引用本文： 王芳, 武巖, 石文, 邵陽, 馬印東, 賈軍, 辛乃軍, 吳秋合, 宋國棟. 基質金屬蛋白酶7處理豬脫細胞真皮基質大鼠體內移植后組織學觀察及其血管化評價. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(9): 1161-1167. doi: 10.7507/1002-1892.20140251 復制
同種異體脫細胞真皮基質（acellular dermal matrix，ADM）已被廣泛應用于臨床，并取得良好效果[1-5]。此外，豬ADM（porcine ADM，P-ADM）主要用于臨床腹壁缺損或腹疝修復[6-7]，其與自體刃厚皮復合移植修復人全層皮膚缺損也有成功報道[8-10]。但臨床應用和動物實驗結果顯示，P-ADM與宿主組織的整合、重塑及最終效果均遜于同種異體ADM[11-14]。理想的ADM應保留有利于宿主細胞、血管浸潤及組織再生重塑的完整三維網絡空間結構，同時其免疫原性成分及所產生的炎癥-免疫反應為宿主能夠耐受的水平，這有賴于制備方法的選擇。非交聯P-ADM存在的主要問題是其較強的免疫原性及誘發宿主局部及全身炎癥-免疫反應，任何脫細胞方法均不能脫除全部細胞碎片成分[15]，保留了人類所缺乏的天然α-半乳糖抗原，以及富含層粘連蛋白（laminin，LN）、Ⅳ型膠原（collagen type Ⅳ，Col Ⅳ）等成分的基底膜、皮膚附屬器和血管基膜[16]，均成為P-ADM免疫原性的主要來源。使用化學交聯劑雖能抑制P-ADM免疫原性、提高其穩定性，但卻改變了P-ADM的結構及生物物理環境[17-18]。有研究報道[19-20]，基質金屬蛋白酶7（matrix metalloproteinase 7，MMP-7）能降解Col Ⅳ、LN、纖維粘連蛋白、巢蛋白以及蛋白多糖等細胞外基質（extracellular matrix，ECM）成分。
本課題組前期通過選用適宜濃度MMP-7處理P-ADM，有效減少了基質中的細胞碎片、Col Ⅳ、LN等高免疫原性成分，同時保持了真皮膠原支架的正常組織結構并相對擴大了其三維網絡空間，使其具有良好的生物安全性和細胞相容性[21-23]。本次研究將經MMP-7處理的P-ADM（P-ADM processed with MMP-7，P-ADM-pm）植入大鼠皮下并以P-ADM作為對照，觀察比較宿主細胞、血管浸潤及組織學變化，評價P-ADM-pm作為植入性支架材料的可行性，為進一步改進其制備方法及應用于臨床提供依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
成年雄性Wistar大鼠30只，體重（250±25）g，由山東大學實驗動物中心提供，適應性飼養1周。健康雄性白色家豬1只，體重50 kg，由濟南德美養殖業有限公司提供。
中性蛋白酶（GIBCO公司，美國）；Triton X-100（Sigma公司，美國）；MMP-7（Millipore公司，美國）；山羊抗波形蛋白（Vimentin）抗體（Abcam公司，美國）；兔抗大鼠CD34抗體（武漢博士德生物工程有限公司）；即用型快速免疫組織化學MaxVisionTM試劑盒（福州邁新生物技術開發有限公司）。BX53光鏡（Olympus公司，日本）；S4800掃描電鏡（Hitachi公司，日本）。
1.2 P-ADM與P-ADM-pm的制備及檢測
取家豬腹部皮膚，機械法制作0.5～0.6 mm厚網織層真皮（組織學檢查證實），切取成62塊大小為1.5 cm×1.0 cm的網織層真皮。將62塊真皮組織隨機分為P-ADM組（A組）和P-ADM-pm組（B組），每組31塊，參照文獻[22]方法分別制備P-ADM與P-ADM-pm。A、B組均先用中性蛋白酶、Triton X-100溶液進行脫細胞處理，制成網織層P-ADM；之后B組再用濃度為0.5 U/mL MMP-7溶液處理，A組用PBS代替MMP-7處理。隨機取1塊制備的P-ADM及P-ADM-pm，細菌、真菌培養示均為陰性；HE及免疫組織化學染色示P-ADM毛囊內仍殘留毛發，上皮外根鞘內仍有完整細胞；在原微血管區域可見Vimentin陽性染色細胞殘留成分，在毛囊玻璃膜尤其是結締組織鞘層血管基膜仍有LN、Col Ⅳ陽性染色。P-ADM-pm毛囊內未見殘留毛發及上皮根鞘，膠原纖維束及膠原纖維之間間隙較P-ADM增大；僅偶見LN、Col Ⅳ弱陽性染色。
1.3 動物體內植入實驗
取30只Wistar大鼠，5%水合氯醛（7.5 mL/kg）腹腔注射麻醉，背部剃毛、清洗；于背部中線左、右兩側1 cm處，平行于脊柱各作一長2 cm切口達深筋膜淺層，然后向腹側鈍性分離1.5 cm形成囊腔。每只大鼠背部左側腔隙植入1塊P-ADM（A組）、右側植入1塊P-ADM-pm（B組），真皮側朝向深筋膜，四角用4-0絲線縫合穿至皮外結扎固定，皮膚切口原位縫合、消毒。動物單籠飼養，術后7 d拆線。
1.4 觀測指標
1.4.1 大體觀察
術后觀察大鼠飲食、活動狀態、切口愈合、移植區毛發生長、皮下積液等情況。3、7、14、21、28 d隨機取大鼠6只，同上法麻醉后按原腔隙部位切開皮膚顯露移植物及周圍組織，觀察移植物色澤、質地、大小、厚度及其與周圍組織的關系，尤其是血管化情況。
1.4.2 組織學染色觀察
各時間點大體觀察后切取樣本，置于10%甲醛溶液固定，常規石蠟包埋、4 μm厚切片。取部分切片行HE、Masson染色，中性樹脂封片，光鏡下觀察宿主細胞、微血管浸潤和膠原纖維改變等組織學變化。
1.4.3 免疫組織化學染色觀察
按文獻[24]方法，取部分切片脫蠟、水化、抗原修復、封閉非特異性抗原，滴加一抗[兔抗大鼠CD34抗體（1：50）、山羊抗Vimentin抗體（1：10）]。37℃孵育90 min，按照即用型快速免疫組織化學MaxVisionTM試劑盒說明進行操作，DAB顯色，蘇木素復染后封片。光鏡下觀察移植物內新生微血管、成纖維細胞陽性染色及分布情況。400倍鏡下，各時間點每個樣本隨機選取10個視野，分別計數移植物內新生微血管、成纖維細胞。
1.4.4 掃描電鏡觀察
術后14 d取樣本，用預冷2.5%戊二醛溶液保存，PBS沖洗3遍；1%鋨酸固定，PBS沖洗3遍，梯度乙醇水溶液置換、浸泡，樣品干燥，鍍銀，掃描電鏡觀察細胞浸潤及其與膠原纖維之間的組織結構關系。
1.5 統計學方法
采用SPSS18.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 大體觀察
術后大鼠飲食、活動可，均存活至實驗結束。A、B組切口均無明顯炎性反應、愈合良好；術后10 d左右，兩組移植區均出現毛發生長，至28 d與周圍毛發無明顯差異，但A組毛發較B組明顯生長緩慢、稀疏。術后4～5 d，2只大鼠A組移植區出現皮下積液并于5～6 d后吸收消退，其中1只B組移植區亦出現皮下積液，但積液量少，約4 d后消退。
術后3 d，兩組移植物未見明顯變化。術后7 d，兩組移植物表面均形成一層有少量微血管的纖維膜，薄膜與移植物、周圍組織容易分離；與A組比較，B組纖維膜微血管明顯且移植物表面有少量微血管浸潤。術后14 d，兩組纖維膜微血管增多、變粗，揭去薄膜后移植物表面有微血管浸潤、滲血，尤以B組明顯。術后21 d，兩組纖維膜均變厚，微血管減少、增粗成熟，纖維膜與移植物較難分離；B組移植物柔韌、有彈性，呈粉紅色，被完全血管化，而A組表現與B組14 d時相似。術后28 d，B組移植物與周圍組織融合，A組移植物與纖維膜仍可分離。見圖 1。
圖1
術后各時間點兩組移植物大體觀察?A組14 d ?B組14 d ?A組21 d ?B組21 d ??圖 2術后各時間點兩組HE染色觀察?A組3 d（× 400）?B組3 d（× 400）?A組7 d（× 400）?B組7 d（× 400）?A組14 d（× 200）?B組14 d（× 200）?A組21 d（× 400）?B組21 d（× 400）
Figure1.
Gross observation of the implants in 2 groups after implantation ?Group A at 14 days ?Group B at 14 days ?Group A at 21 days ?Group B at 21 days ??Fig. 2 HE staining observation of the implants in 2 groups after implantation ?Group A at 3 days (× 400) ?Group B at 3 days (× 400) ?Group A at 7 days (× 400) ?Group B at 7 days (× 400) ?Group A at 14 days (× 200) ?Group B at 14 days (× 200) ?Group A at 21 days (× 400) ?Group B at 21 days (× 400)
2.2 組織學觀察
隨術后時間延長，兩組均可見宿主細胞尤其是成纖維細胞、微血管，分別從移植物真皮側和表皮側向移植物中央浸潤性生長，真皮側快于表皮側，B組明顯快于A組；B組膠原纖維形態結構正常且膠原纖維之間間隙較A組大。術后3 d，A組移植物淺層可見大量炎性細胞浸潤，B組僅少量炎性細胞浸潤。術后7 d，B組移植物真皮側宿主細胞浸潤深度約為全層1/3，淺層可見少量微血管長入；A組浸潤較淺且未見微血管長入。術后14 d，B組宿主細胞（包括成纖維細胞）浸潤全層；而A組浸潤深度僅為全層1/4，淺層偶見微血管長入。術后21 d，B組移植物中央可見微血管，A組宿主細胞浸潤仍未達全層、真皮側膠原纖維形態結構出現裂解等破壞性改變。術后28 d，B組血管變粗、成熟，膠原纖維形態結構保持正常且膠原纖維之間間隙較A組大；A組移植物中央仍未見微血管，且膠原纖維破壞加重并隨炎性細胞浸潤向移植物中央發展。見圖 2、 3。
圖3
術后各時間點兩組Masson染色觀察（× 200）?A組21 d ?B組21 d ?A組28 d ?B組28 d ??圖 4術后各時間點兩組Vimentin免疫組織化學染色觀察（× 200）?A組3 d ?B組3 d ?A組14 d ?B組14 d ??圖 5術后各時間點兩組CD34免疫組織化學染色觀察（× 400）紅箭頭示移植物與周圍組織交界處黑箭頭示微血管?A組7 d ?B組7 d ?A組21 d ?B組21 d
Figure3.
Masson staining observation of the implants in 2 groups after implantation (× 200) ?Group A at 21 days ?Group B at 21 days ?Group A at 28 days ?Group B at 28 days ??Fig. 4 Immunohistochemical staining observation of the implants for Vimentin in 2 groups after implantation (× 200) ?Group A at 3 days ?Group B at 3 days ?Group A at 14 days ?Group B at 14 days ??Fig. 5 Immunohistochemical staining observation of the implants for CD34 in 2 groups after implantation (× 400) Red arrow indicated juncture of implant and tissue Black arrow indicated microvessel ?Group A at 7 days ?Group B at 7 days ?Group A at 21 days ?Group B at 21 days
2.3 免疫組織化學染色觀察
①成纖維細胞：術后3 d，B組淺層可見散在Vimentin染色陽性細胞，7 d時陽性細胞成簇并向移植物中央浸潤，14 d可見染色陽性細胞貫穿移植物全層，21、28 d陽性細胞呈減少趨勢。A組術后Vimentin染色陽性細胞呈緩慢增加趨勢，至28 d移植物中央可見陽性細胞。術后各時間點A組陽性細胞計數均明顯少于B組，差異有統計學意義（P < 0.05）。
②新生微血管：術后7 d，B組移植物淺層可見CD34染色陽性血管樣結構，14 d時血管向移植物中央生長，21 d可見血管貫穿移植物全層，28 d血管變粗成熟。A組術后14 d移植物淺層才出現CD34染色陽性血管樣結構，之后血管向移植物深層生長、數量呈增加趨勢，但至28 d仍未長至移植物中央。術后各時間點A組新生微血管計數均明顯少于B組，差異有統計學意義（P < 0.05）。見圖 4～6。
圖6
術后各時間點兩組成纖維細胞和新生微血管計數比較?成纖維細胞?新生微血管??圖 7術后14 d兩組掃描電鏡觀察?A組（× 2 000）?B組（× 2 000）?B組（× 20 k）黑箭頭示成纖維細胞白箭頭示新生膠原原纖維
Figure6.
Comparison of fibroblasts and microvessels between 2 groups at each time point ?Fibroblasts ?Microvessels ??Fig. 7 SEM observation of the implants in 2 groups at 14 days ?Group A (× 2 000) ?Group B (× 2 000) ?Group B (× 20 k) Black arrow indicated fibroblast White arrow indicated collagen fibril
2.4 掃描電鏡觀察
術后14 d，B組移植物內長入細胞明顯多于A組，可見長入的成纖維細胞及其分泌的膠原原纖維，以及與移植物原有膠原原纖維之間的組織結構關系。見圖 7。
3 討論
本研究選用豬腹部皮膚制作不含基底膜和乳頭層的0.5～0.6 mm厚網織層真皮，先用中性蛋白酶、Triton X-100脫細胞處理制成P-ADM，再用MMP-7處理制成P-ADM-pm，分別將其植入大鼠皮下進行為期28 d的觀察比較。結果顯示，術后各時間點，P-ADM-pm移植物內浸潤的宿主細胞尤其是成纖維細胞、微血管，無論是浸潤速率還是范圍均顯著優于P-ADM；P-ADM-pm淺層成纖維細胞、微血管浸潤分別出現于術后3、7 d，并分別于14、21 d時貫穿移植物全層，掃描電鏡觀察到P-ADM-pm移植物內浸潤的成纖維細胞及其分泌的膠原原纖維構象；術后各時間點，P-ADM-pm移植物膠原纖維形態結構基本正常且膠原纖維之間間隙較P-ADM大。P-ADM移植物周圍組織炎性反應較嚴重，移植物內浸潤的宿主細胞主要為炎性細胞，術后14 d宿主細胞浸潤之處膠原纖維形態結構出現裂解等破壞性改變。說明P-ADM-pm植入大鼠體內后有利于宿主細胞、血管浸潤及組織再生重塑，炎癥-免疫反應較輕，植入后28 d仍基本保持其天然形態結構的完整性。本實驗P-ADM、P-ADM-pm檢測結果與文獻[22-23]一致，因此認為二者同體移植后出現的這些組織形態學差異與MMP-7處理前、后移植物免疫原性組分、膠原纖維結構及其移植后與宿主組織的整合、重塑過程密切相關。
原位組織構建是指將支架材料植入宿主體內，為組織構建提供初始支架和組織形成的模板，依靠移植床創基組織細胞的生長、分化、遷移并黏附于支架，形成并再生組織。組織構建過程應類似于正常創傷愈合，這既取決于支架材料良好的生物相容性，同時也依靠支架的模板引導與物理屏障作用，使各種組織成分按模板生長、修復，并逐步替代支架材料，重建相對正常的組織形態學關系。同種異體ADM與自體刃厚皮復合移植治療全層皮膚缺損或直接埋植修復各種組織缺損，即屬于典型的原位構建。本研究結果顯示，P-ADM-pm移植后反應與正常創傷愈合的炎性反應期、細胞增殖期和成熟重塑期等3個相互重疊的階段相對應，與Wong等[24]以大鼠腹壁下淺動脈聯合同種異體ADM構建人工皮瓣研究觀察結果一致。同時，P-ADM-pm移植術后各時間點，移植物膠原纖維形態結構基本正常，隨時間推移，移植物內可見宿主細胞尤其是成纖維細胞、微血管分別從移植物真皮側和表皮側向中央浸潤性生長，說明P-ADM-pm作為支架材料具有良好的模板引導作用，提示P-ADM-pm作為植入性支架材料具有良好的臨床應用前景。
此外，P-ADM-pm移植術后3 d，移植物內除有較多炎性細胞浸潤外尚可見成纖維細胞，并于14 d時貫穿移植物全層、分泌膠原原纖維。另有研究表明，這些創傷早期出現的成纖維細胞除衍生自局部組織常駐細胞外，可能還來源于造血細胞[25]。成纖維細胞是創傷愈合中的主要修復細胞，它分泌ECM成分并與之相互作用、調控，同時ECM的三維網絡空間形態結構亦影響成纖維細胞的生物學行為[26]。P-ADM-pm在脫細胞基礎上經MMP-7處理進一步減少了ECM成分，殘留的主要是ColⅠ、ColⅢ纖維。然而，無論是前期的體外細胞相容性實驗[23]還是本次體內埋植實驗均顯示，成纖維細胞向P-ADM-pm內部生長的過程及速率均與同種異體ADM相近。說明P-ADM-pm的三維網絡空間形態結構可能對成纖維細胞的生物學行為起主導作用。進一步研究P-ADM-pm的組織成分、形態結構及其與成纖維細胞之間相互作用的分子機制，以及成纖維細胞的來源，對更有針對性調控成纖維細胞的生物學行為，以減少瘢痕形成甚至通過適度干預達到無瘢痕愈合的目的具有重要意義。
真皮支架材料移植后能否早期血管化是原位構建組織工程真皮組織的關鍵。移植后相對快速的血管化不但有利于活化支架材料、提高其抗感染能力，而且決定著其與宿主組織整合、重塑的生物學過程及后果。本實驗結果顯示，P-ADM-pm移植后血管化過程與Wong等[24]同種異體ADM移植后的觀察結果相似，不僅說明P-ADM-pm移植后能夠被相對快速地血管化，而且描述了其血管化的時間過程，對臨床應用尤其是與自體皮復合移植具有一定指導意義。
無論是正常創傷愈合還是本研究所涉及的原位構建組織工程真皮組織，局部適度的炎性反應有利于組織修復重建，而過度炎性反應則可能導致破壞。盡管P-ADM去除了富含各種免疫原性成分且結構致密的基底膜及真皮乳頭層，但在移植后的28 d內，P-ADM移植物周圍及其內部組織仍呈現較重的炎性反應，膠原纖維形態結構出現裂解等破壞性改變。進一步經MMP-7處理后，P-ADM-pm移植后炎性反應明顯減輕，而且移植物膠原纖維形態結構基本保持正常并顯示出良好的模板引導作用。用于復合移植的自體刃厚皮本身即含有基底膜，用于組織缺損的填充修復亦不需要基底膜，本研究制備的P-ADM-pm良好的血管化性能，對用于復合移植修復體表全層皮膚缺損具有重要意義。若用于組織內植入修復腹壁或腹疝等組織缺損，因要求植入性支架材料具有一定的抗張強度及持久性，P-ADM-pm良好的血管化性能及其埋植環境可能會導致支架材料的降解超過新生膠原的沉積。關于P-ADM-pm在體表復合移植、體內嵌入埋植修復組織缺損中的確切作用及其生物學轉歸，均有待長期實驗觀察。
同種異體脫細胞真皮基質（acellular dermal matrix，ADM）已被廣泛應用于臨床，并取得良好效果[1-5]。此外，豬ADM（porcine ADM，P-ADM）主要用于臨床腹壁缺損或腹疝修復[6-7]，其與自體刃厚皮復合移植修復人全層皮膚缺損也有成功報道[8-10]。但臨床應用和動物實驗結果顯示，P-ADM與宿主組織的整合、重塑及最終效果均遜于同種異體ADM[11-14]。理想的ADM應保留有利于宿主細胞、血管浸潤及組織再生重塑的完整三維網絡空間結構，同時其免疫原性成分及所產生的炎癥-免疫反應為宿主能夠耐受的水平，這有賴于制備方法的選擇。非交聯P-ADM存在的主要問題是其較強的免疫原性及誘發宿主局部及全身炎癥-免疫反應，任何脫細胞方法均不能脫除全部細胞碎片成分[15]，保留了人類所缺乏的天然α-半乳糖抗原，以及富含層粘連蛋白（laminin，LN）、Ⅳ型膠原（collagen type Ⅳ，Col Ⅳ）等成分的基底膜、皮膚附屬器和血管基膜[16]，均成為P-ADM免疫原性的主要來源。使用化學交聯劑雖能抑制P-ADM免疫原性、提高其穩定性，但卻改變了P-ADM的結構及生物物理環境[17-18]。有研究報道[19-20]，基質金屬蛋白酶7（matrix metalloproteinase 7，MMP-7）能降解Col Ⅳ、LN、纖維粘連蛋白、巢蛋白以及蛋白多糖等細胞外基質（extracellular matrix，ECM）成分。
本課題組前期通過選用適宜濃度MMP-7處理P-ADM，有效減少了基質中的細胞碎片、Col Ⅳ、LN等高免疫原性成分，同時保持了真皮膠原支架的正常組織結構并相對擴大了其三維網絡空間，使其具有良好的生物安全性和細胞相容性[21-23]。本次研究將經MMP-7處理的P-ADM（P-ADM processed with MMP-7，P-ADM-pm）植入大鼠皮下并以P-ADM作為對照，觀察比較宿主細胞、血管浸潤及組織學變化，評價P-ADM-pm作為植入性支架材料的可行性，為進一步改進其制備方法及應用于臨床提供依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
成年雄性Wistar大鼠30只，體重（250±25）g，由山東大學實驗動物中心提供，適應性飼養1周。健康雄性白色家豬1只，體重50 kg，由濟南德美養殖業有限公司提供。
中性蛋白酶（GIBCO公司，美國）；Triton X-100（Sigma公司，美國）；MMP-7（Millipore公司，美國）；山羊抗波形蛋白（Vimentin）抗體（Abcam公司，美國）；兔抗大鼠CD34抗體（武漢博士德生物工程有限公司）；即用型快速免疫組織化學MaxVisionTM試劑盒（福州邁新生物技術開發有限公司）。BX53光鏡（Olympus公司，日本）；S4800掃描電鏡（Hitachi公司，日本）。
1.2 P-ADM與P-ADM-pm的制備及檢測
取家豬腹部皮膚，機械法制作0.5～0.6 mm厚網織層真皮（組織學檢查證實），切取成62塊大小為1.5 cm×1.0 cm的網織層真皮。將62塊真皮組織隨機分為P-ADM組（A組）和P-ADM-pm組（B組），每組31塊，參照文獻[22]方法分別制備P-ADM與P-ADM-pm。A、B組均先用中性蛋白酶、Triton X-100溶液進行脫細胞處理，制成網織層P-ADM；之后B組再用濃度為0.5 U/mL MMP-7溶液處理，A組用PBS代替MMP-7處理。隨機取1塊制備的P-ADM及P-ADM-pm，細菌、真菌培養示均為陰性；HE及免疫組織化學染色示P-ADM毛囊內仍殘留毛發，上皮外根鞘內仍有完整細胞；在原微血管區域可見Vimentin陽性染色細胞殘留成分，在毛囊玻璃膜尤其是結締組織鞘層血管基膜仍有LN、Col Ⅳ陽性染色。P-ADM-pm毛囊內未見殘留毛發及上皮根鞘，膠原纖維束及膠原纖維之間間隙較P-ADM增大；僅偶見LN、Col Ⅳ弱陽性染色。
1.3 動物體內植入實驗
取30只Wistar大鼠，5%水合氯醛（7.5 mL/kg）腹腔注射麻醉，背部剃毛、清洗；于背部中線左、右兩側1 cm處，平行于脊柱各作一長2 cm切口達深筋膜淺層，然后向腹側鈍性分離1.5 cm形成囊腔。每只大鼠背部左側腔隙植入1塊P-ADM（A組）、右側植入1塊P-ADM-pm（B組），真皮側朝向深筋膜，四角用4-0絲線縫合穿至皮外結扎固定，皮膚切口原位縫合、消毒。動物單籠飼養，術后7 d拆線。
1.4 觀測指標
1.4.1 大體觀察
術后觀察大鼠飲食、活動狀態、切口愈合、移植區毛發生長、皮下積液等情況。3、7、14、21、28 d隨機取大鼠6只，同上法麻醉后按原腔隙部位切開皮膚顯露移植物及周圍組織，觀察移植物色澤、質地、大小、厚度及其與周圍組織的關系，尤其是血管化情況。
1.4.2 組織學染色觀察
各時間點大體觀察后切取樣本，置于10%甲醛溶液固定，常規石蠟包埋、4 μm厚切片。取部分切片行HE、Masson染色，中性樹脂封片，光鏡下觀察宿主細胞、微血管浸潤和膠原纖維改變等組織學變化。
1.4.3 免疫組織化學染色觀察
按文獻[24]方法，取部分切片脫蠟、水化、抗原修復、封閉非特異性抗原，滴加一抗[兔抗大鼠CD34抗體（1：50）、山羊抗Vimentin抗體（1：10）]。37℃孵育90 min，按照即用型快速免疫組織化學MaxVisionTM試劑盒說明進行操作，DAB顯色，蘇木素復染后封片。光鏡下觀察移植物內新生微血管、成纖維細胞陽性染色及分布情況。400倍鏡下，各時間點每個樣本隨機選取10個視野，分別計數移植物內新生微血管、成纖維細胞。
1.4.4 掃描電鏡觀察
術后14 d取樣本，用預冷2.5%戊二醛溶液保存，PBS沖洗3遍；1%鋨酸固定，PBS沖洗3遍，梯度乙醇水溶液置換、浸泡，樣品干燥，鍍銀，掃描電鏡觀察細胞浸潤及其與膠原纖維之間的組織結構關系。
1.5 統計學方法
采用SPSS18.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 大體觀察
術后大鼠飲食、活動可，均存活至實驗結束。A、B組切口均無明顯炎性反應、愈合良好；術后10 d左右，兩組移植區均出現毛發生長，至28 d與周圍毛發無明顯差異，但A組毛發較B組明顯生長緩慢、稀疏。術后4～5 d，2只大鼠A組移植區出現皮下積液并于5～6 d后吸收消退，其中1只B組移植區亦出現皮下積液，但積液量少，約4 d后消退。
術后3 d，兩組移植物未見明顯變化。術后7 d，兩組移植物表面均形成一層有少量微血管的纖維膜，薄膜與移植物、周圍組織容易分離；與A組比較，B組纖維膜微血管明顯且移植物表面有少量微血管浸潤。術后14 d，兩組纖維膜微血管增多、變粗，揭去薄膜后移植物表面有微血管浸潤、滲血，尤以B組明顯。術后21 d，兩組纖維膜均變厚，微血管減少、增粗成熟，纖維膜與移植物較難分離；B組移植物柔韌、有彈性，呈粉紅色，被完全血管化，而A組表現與B組14 d時相似。術后28 d，B組移植物與周圍組織融合，A組移植物與纖維膜仍可分離。見圖 1。
圖1
術后各時間點兩組移植物大體觀察?A組14 d ?B組14 d ?A組21 d ?B組21 d ??圖 2術后各時間點兩組HE染色觀察?A組3 d（× 400）?B組3 d（× 400）?A組7 d（× 400）?B組7 d（× 400）?A組14 d（× 200）?B組14 d（× 200）?A組21 d（× 400）?B組21 d（× 400）
Figure1.
Gross observation of the implants in 2 groups after implantation ?Group A at 14 days ?Group B at 14 days ?Group A at 21 days ?Group B at 21 days ??Fig. 2 HE staining observation of the implants in 2 groups after implantation ?Group A at 3 days (× 400) ?Group B at 3 days (× 400) ?Group A at 7 days (× 400) ?Group B at 7 days (× 400) ?Group A at 14 days (× 200) ?Group B at 14 days (× 200) ?Group A at 21 days (× 400) ?Group B at 21 days (× 400)
2.2 組織學觀察
隨術后時間延長，兩組均可見宿主細胞尤其是成纖維細胞、微血管，分別從移植物真皮側和表皮側向移植物中央浸潤性生長，真皮側快于表皮側，B組明顯快于A組；B組膠原纖維形態結構正常且膠原纖維之間間隙較A組大。術后3 d，A組移植物淺層可見大量炎性細胞浸潤，B組僅少量炎性細胞浸潤。術后7 d，B組移植物真皮側宿主細胞浸潤深度約為全層1/3，淺層可見少量微血管長入；A組浸潤較淺且未見微血管長入。術后14 d，B組宿主細胞（包括成纖維細胞）浸潤全層；而A組浸潤深度僅為全層1/4，淺層偶見微血管長入。術后21 d，B組移植物中央可見微血管，A組宿主細胞浸潤仍未達全層、真皮側膠原纖維形態結構出現裂解等破壞性改變。術后28 d，B組血管變粗、成熟，膠原纖維形態結構保持正常且膠原纖維之間間隙較A組大；A組移植物中央仍未見微血管，且膠原纖維破壞加重并隨炎性細胞浸潤向移植物中央發展。見圖 2、 3。
圖3
術后各時間點兩組Masson染色觀察（× 200）?A組21 d ?B組21 d ?A組28 d ?B組28 d ??圖 4術后各時間點兩組Vimentin免疫組織化學染色觀察（× 200）?A組3 d ?B組3 d ?A組14 d ?B組14 d ??圖 5術后各時間點兩組CD34免疫組織化學染色觀察（× 400）紅箭頭示移植物與周圍組織交界處黑箭頭示微血管?A組7 d ?B組7 d ?A組21 d ?B組21 d
Figure3.
Masson staining observation of the implants in 2 groups after implantation (× 200) ?Group A at 21 days ?Group B at 21 days ?Group A at 28 days ?Group B at 28 days ??Fig. 4 Immunohistochemical staining observation of the implants for Vimentin in 2 groups after implantation (× 200) ?Group A at 3 days ?Group B at 3 days ?Group A at 14 days ?Group B at 14 days ??Fig. 5 Immunohistochemical staining observation of the implants for CD34 in 2 groups after implantation (× 400) Red arrow indicated juncture of implant and tissue Black arrow indicated microvessel ?Group A at 7 days ?Group B at 7 days ?Group A at 21 days ?Group B at 21 days
2.3 免疫組織化學染色觀察
①成纖維細胞：術后3 d，B組淺層可見散在Vimentin染色陽性細胞，7 d時陽性細胞成簇并向移植物中央浸潤，14 d可見染色陽性細胞貫穿移植物全層，21、28 d陽性細胞呈減少趨勢。A組術后Vimentin染色陽性細胞呈緩慢增加趨勢，至28 d移植物中央可見陽性細胞。術后各時間點A組陽性細胞計數均明顯少于B組，差異有統計學意義（P < 0.05）。
②新生微血管：術后7 d，B組移植物淺層可見CD34染色陽性血管樣結構，14 d時血管向移植物中央生長，21 d可見血管貫穿移植物全層，28 d血管變粗成熟。A組術后14 d移植物淺層才出現CD34染色陽性血管樣結構，之后血管向移植物深層生長、數量呈增加趨勢，但至28 d仍未長至移植物中央。術后各時間點A組新生微血管計數均明顯少于B組，差異有統計學意義（P < 0.05）。見圖 4～6。
圖6
術后各時間點兩組成纖維細胞和新生微血管計數比較?成纖維細胞?新生微血管??圖 7術后14 d兩組掃描電鏡觀察?A組（× 2 000）?B組（× 2 000）?B組（× 20 k）黑箭頭示成纖維細胞白箭頭示新生膠原原纖維
Figure6.
Comparison of fibroblasts and microvessels between 2 groups at each time point ?Fibroblasts ?Microvessels ??Fig. 7 SEM observation of the implants in 2 groups at 14 days ?Group A (× 2 000) ?Group B (× 2 000) ?Group B (× 20 k) Black arrow indicated fibroblast White arrow indicated collagen fibril
2.4 掃描電鏡觀察
術后14 d，B組移植物內長入細胞明顯多于A組，可見長入的成纖維細胞及其分泌的膠原原纖維，以及與移植物原有膠原原纖維之間的組織結構關系。見圖 7。
3 討論
本研究選用豬腹部皮膚制作不含基底膜和乳頭層的0.5～0.6 mm厚網織層真皮，先用中性蛋白酶、Triton X-100脫細胞處理制成P-ADM，再用MMP-7處理制成P-ADM-pm，分別將其植入大鼠皮下進行為期28 d的觀察比較。結果顯示，術后各時間點，P-ADM-pm移植物內浸潤的宿主細胞尤其是成纖維細胞、微血管，無論是浸潤速率還是范圍均顯著優于P-ADM；P-ADM-pm淺層成纖維細胞、微血管浸潤分別出現于術后3、7 d，并分別于14、21 d時貫穿移植物全層，掃描電鏡觀察到P-ADM-pm移植物內浸潤的成纖維細胞及其分泌的膠原原纖維構象；術后各時間點，P-ADM-pm移植物膠原纖維形態結構基本正常且膠原纖維之間間隙較P-ADM大。P-ADM移植物周圍組織炎性反應較嚴重，移植物內浸潤的宿主細胞主要為炎性細胞，術后14 d宿主細胞浸潤之處膠原纖維形態結構出現裂解等破壞性改變。說明P-ADM-pm植入大鼠體內后有利于宿主細胞、血管浸潤及組織再生重塑，炎癥-免疫反應較輕，植入后28 d仍基本保持其天然形態結構的完整性。本實驗P-ADM、P-ADM-pm檢測結果與文獻[22-23]一致，因此認為二者同體移植后出現的這些組織形態學差異與MMP-7處理前、后移植物免疫原性組分、膠原纖維結構及其移植后與宿主組織的整合、重塑過程密切相關。
原位組織構建是指將支架材料植入宿主體內，為組織構建提供初始支架和組織形成的模板，依靠移植床創基組織細胞的生長、分化、遷移并黏附于支架，形成并再生組織。組織構建過程應類似于正常創傷愈合，這既取決于支架材料良好的生物相容性，同時也依靠支架的模板引導與物理屏障作用，使各種組織成分按模板生長、修復，并逐步替代支架材料，重建相對正常的組織形態學關系。同種異體ADM與自體刃厚皮復合移植治療全層皮膚缺損或直接埋植修復各種組織缺損，即屬于典型的原位構建。本研究結果顯示，P-ADM-pm移植后反應與正常創傷愈合的炎性反應期、細胞增殖期和成熟重塑期等3個相互重疊的階段相對應，與Wong等[24]以大鼠腹壁下淺動脈聯合同種異體ADM構建人工皮瓣研究觀察結果一致。同時，P-ADM-pm移植術后各時間點，移植物膠原纖維形態結構基本正常，隨時間推移，移植物內可見宿主細胞尤其是成纖維細胞、微血管分別從移植物真皮側和表皮側向中央浸潤性生長，說明P-ADM-pm作為支架材料具有良好的模板引導作用，提示P-ADM-pm作為植入性支架材料具有良好的臨床應用前景。
此外，P-ADM-pm移植術后3 d，移植物內除有較多炎性細胞浸潤外尚可見成纖維細胞，并于14 d時貫穿移植物全層、分泌膠原原纖維。另有研究表明，這些創傷早期出現的成纖維細胞除衍生自局部組織常駐細胞外，可能還來源于造血細胞[25]。成纖維細胞是創傷愈合中的主要修復細胞，它分泌ECM成分并與之相互作用、調控，同時ECM的三維網絡空間形態結構亦影響成纖維細胞的生物學行為[26]。P-ADM-pm在脫細胞基礎上經MMP-7處理進一步減少了ECM成分，殘留的主要是ColⅠ、ColⅢ纖維。然而，無論是前期的體外細胞相容性實驗[23]還是本次體內埋植實驗均顯示，成纖維細胞向P-ADM-pm內部生長的過程及速率均與同種異體ADM相近。說明P-ADM-pm的三維網絡空間形態結構可能對成纖維細胞的生物學行為起主導作用。進一步研究P-ADM-pm的組織成分、形態結構及其與成纖維細胞之間相互作用的分子機制，以及成纖維細胞的來源，對更有針對性調控成纖維細胞的生物學行為，以減少瘢痕形成甚至通過適度干預達到無瘢痕愈合的目的具有重要意義。
真皮支架材料移植后能否早期血管化是原位構建組織工程真皮組織的關鍵。移植后相對快速的血管化不但有利于活化支架材料、提高其抗感染能力，而且決定著其與宿主組織整合、重塑的生物學過程及后果。本實驗結果顯示，P-ADM-pm移植后血管化過程與Wong等[24]同種異體ADM移植后的觀察結果相似，不僅說明P-ADM-pm移植后能夠被相對快速地血管化，而且描述了其血管化的時間過程，對臨床應用尤其是與自體皮復合移植具有一定指導意義。
無論是正常創傷愈合還是本研究所涉及的原位構建組織工程真皮組織，局部適度的炎性反應有利于組織修復重建，而過度炎性反應則可能導致破壞。盡管P-ADM去除了富含各種免疫原性成分且結構致密的基底膜及真皮乳頭層，但在移植后的28 d內，P-ADM移植物周圍及其內部組織仍呈現較重的炎性反應，膠原纖維形態結構出現裂解等破壞性改變。進一步經MMP-7處理后，P-ADM-pm移植后炎性反應明顯減輕，而且移植物膠原纖維形態結構基本保持正常并顯示出良好的模板引導作用。用于復合移植的自體刃厚皮本身即含有基底膜，用于組織缺損的填充修復亦不需要基底膜，本研究制備的P-ADM-pm良好的血管化性能，對用于復合移植修復體表全層皮膚缺損具有重要意義。若用于組織內植入修復腹壁或腹疝等組織缺損，因要求植入性支架材料具有一定的抗張強度及持久性，P-ADM-pm良好的血管化性能及其埋植環境可能會導致支架材料的降解超過新生膠原的沉積。關于P-ADM-pm在體表復合移植、體內嵌入埋植修復組織缺損中的確切作用及其生物學轉歸，均有待長期實驗觀察。
