞作為種子細胞，接種于脫細胞關節軟骨ECM源性三維多孔支架上，通過比較經生物反應器內周期性壓應力刺激的動態培養與普通靜態培養構建的組織工程軟骨差異，探討力學刺激促進組織工程軟骨內部基質分泌和營養物質傳遞的效應，以及對其力學特性的影響，為體外組織工程軟骨的三維構建提供優化方案。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要材料、試劑、儀器
健康成年新西蘭大白兔3只，雌雄不限，體重2.5～3.0 kg，由解放軍總醫院動物實驗中心提供，實驗方案經過解放軍總醫院動物實驗管理委員會批準。
關節軟骨ECM源性三維多孔支架由解放軍總醫院全軍骨科研究所提供（圖 1），孔徑（155±35）μm，孔隙率89%～93%，直徑6 mm，高8 mm，60Co輻照消毒后密封保存。H-DMEM/F12培養基、FBS、0.25%胰蛋白酶（GIBCO公司，美國）；L-脯氨酸、抗壞血酸、胰島素、抑肽酶、Ⅱ型膠原酶、Hoechst 33258染色劑、二乙酸熒光素（fluorescein diacetate，FDA）、活-死細胞染色試劑盒（Sigma公司，美國）；非必需氨基酸（HyClone公司，美國）；羥脯氨酸試劑盒（南京建成生物工程研究所）。
圖1
關節軟骨ECM源性三維多孔支架外觀??圖 2第2代兔軟骨細胞培養1周（倒置相差顯微鏡× 200）??圖 3兩組細胞-支架復合物培養3周激光共聚焦顯微鏡觀察（× 20）? A組?B組??圖 4兩組細胞-支架復合物培養3周掃描電鏡觀察（× 500）? A組? B組
Figure1.
Macroscopic view of three-dimensional porous articular cartilage ECM scaffolds ??Fig. 2 Microscopic view of passage 2 rabbits' chondrocytes after 1 week of culturing (Inverted phase contrast microscopy×200) ??Fig. 3 Laser scanning confocal microscopy observation of cell-scaffold constructs of 2 groups after 3 weeks of culturing (× 20) ?Group A ?Group B ??Fig. 4 Scanning electron microscopy observation of cell-scaffold constructs of 2 groups after 3 weeks of culturing (× 500) ?Group A ?Group B
IX70倒置相差顯微鏡、BX-51激光共聚焦顯微鏡、DP70圖像采集系統（Olympus公司，日本）；BCPCAS4800掃描電鏡（Hitachi公司，日本）；L/S? 07523-90蠕動泵（Masterflex公司，美國）；BioDynamicTM生物反應器、Electro Force? 3220力學試驗機（Bose公司，美國）；DU-640紫外分光光度計（Beckman Coulter公司，美國）；M530游標卡尺（Mitutoyo公司，日本）。
1.2 軟骨細胞分離及培養
取3只新西蘭大白兔耳緣靜脈注射空氣栓塞處死，無菌條件下切取四肢關節表面軟骨，用D-Hank液沖洗多次，剪成1 mm×1 mm×1 mm大小顆粒，加入10倍體積的0.2%Ⅱ型膠原酶，37℃消化6 h，200目金屬網過濾，以離心半徑8 cm、1 700 r/min離心10 min，棄上清；D-Hank液洗滌細胞團，同上法離心，加入完全培養基（含10%FBS的H-DMEM培養基），制成細胞懸液，調整細胞密度為5×105個/mL，接種于50 cm2培養瓶中，于37℃、5%CO2及95%濕度培養箱中培養，隔天更換培養液，倒置相差顯微鏡下觀察兔軟骨細胞呈三角形或多角形，折光性好。原代細胞融合約90%時，以0.25%胰蛋白酶消化傳代擴增，取第2代軟骨細胞用于實驗（圖 2）。
1.3 細胞-支架復合物制備
取關節軟骨ECM源性三維多孔支架，于完全培養基中浸泡2 h，取出后用消毒吸水紙將水分盡量吸干，置入6孔板中備用。收集第2代兔關節軟骨細胞，以離心半徑8 cm、1 500 r/min離心5 min，將細胞制成密度為2×107個/mL的細胞懸液，每個支架接種1 mL細胞懸液，待完全吸附濕潤后放入37℃、5%CO2及95%濕度培養箱中，孵育2 h后取出放入培養瓶中，緩慢添加含10%FBS、50 μg/mL抗壞血酸、40 μg/mL脯氨酸、非必需氨基酸和500 U/mL抑肽酶的DMEM培養液，進行靜態預培養5 d。
1.4 實驗分組及培養方法
預培養5 d后將細胞-支架復合物隨機分為2組，均采用軟骨培養液（含10%FBS、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM/F12培養基）。A組繼續靜態培養3周，每周換液3次。B組采用模擬壓應力三維動態培養：將細胞-支架復合物置于生物反應器培養倉內，按設定條件行力學加載培養。為模擬人日常活動狀態，加壓條件為[10-11]：15%壓縮應變、頻率1 Hz；每天加載2次，每次1 h，間隔8 h，連續加載3周。蠕動泵驅動培養液循環，流速為3 mL/min。整個加載過程在37℃、95%濕度環境中進行；力學加載裝置在使用前對其零件均進行高溫高壓、60Co輻照等滅菌處理。培養3周后取出兩組樣本，進行以下檢測。
1.5 檢測指標
1.5.1 細胞活性檢測
采用活-死細胞染色試劑盒檢測細胞活性。兩組樣本棄培養基，經PBS清洗后，切取中央部分薄片（厚度1 mm），避光、20℃環境下，FDA（5×10-3 mg/mL）工作液反應5 min。棄去反應后液體，PBS清洗2次，激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞活性。
1.5.2 掃描電鏡觀察
兩組樣本PBS清洗后，2.5%戊二醛4℃恒溫下固定24 h，取出PBS清洗20 min×2次，1%四氧化鋨酸后固定2 h，PBS清洗，95%乙醇脫水過夜后，室溫干燥48 h，上機噴金，掃描電鏡觀察細胞在支架上的形態和分布。
1.5.3 生化成分分析
①糖胺聚糖（glycosaminog-lycan，GAG）含量測定：采用二甲基亞甲藍比色法，兩組各取4個樣本，凍干后稱重，加入木瓜蛋白酶裂解液，65℃裂解48 h，以離心半徑8 cm、1 500 r/min離心5 min。取裂解液100 μL加入3 mL二甲基亞甲藍，于紫外分光光度計480 nm波長下檢測吸光度（A）值，根據標準品濃度作標準曲線，計算GAG含量。②膠原蛋白含量測定：根據羥脯氨酸試劑盒說明，用紫外分光光度計測定樣本中羥脯氨酸含量后，換算成膠原蛋白含量。吸取①中制備的兩組木瓜蛋白酶裂解液0.5 mL，加試劑盒水解液1 mL水解20 min；調整pH值至6.0～6.8，加蒸餾水至10 mL，混勻；加適量活性炭，以離心半徑8 cm、3 500 r/min離心10 min，取1 mL上清加入5 μg/mL標準液1 mL，混勻，60℃水浴15 min；冷卻后以離心半徑8 cm、3 500 r/min離心10 min，取上清加入石英杯內，于紫外分光光度計550 nm波長處比色，蒸餾水調零，測各管A值，計算膠原蛋白含量。③ DNA含量檢測：以小牛胸腺DNA含量作為標準，兩組各取4個樣本，用熒光染料Hoechst 33258標記后，采用熒光測定法（激發波長355 nm，發射波長450 nm）分析DNA含量。
1.5.4 力學性能測試
兩組各取4個樣本，在濕潤狀態下采用非限制性靜態壓縮試驗測試彈性模量。用游標卡尺測量并記錄樣本的初始直徑和厚度，將其放置于金屬壓臺，連接力學試驗機，以0.05 mm/s位移速率進行壓縮，實時記錄測試樣本的載荷，計算相應的應力和應變，根據應力-應變曲線初始線性區域斜率得到樣本彈性模量。另取空白支架作為對照組。
1.6 統計學方法
采用SPSS16.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 細胞活性檢測
激光共聚焦顯微鏡觀察示，B組支架內綠色活細胞增殖旺盛，分布較均勻，排列緊密；A組細胞增殖較差，分布欠均勻，細胞多集中于支架邊緣，而中心區域失染。見圖 3。
2.2 掃描電鏡觀察
掃描電鏡觀察示，B組軟骨細胞在支架表面及內部均勻分布，支架孔隙被細胞及分泌的ECM填滿，細胞在支架上黏附、增殖、生長良好；而A組軟骨細胞明顯減少，且分布散亂，ECM分泌較少，未見融合成片。見圖 4。
2.3 生化成分分析
B組膠原蛋白、GAG及DNA含量分別為（675.85±27.93）μg/mg、（621.72±26.75）μg/mg、（16.98±3.23）μg/樣本，A組分別為（438.72±6.35）μg/mg、（301.63±30.51）μg/mg、（10.18±4.39）μg/樣本。B組各含量均明顯高于A組，比較差異均有統計學意義（t=18.512，P=0.000；t=17.640，P=0.000；t=2.790，P=0.024）。
2.4 力學性能測試
A、B組及對照組的彈性模量分別為（0.49±0.16）、（0.67±0.09）、（0.43±0.12）MPa，B組顯著高于A組和對照組，差異有統計學意義（P < 0.05）；A組和對照組間差異無統計學意義（P > 0.05）。
3 討論
雖然目前對力學刺激影響細胞發生反應的傳導機制尚不明確，但既往研究表明機械刺激在體內、外均對軟骨細胞的生長有重要調控作用[12]，對接種于載體的軟骨細胞給予一定力學負荷時，可促進細胞的合成代謝過程，從而提高ECM的分泌[13]。模擬關節軟骨細胞在體內的正常力學環境對體外構建組織工程軟骨有非常重要作用。本研究結果表明，周期性的動態壓縮應力刺激對兔關節軟骨細胞在脫細胞軟骨ECM源性三維多孔支架中的生長有明顯促進作用，與靜態培養相比，動態培養可維持細胞增殖，增加軟骨ECM的合成，促進組織工程軟骨組織的成熟。
三維支架系統如凝膠、海綿狀或纖維網狀等結構，可提供一種防止種子細胞去分化的環境[14]；然而三維立體培養雖可較好維持細胞表型，但靜態培養時由于支架材料空間內部的營養物質傳輸障礙，細胞增殖受限，組織塊中央出現細胞壞死的“空心”現象[15]，使組織工程構建受到了很大限制。本研究中靜態培養組也出現同樣結果，軟骨細胞在支架內的分布是表面多、中央少，可能與三維多孔支架結構表面所形成的黏滯阻力有關；而動態培養組的細胞在支架中分布較均勻，并保持良好活力。分析原因可能為細胞-支架復合物在生物反應器內所受的不僅是壓縮力，由于灌流狀態下培養液的交換，還可能受到低水平的流體剪切力等影響。這些力抵消或改變了支架表面的黏滯阻力，形成了局部復雜的力學生物學“微環境”，從而促進營養供應，刺激軟骨細胞在支架中的增殖和膠原、蛋白多糖等的合成。有研究發現，持續的循環載荷可增強軟骨細胞在支架內膠原蛋白啟動子的活性[16]；然而也有一些研究表明，機械負荷對軟骨細胞膠原的表達并無影響甚至有所降低[17-18]。這些相互矛盾的結果可能是與使用不同支架、細胞和力學刺激方案有關。
“功能性組織工程學”是上世紀末美國生物力學委員會提出的概念，并在組織工程學的基礎上逐漸發展起來，其重點強調了對組織工程組織的功能性進行評價。所有矯形外科組織工程的主要目的都是恢復其正常生物力學功能，構建功能性組織工程軟骨的目標是培養具有一定力學特性的組織，這些特性包括允許組織內間質液壓的形成、軟骨的應力松弛及蠕變特性、潤滑功能等[12, 19]。正常生理狀態下，關節軟骨承載不同機械負荷的能力依賴于其組織結構、生化成分和含水量。軟骨細胞合成的ECM包括GAG、膠原以及其他蛋白質與非蛋白質分子，它們是維持健康的功能性軟骨組織所必需條件。而且，生理性負荷通過包括壓縮、剪切、拉伸應變、靜水壓力、間質液流動、流動電位及對流性分子運輸等機械性電化學傳導介質影響軟骨細胞的新陳代謝活性和軟骨的組成、結構和功能[20]。本研究采用緩和的周期性壓力刺激軟骨細胞，頻率1 Hz相當于人行走時的膝關節受力頻率，結果顯示動態培養的細胞-支架復合物彈性模量顯著高于靜態培養及空白支架，表現出了良好的抗壓力學性能。
綜上述，體外模擬壓應力的三維動態培養可促進組織工程復合體的營養供應，并通過一定機械力學刺激增強其生化和生物力學特性。然而，本研究也存在一些局限性，未考慮種子細胞來源的物種、年齡，初始接種密度，不同彈性模量材料來源的支架，各種生長因子的添加及不同力學加載方案對細胞-支架復合物的綜合影響。下一步需探索最適合的組合方案，并結合動物體內實驗證明其轉化應用于臨床的可行性。
