引用本文： 曹玫, 張劍波, 葉尚勉, 李浩, 趙建. 妊娠早期人臍帶血管周圍細胞的分離培養及定向分化胰島樣細胞的研究. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(9): 1156-1160. doi: 10.7507/1002-1892.20140250 復制
糖尿病是因體內胰島素作用紊亂，如胰島素分泌不足或胰島素作用缺陷等所致的一種以慢性高血糖為主要表現的臨床綜合征，常伴心血管疾病等并發癥，近年其發病率呈上升趨勢，已成為人類重大疾病之一。目前，胰腺移植、胰島移植和干細胞治療等新型治療手段逐漸成為研究熱點。人胚胎干細胞是一種全能干細胞，但其應用涉及倫理、道德、法律等問題。有研究從胎盤臍帶血管壁周圍分離出一種間質細胞類的干細胞，即人臍帶血管周圍細胞（human umbilical cord perivascular cells，HUCPVC），該細胞可自身增殖，并分化成間質細胞系，還可分化為成骨細胞、成軟骨細胞、心肌細胞、神經元等，但無形成擬胚體的能力，不完全具有胚胎干細胞特點[1-2]。本研究擬從妊娠一期（8～12周）臍帶組織中分離純化出妊娠早期HUCPVC，研究其增殖能力、體外培養中形成擬胚體能力和表達特有分子標志情況等，并將其定向分化為胰島樣細胞，旨在為糖尿病細胞治療探索新的細胞來源提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
DMEM培養基、DMEM/F12培養基、FBS、谷氨酰胺、青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶、EDTA、胰島素鐵硒傳遞蛋白（GIBCO公司，美國）；α-MEM培養基（Sigma公司，美國）；纖連蛋白（Roche公司，德國）；鼠抗人階段特異性胚胎抗原1（stage-specific embryonic antigen 1，SSEA-1）、SSEA-3、SSEA-4、OCT-4、TRA-1-60和TRA-1-81多克隆抗體（Millipore公司，美國）；鼠抗人巢蛋白（Nestin）抗體、甲胎蛋白（α-fetoprotein，AFP）抗體、平滑肌肌動蛋白（smooth muscle actin，SMA）抗體、胰島素抗體、辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG抗體（北京中杉金橋生物技術有限公司）。低黏附培養板（Corning公司，美國）；腔室載玻片（Nunc公司，美國）；Scientific MSC二級生物安全柜、CO2培養箱（Thermo公司，美國）；光鏡、倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）。
1.2 妊娠早期HUCPVC分離培養及細胞表面標志物檢測
1.2.1 細胞分離培養
經自然流產或治療妊娠中斷患者自愿捐贈并書面授權，四川省醫學科學院·四川省人民醫院醫學倫理委員會批準，從醫源廢棄物妊娠一期（8～12周）臍帶組織中分離HUCPVC。于超凈工作臺中取出臍帶，生理鹽水洗滌2～3次，去除殘留血液、表皮和血管，將臍帶組織剪成約1 mm×1 mm×1 mm的組織塊。將組織塊接種于75 cm2培養瓶中，加入含10%FBS的α-MEM培養基，于37℃、5%CO2培養箱中培養[3-4]。倒置相差顯微鏡下觀察，待有細胞從組織中爬出貼壁后去掉組織塊，每2～3天更換培養基。當單層貼壁細胞匯合達80%以上時，生理鹽水洗滌，用0.05%胰蛋白酶-0.01%EDTA消化后收集細胞，室溫下以800×g離心4 min，棄上清，用適量上述培養基重懸細胞，以1：2比例進行傳代培養（第1階段），每2～3天換液，記錄傳代代數并觀察細胞分化情況。
1.2.2 細胞表面標志物檢測
取第5代妊娠早期HUCPVC，按2×104個/mL密度接種于腔室載玻片培養。3 d后取出晾干，— 20℃丙酮固定10 min，PBS洗滌3次；然后于3%H2O2中室溫孵育10 min，PBS洗滌3次；羊血清封閉液室溫封閉20 min，傾去封閉液。滴加一抗鼠抗人SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、OCT-4、TRA-1-60和TRA-1-81多克隆抗體（均為1：200），置于濕盒中，4℃過夜，取出后PBS洗滌3次；滴加辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG抗體（1：1 000），室溫孵育60 min，PBS洗滌3次。DAB顯色5 min，清水沖洗，蘇木精復染1 min，脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。
1.3 妊娠早期HUCPVC擬胚體體外誘導培養及擬胚體特異標志物檢測
將第5代妊娠早期HUCPVC置于含10%FBS的α-MEM培養基培養3～6 d，然后用0.05%胰蛋白酶-0.01% EDTA消化，終止消化后用吸管將細胞輕輕吹打，移入離心管，室溫下以800×g離心4 min。去上清后用擬胚體誘導培養基（80% KnockOut DMEM培養基、20%FBS、1 mmol/L L-谷氨酰胺、0.1 mol/L β-巰基乙醇、1%非必須氨基酸）將細胞稀釋成濃度為1×107個/mL的細胞懸液，以1×107個/孔接種于低黏附6孔板中，懸浮培養細胞，隔天換液1次，培養6～7 d（第2階段），倒置相差顯微鏡觀察細胞形態及聚集狀態變化。
將培養6～7 d聚集成團的細胞接種于腔室載玻片培養1 d后，按1.2.2方法固定細胞，PBS洗滌3次，滴加正常山羊血清封閉液后放入濕盒中，室溫下靜置20 min；去除封閉血清，滴加一抗鼠抗人AFP、Nestin、SMA多克隆抗體（均為1：200），充分覆蓋細胞，置于濕盒中4℃過夜；取出后37℃復溫45 min，PBS洗滌3次；滴加辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG抗體（1：1 000），室溫孵育60 min，PBS洗滌3次；DAB顯色，PBS沖洗；蘇木精復染1 min，脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。
1.4 妊娠早期HUCPVC定向分化胰島樣細胞及鑒定
將第2階段培養的細胞轉移至含1%胰島素鐵硒傳遞蛋白、1 mmol/L谷氨酰胺、5 μg/mL纖連蛋白的1：1 DMEM/F12培養基中繼續培養6～7 d（第3階段）；然后轉移至含10 ng/mL bFGF的1：1 DMEM/F12培養基培養6～7 d（第4階段），再于含10 mmol/L煙酰胺的1：1 DMEM/F12培養基繼續培養5 d[5-6]（第5階段）。倒置相差顯微鏡觀察細胞形態，并進行以下檢測：①免疫組織化學法分析細胞胰島素表達情況：參照1.2.2方法固定定向分化細胞，PBS洗滌3次，滴加正常山羊血清封閉液后放入濕盒中，室溫下靜置20 min；去除封閉血清，滴加一抗鼠抗人胰島素抗體（1：200），充分覆蓋細胞，置于濕盒中4℃過夜；取出后37℃復溫45 min，PBS洗滌3次；滴加辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG抗體（1：1 000），室溫孵育60 min，PBS洗滌3次；DAB顯色，PBS沖洗；蘇木精復染1 min，脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。②葡萄糖刺激胰島素分泌實驗：將定向分化細胞接種于普通6孔培養板，37℃貼壁過夜，用無葡萄糖的RPMI 1640培養基洗滌，然后分別用5 mmol/L和25 mmol/L的葡萄糖溶液依次孵育3 h 30 min，分別收集上清液進行胰島素水平檢測。
1.5 統計學方法
采用SPSS14.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 妊娠早期HUCPVC形態學觀察及細胞標志物檢測
倒置相差顯微鏡觀察示，組織塊接種后約1周，可見短梭形、多角形貼壁細胞從組織塊中爬出，散落分布于組織塊周圍。約2周后細胞逐漸生長為形態相對均一的長梭形、扁平狀成纖維細胞樣，核仁明顯，折光性好，細胞呈平行排列或漩渦狀生長，單層貼壁細胞匯合度達90%；胰蛋白酶消化傳代后，細胞擴增速度加快，生長狀態良好，5～7 d再次傳代，細胞形態較為單一。可連續傳代10代以上，細胞形態無明顯變化，細胞生長狀態和傳代較穩定。見圖 1。
圖1
妊娠早期HUCPVC形態學觀察（倒置相差顯微鏡× 100）?第2代?第15代??圖 2第5代妊娠早期HUCPVC細胞標志物檢測（× 200）?SSEA-1 ?SSEA-3 ?SSEA-4 ?OCT-4 ?TRA-1-60 ?TRA-1-81 ??圖 3妊娠早期HUCPVC擬胚體體外誘導培養7 d觀察（× 200）?倒置相差顯微鏡下形態學觀察?AFP陽性表達?Nestin陽性表達?SMA陽性表達??圖 4妊娠早期HUCPVC定向分化胰島樣細胞觀察（× 100）?倒置相差顯微鏡下胰島樣細胞結構形態?免疫組織化學染色示胰島樣細胞結構中胰島素強陽性表達
Figure1.
Morphological observation of first trimester HUCPVC (Inverted phase contrast microscope×100) ?The 2nd generation cultured cells ?The 15th generation cultured cells ??Fig. 2 The expressions of the surface markers in cultured first trimester HUCPVC in the 5th generation (× 200) ?SSEA-1 ?SSEA-3 ?SSEA-4 ?OCT-4 ?TRA-1-60 ?TRA-1-81 ??Fig. 3 Observation of EB-like cell aggregations cultured for 7 days in vitro (× 200) ?Morphological observation by inverted phase contrast microscope ?AFP positive expression ?Nestin positive expression ?SMA positive expression ??Fig. 4 Islet-like cell clusters from the first trimester HUCPVC (× 100) ?Morphology of the islet-like cell clusters by inverted phase contrast microscope ?Insulin positive expression in the islet-like cell clusters
細胞免疫化學檢測顯示，細胞均表達干細胞標志物SSEA-3、SSEA-4、OCT-4、TRA-1-60和TRA-1-81（圖 2）。
2.2 妊娠早期HUCPVC擬胚體體外誘導觀察及擬胚體特異標志物檢測
誘導培養6～7 d倒置相差顯微鏡觀察示，懸浮培養的細胞逐漸聚集，形成較為規則的球狀細胞團，呈三維立體結構，逐漸長大并發育為囊實性結構，具有外層上皮和中心空腔，空腔部位透光性好，形成表面有膜包被的、中空、分層且具有規則球狀形態的擬胚體。擬胚體特異標志物檢測示，誘導培養6～7 d的細胞AFP、Nestin、SMA均呈陽性表達。見圖 3。
2.3 妊娠早期HUCPVC定向分化胰島樣細胞及鑒定
倒置相差顯微鏡下觀察示，培養基中經加入相關促分化因子，妊娠早期HUCPVC形態發生明顯變化，形成獨立于周圍細胞的細胞團結構；免疫細胞化學染色示該細胞團強陽性表達胰島素，周圍細胞胰島素表達陰性（圖 4）。葡萄糖刺激胰島素分泌實驗結果顯示，分化的細胞在高糖培養基中的胰島素含量為（23.2±5.3）mU/L，明顯高于低糖培養基中的含量（7.0±0.5）mU/L，差異有統計學意義（t=7.444，P=0.002）。
3 討論
糖尿病晚期患者采用胰島素治療雖在一定程度上能改善糖代謝紊亂，但長期胰島素注射不僅給患者帶來不便，而且不能有效防止或逆轉糖尿病引起的微血管病變及其并發癥。目前針對糖尿病治療的研究靶點有胰島素、胰高血糖素樣肽1、新型葡萄糖-鈉協同轉運蛋白2[7]、二肽基肽酶Ⅳ、過氧化物酶體增殖活化受體[8]等。隨著對各種靶點的深入研究、針對靶點的成熟藥物研發和聯合使用等，糖尿病藥物的副作用也越來越受到重視。胰腺、胰島及胰島細胞移植手術能糾正糖代謝紊亂，但仍存在手術復雜、風險高，來源有限、免疫排斥和遠期療效不理想等問題[9-10]。
從妊娠早期胚胎血液、肝臟及骨髓中分離的MSCs表達多能干細胞分子標志物，與成體干細胞相比，其端粒酶活性、增殖能力均更強[11-14]。Sarugaser等[15]、Can等[16]認為從分娩后的臍帶中分離出的HUCPVC是MSCs新來源。臍帶在胎兒發育早期，約妊娠28 d時已形成，所以妊娠早期HUCPVC應該更接近胚胎干細胞的特性。
本研究使用早期流產組織的HUCPVC向胰島細胞定向分化，不涉及倫理道德問題。通過將妊娠一期（8～12周）臍帶組織置于含10%FBS的α-MEM培養基中培養，成功分離獲得HUCPVC，并可穩定連續傳代10代以上，分離純化的細胞表達干細胞標志物SSEA-3、SSEA-4、OCT-4、TRA-1-60和TRA-1-81，表明獲得的細胞為MSCs，是具有巨大分化潛能的細胞。盡管妊娠早期HUCPVC是一類具有外膜細胞特性的MSCs[3]，但其能夠在不添加白血病抑制因子的完全培養基條件下，在低黏附培養板上生長增殖，并具有形成擬胚體的能力，表達特異性標志蛋白[4]。本研究結果顯示，通過誘導分化，妊娠早期HUCPVC可形成表面有膜包被的、中空、分層且具有規則球形的擬胚體，并且內胚層細胞特異性標志物AFP、外胚層細胞特異性標志物Nestin和中胚層細胞特異性標志物SMA表達均呈陽性；將妊娠早期HUCPVC定向分化為胰島樣細胞后，具有分泌胰島素的功能，并且胰島素分泌受葡萄糖濃度調節。本研究結果為HUCPVC來源的胰島樣細胞移植提供了理論依據。
糖尿病是因體內胰島素作用紊亂，如胰島素分泌不足或胰島素作用缺陷等所致的一種以慢性高血糖為主要表現的臨床綜合征，常伴心血管疾病等并發癥，近年其發病率呈上升趨勢，已成為人類重大疾病之一。目前，胰腺移植、胰島移植和干細胞治療等新型治療手段逐漸成為研究熱點。人胚胎干細胞是一種全能干細胞，但其應用涉及倫理、道德、法律等問題。有研究從胎盤臍帶血管壁周圍分離出一種間質細胞類的干細胞，即人臍帶血管周圍細胞（human umbilical cord perivascular cells，HUCPVC），該細胞可自身增殖，并分化成間質細胞系，還可分化為成骨細胞、成軟骨細胞、心肌細胞、神經元等，但無形成擬胚體的能力，不完全具有胚胎干細胞特點[1-2]。本研究擬從妊娠一期（8～12周）臍帶組織中分離純化出妊娠早期HUCPVC，研究其增殖能力、體外培養中形成擬胚體能力和表達特有分子標志情況等，并將其定向分化為胰島樣細胞，旨在為糖尿病細胞治療探索新的細胞來源提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
DMEM培養基、DMEM/F12培養基、FBS、谷氨酰胺、青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶、EDTA、胰島素鐵硒傳遞蛋白（GIBCO公司，美國）；α-MEM培養基（Sigma公司，美國）；纖連蛋白（Roche公司，德國）；鼠抗人階段特異性胚胎抗原1（stage-specific embryonic antigen 1，SSEA-1）、SSEA-3、SSEA-4、OCT-4、TRA-1-60和TRA-1-81多克隆抗體（Millipore公司，美國）；鼠抗人巢蛋白（Nestin）抗體、甲胎蛋白（α-fetoprotein，AFP）抗體、平滑肌肌動蛋白（smooth muscle actin，SMA）抗體、胰島素抗體、辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG抗體（北京中杉金橋生物技術有限公司）。低黏附培養板（Corning公司，美國）；腔室載玻片（Nunc公司，美國）；Scientific MSC二級生物安全柜、CO2培養箱（Thermo公司，美國）；光鏡、倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）。
1.2 妊娠早期HUCPVC分離培養及細胞表面標志物檢測
1.2.1 細胞分離培養
經自然流產或治療妊娠中斷患者自愿捐贈并書面授權，四川省醫學科學院·四川省人民醫院醫學倫理委員會批準，從醫源廢棄物妊娠一期（8～12周）臍帶組織中分離HUCPVC。于超凈工作臺中取出臍帶，生理鹽水洗滌2～3次，去除殘留血液、表皮和血管，將臍帶組織剪成約1 mm×1 mm×1 mm的組織塊。將組織塊接種于75 cm2培養瓶中，加入含10%FBS的α-MEM培養基，于37℃、5%CO2培養箱中培養[3-4]。倒置相差顯微鏡下觀察，待有細胞從組織中爬出貼壁后去掉組織塊，每2～3天更換培養基。當單層貼壁細胞匯合達80%以上時，生理鹽水洗滌，用0.05%胰蛋白酶-0.01%EDTA消化后收集細胞，室溫下以800×g離心4 min，棄上清，用適量上述培養基重懸細胞，以1：2比例進行傳代培養（第1階段），每2～3天換液，記錄傳代代數并觀察細胞分化情況。
1.2.2 細胞表面標志物檢測
取第5代妊娠早期HUCPVC，按2×104個/mL密度接種于腔室載玻片培養。3 d后取出晾干，— 20℃丙酮固定10 min，PBS洗滌3次；然后于3%H2O2中室溫孵育10 min，PBS洗滌3次；羊血清封閉液室溫封閉20 min，傾去封閉液。滴加一抗鼠抗人SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、OCT-4、TRA-1-60和TRA-1-81多克隆抗體（均為1：200），置于濕盒中，4℃過夜，取出后PBS洗滌3次；滴加辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG抗體（1：1 000），室溫孵育60 min，PBS洗滌3次。DAB顯色5 min，清水沖洗，蘇木精復染1 min，脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。
1.3 妊娠早期HUCPVC擬胚體體外誘導培養及擬胚體特異標志物檢測
將第5代妊娠早期HUCPVC置于含10%FBS的α-MEM培養基培養3～6 d，然后用0.05%胰蛋白酶-0.01% EDTA消化，終止消化后用吸管將細胞輕輕吹打，移入離心管，室溫下以800×g離心4 min。去上清后用擬胚體誘導培養基（80% KnockOut DMEM培養基、20%FBS、1 mmol/L L-谷氨酰胺、0.1 mol/L β-巰基乙醇、1%非必須氨基酸）將細胞稀釋成濃度為1×107個/mL的細胞懸液，以1×107個/孔接種于低黏附6孔板中，懸浮培養細胞，隔天換液1次，培養6～7 d（第2階段），倒置相差顯微鏡觀察細胞形態及聚集狀態變化。
將培養6～7 d聚集成團的細胞接種于腔室載玻片培養1 d后，按1.2.2方法固定細胞，PBS洗滌3次，滴加正常山羊血清封閉液后放入濕盒中，室溫下靜置20 min；去除封閉血清，滴加一抗鼠抗人AFP、Nestin、SMA多克隆抗體（均為1：200），充分覆蓋細胞，置于濕盒中4℃過夜；取出后37℃復溫45 min，PBS洗滌3次；滴加辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG抗體（1：1 000），室溫孵育60 min，PBS洗滌3次；DAB顯色，PBS沖洗；蘇木精復染1 min，脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。
1.4 妊娠早期HUCPVC定向分化胰島樣細胞及鑒定
將第2階段培養的細胞轉移至含1%胰島素鐵硒傳遞蛋白、1 mmol/L谷氨酰胺、5 μg/mL纖連蛋白的1：1 DMEM/F12培養基中繼續培養6～7 d（第3階段）；然后轉移至含10 ng/mL bFGF的1：1 DMEM/F12培養基培養6～7 d（第4階段），再于含10 mmol/L煙酰胺的1：1 DMEM/F12培養基繼續培養5 d[5-6]（第5階段）。倒置相差顯微鏡觀察細胞形態，并進行以下檢測：①免疫組織化學法分析細胞胰島素表達情況：參照1.2.2方法固定定向分化細胞，PBS洗滌3次，滴加正常山羊血清封閉液后放入濕盒中，室溫下靜置20 min；去除封閉血清，滴加一抗鼠抗人胰島素抗體（1：200），充分覆蓋細胞，置于濕盒中4℃過夜；取出后37℃復溫45 min，PBS洗滌3次；滴加辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG抗體（1：1 000），室溫孵育60 min，PBS洗滌3次；DAB顯色，PBS沖洗；蘇木精復染1 min，脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。②葡萄糖刺激胰島素分泌實驗：將定向分化細胞接種于普通6孔培養板，37℃貼壁過夜，用無葡萄糖的RPMI 1640培養基洗滌，然后分別用5 mmol/L和25 mmol/L的葡萄糖溶液依次孵育3 h 30 min，分別收集上清液進行胰島素水平檢測。
1.5 統計學方法
采用SPSS14.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 妊娠早期HUCPVC形態學觀察及細胞標志物檢測
倒置相差顯微鏡觀察示，組織塊接種后約1周，可見短梭形、多角形貼壁細胞從組織塊中爬出，散落分布于組織塊周圍。約2周后細胞逐漸生長為形態相對均一的長梭形、扁平狀成纖維細胞樣，核仁明顯，折光性好，細胞呈平行排列或漩渦狀生長，單層貼壁細胞匯合度達90%；胰蛋白酶消化傳代后，細胞擴增速度加快，生長狀態良好，5～7 d再次傳代，細胞形態較為單一。可連續傳代10代以上，細胞形態無明顯變化，細胞生長狀態和傳代較穩定。見圖 1。
圖1
妊娠早期HUCPVC形態學觀察（倒置相差顯微鏡× 100）?第2代?第15代??圖 2第5代妊娠早期HUCPVC細胞標志物檢測（× 200）?SSEA-1 ?SSEA-3 ?SSEA-4 ?OCT-4 ?TRA-1-60 ?TRA-1-81 ??圖 3妊娠早期HUCPVC擬胚體體外誘導培養7 d觀察（× 200）?倒置相差顯微鏡下形態學觀察?AFP陽性表達?Nestin陽性表達?SMA陽性表達??圖 4妊娠早期HUCPVC定向分化胰島樣細胞觀察（× 100）?倒置相差顯微鏡下胰島樣細胞結構形態?免疫組織化學染色示胰島樣細胞結構中胰島素強陽性表達
Figure1.
Morphological observation of first trimester HUCPVC (Inverted phase contrast microscope×100) ?The 2nd generation cultured cells ?The 15th generation cultured cells ??Fig. 2 The expressions of the surface markers in cultured first trimester HUCPVC in the 5th generation (× 200) ?SSEA-1 ?SSEA-3 ?SSEA-4 ?OCT-4 ?TRA-1-60 ?TRA-1-81 ??Fig. 3 Observation of EB-like cell aggregations cultured for 7 days in vitro (× 200) ?Morphological observation by inverted phase contrast microscope ?AFP positive expression ?Nestin positive expression ?SMA positive expression ??Fig. 4 Islet-like cell clusters from the first trimester HUCPVC (× 100) ?Morphology of the islet-like cell clusters by inverted phase contrast microscope ?Insulin positive expression in the islet-like cell clusters
細胞免疫化學檢測顯示，細胞均表達干細胞標志物SSEA-3、SSEA-4、OCT-4、TRA-1-60和TRA-1-81（圖 2）。
2.2 妊娠早期HUCPVC擬胚體體外誘導觀察及擬胚體特異標志物檢測
誘導培養6～7 d倒置相差顯微鏡觀察示，懸浮培養的細胞逐漸聚集，形成較為規則的球狀細胞團，呈三維立體結構，逐漸長大并發育為囊實性結構，具有外層上皮和中心空腔，空腔部位透光性好，形成表面有膜包被的、中空、分層且具有規則球狀形態的擬胚體。擬胚體特異標志物檢測示，誘導培養6～7 d的細胞AFP、Nestin、SMA均呈陽性表達。見圖 3。
2.3 妊娠早期HUCPVC定向分化胰島樣細胞及鑒定
倒置相差顯微鏡下觀察示，培養基中經加入相關促分化因子，妊娠早期HUCPVC形態發生明顯變化，形成獨立于周圍細胞的細胞團結構；免疫細胞化學染色示該細胞團強陽性表達胰島素，周圍細胞胰島素表達陰性（圖 4）。葡萄糖刺激胰島素分泌實驗結果顯示，分化的細胞在高糖培養基中的胰島素含量為（23.2±5.3）mU/L，明顯高于低糖培養基中的含量（7.0±0.5）mU/L，差異有統計學意義（t=7.444，P=0.002）。
3 討論
糖尿病晚期患者采用胰島素治療雖在一定程度上能改善糖代謝紊亂，但長期胰島素注射不僅給患者帶來不便，而且不能有效防止或逆轉糖尿病引起的微血管病變及其并發癥。目前針對糖尿病治療的研究靶點有胰島素、胰高血糖素樣肽1、新型葡萄糖-鈉協同轉運蛋白2[7]、二肽基肽酶Ⅳ、過氧化物酶體增殖活化受體[8]等。隨著對各種靶點的深入研究、針對靶點的成熟藥物研發和聯合使用等，糖尿病藥物的副作用也越來越受到重視。胰腺、胰島及胰島細胞移植手術能糾正糖代謝紊亂，但仍存在手術復雜、風險高，來源有限、免疫排斥和遠期療效不理想等問題[9-10]。
從妊娠早期胚胎血液、肝臟及骨髓中分離的MSCs表達多能干細胞分子標志物，與成體干細胞相比，其端粒酶活性、增殖能力均更強[11-14]。Sarugaser等[15]、Can等[16]認為從分娩后的臍帶中分離出的HUCPVC是MSCs新來源。臍帶在胎兒發育早期，約妊娠28 d時已形成，所以妊娠早期HUCPVC應該更接近胚胎干細胞的特性。
本研究使用早期流產組織的HUCPVC向胰島細胞定向分化，不涉及倫理道德問題。通過將妊娠一期（8～12周）臍帶組織置于含10%FBS的α-MEM培養基中培養，成功分離獲得HUCPVC，并可穩定連續傳代10代以上，分離純化的細胞表達干細胞標志物SSEA-3、SSEA-4、OCT-4、TRA-1-60和TRA-1-81，表明獲得的細胞為MSCs，是具有巨大分化潛能的細胞。盡管妊娠早期HUCPVC是一類具有外膜細胞特性的MSCs[3]，但其能夠在不添加白血病抑制因子的完全培養基條件下，在低黏附培養板上生長增殖，并具有形成擬胚體的能力，表達特異性標志蛋白[4]。本研究結果顯示，通過誘導分化，妊娠早期HUCPVC可形成表面有膜包被的、中空、分層且具有規則球形的擬胚體，并且內胚層細胞特異性標志物AFP、外胚層細胞特異性標志物Nestin和中胚層細胞特異性標志物SMA表達均呈陽性；將妊娠早期HUCPVC定向分化為胰島樣細胞后，具有分泌胰島素的功能，并且胰島素分泌受葡萄糖濃度調節。本研究結果為HUCPVC來源的胰島樣細胞移植提供了理論依據。
