引用本文： 劉英, 王大慶, 莫金龍, 李賓中. 細胞片層技術在口腔組織工程中的研究進展. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(9): 1168-1172. doi: 10.7507/1002-1892.20140252 復制
組織工程學是上世紀80年代末提出的一個嶄新概念，它不僅為解除患者痛苦提供了一種新的治療方法，更重要的是提出了復制組織、器官的新思想，是人類醫學史上的一次革命。經歷了20余年的發展，組織工程學有了很大進步，但仍存在種子細胞流失大、支架材料降解引起免疫反應、無法控制細胞與支架的相互作用等諸多缺點。為克服上述缺點，研究者們提出了細胞片層技術（cell sheet technology，CST），該技術無需對細胞進行胰蛋白酶消化等處理，保留了培養過程中細胞自分泌的細胞外基質，使構建的組織結構更接近正常組織，從而實現受損組織或器官的協同高效再生治療[1-2]。口腔健康是全身健康的重要組成部分，牙周病、口腔頜面部腫瘤、外傷、畸形等均會導致組織破壞或缺損，既影響患者生活質量，還伴隨心理功能和社會功能障礙[3-4]。CST在口腔組織工程中具有廣泛應用前景，現就其在口腔組織修復和器官再生方面的研究現狀作一綜述。
1 CST的生物學特點
CST是組織工程中能更有效的獲取種子細胞的一項新技術。該技術是將溫度反應性聚合物——聚異丙基丙烯酰胺[poly（N-isopropylacrylamide），PIPAAm]共價結合至普通培養皿表面，形成溫度反應性的培養皿，用于細胞培養。PIPAAm同時具有疏水性異丙基和親水性酰胺基，當溶液溫度高于臨界溫度（32℃）時表現為疏水性，細胞吸附于培養皿底壁，在其表面附著、增殖，形成單層細胞膜片；當溶液溫度低于臨界溫度時，聚合物表面變為親水性，并在培養皿表面和培養的細胞之間形成水化層，融合細胞呈膜片狀結構，可依附于細胞外基質從培養皿底壁分離。與傳統的組織工程技術相比，CST細胞接種率高、基質豐富、可根據需要構建相應厚度和大小的細胞膜片，具有良好的生物相容性和理想的操作性，有利于細胞移植成活和組織功能重建[5-8]。目前，應用CST構建口腔組織和器官主要有3種方式：將單層細胞膜片植入受區位點，構建牙周韌帶、口腔黏膜上皮；同種或異種多層細胞膜片植入受區位點，構建牙周組織；同種多層細胞膜片包裹支架材料后植入受區位點，構建骨三維結構組織。
2 口腔CST種子細胞常見來源及存在問題
2.1 種子細胞供體來源分類
種子細胞是CST最基本要素，形成新生組織需要足夠數量、增殖力強且不會引起機體免疫排斥反應的種子細胞。根據種子細胞個體來源差異可分為自體細胞、同種異體細胞、細胞系、異種細胞。①自體細胞可通過在體外培養特定細胞，經一段時間擴增至足以滿足植入物功能需要的數量，以達到治療需要。其優點是可避免受者免疫系統的排斥反應，但也存在以下問題，如取自體細胞不可避免要增加創傷，細胞培養的組織量受限，細胞培養、純化、擴增需較長時間，某些情況下會延誤治療[9-10]。②同種異體細胞可預先在體外培養至足夠數量并保存，即使是立即需要也可得到。但同種異體來源的細胞同樣也存在供者創傷、細胞組織來源受限、培養中細胞變異和體外擴增受限等制約因素[11-12]。③細胞系通常經分子生物學技術處理，使細胞發生遺傳學改變，適于無限生長；可誘導分化為有特定功能的細胞、產生所需的治療性蛋白、避免宿主免疫反應。但當使用細胞系時需考慮其安全性，細胞系表現出部分腫瘤樣改變的性質是移植后必須關注的問題。④對于不能通過自體、同種異體來源滿足細胞數量需求時，可采用異種細胞培養。體外系統培養和基因技術可對異種細胞進行改造、免疫保護等，使異種細胞應用成為可能，一旦成功則只需通過繁殖動物即可滿足需要。但也存在以下問題：補體介導的超急性排斥反應被認為是異種移植的主要障礙；由于失去正常生存環境，在培養過程中常發生損傷和活力喪失或減弱；傳代后有可能發生變異[13-15]。
2.2 種子細胞分化狀態來源
CST需要大量細胞，如何從少量組織中獲取大量細胞已成為組織工程研究中亟待解決的問題之一。目前，常見種子細胞來源有：與缺損組織細胞同源的自體細胞、MSCs、胚胎干細胞（embryonic stem cells，ES）。①與缺損組織細胞同源的自體細胞理論上是最理想的種子細胞源，不僅功能相同，無需誘導分化培養，而且不存在免疫排斥反應；但其取材受限，細胞增殖能力低，難以達到需要的細胞數量。②MSCs是屬于中胚層的一類多能干細胞，來源廣泛、易于分離、培養，具有強大的增殖能力和多向分化潛能，不存在免疫排斥反應等特性，作為種子細胞構建細胞膜片具有廣闊應用前景。口腔CST可使用的MSCs包括BMSCs、脂肪來源MSCs和牙源性MSCs。其中頜骨BMSCs和牙源性MSCs具有較強的增殖和成骨分化能力，較易誘導分化形成需要的口腔黏膜、牙體、牙周或骨組織。③ES是來源于著床前的囊胚內細胞團或早期胎兒原始生殖細胞的一類未分化的全能性、多能性干細胞，可分化為3個胚層細胞。不同體外培養條件可使ES向不同細胞系分化，并能維持整個生命過程中細胞的更新和正常功能。但用ES作為種子細胞，體外培養要求嚴格，安全性難于把握，自發分化難以控制，且分化多具致瘤性，臨床使用尚存在倫理學問題[16-20]。
優選不同組織來源的同一功能最佳種子細胞、同種異體與異種移植的免疫反應，以及種子細胞與細胞外基質的相互影響、相互作用，仍是CST今后研究方向。
3 CST溫度反應性的聚合物研究進展
CST的優勢在于解決了細胞和培養皿間的分離難題。該技術通過將溫敏性聚合物PIPAAm這種大分子水凝膠涂布于普通培養皿底部，制備溫敏性培養皿，使細胞膜片在溶液溫度低于臨界溫度時可依附于細胞外基質，自動從培養皿底壁分離釋放。近年來，如何進一步改善PIPAAm的生物學性能，學者們進行了相關研究。①采用原子轉移自由基聚合和電化學原理直接合成具有溫敏性超長鏈化合物，提高了聚合效率，聚合物的聚合度具有較高可調控性，還能有效利用電化學反應快速對其外端進行改性，有利于與靶向分子結合，誘導細胞增殖、分化[21-22]。②PIPAAm是一種在溫度稍低于臨界溶解溫度時可溶，溫度稍高于臨界溶解溫度時不溶的材料。PIPAAm多孔膜是在PIPAAm下增加滲透性膜片，能夠為該多聚物提供更多水分子，增加水合率，從而提高其解離速度。PIPAAm共聚乙二醇多孔膜不僅在底部增加高滲透性膜，還通過和乙二醇交聯形成網狀結構，使得水接觸角更大，從而實現快速解離[23-25]。③納米材料是上世紀80年代發展的新材料，最大特點是表面積大，其表面能和活性增大，可大大增加細胞的遷移、增殖及分化功能。利用納米技術制備的納米級溫敏性聚合物PIPAAm，可促進細胞膜片種子細胞的增殖、分化和組織器官的三維再生[26-27]。④通過對PIPAAm表面的生物修飾，制成攜帶生物信息的材料，如將細胞因子、酶、黏附蛋白等固定在材料表面，可促進細胞增殖和細胞間的信號傳遞、細胞外基質合成、細胞膜片血管網絡形成以及誘導細胞定向分化。以上研究既改進了細胞膜片的生物學性能，又拓寬了其應用領域[28-29]。
4 CST在口腔組織工程中的研究進展
隨著發育生物學、細胞生物學、干細胞學、分子生物學以及生物材料學等領域的進展，CST或CST與傳統組織工程方法結合在口腔組織工程中取得了長足發展。
4.1 CST在口腔牙周組織修復重建中的應用
牙周炎是一種慢性感染性疾病，可破壞牙周細胞、結締組織基質、牙槽骨，最終導致牙齒缺失。傳統方法如自體骨、同種異體骨及骨替代材料的移植、引導組織再生術等，均不能達到牙周組織的完全再生，CST為實現牙周組織再生提供了新的思路和方法。張劍英等[30]通過酶聯組織塊法體外培養人牙周韌帶干細胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs），構建PDLSCs膜片并鑒定膜片細胞外基質的主要結構蛋白；結果表明PDLSCs來源于間充質并具有干細胞潛在分化能力，茜素紅及油紅O染色陽性結果提示PDLSCs具有良好的成骨及成脂分化能力，HE染色及免疫組織化學染色發現PDLSCs膜片高表達細胞外基質主要結構蛋白Ⅰ型膠原、層粘連蛋白及纖連蛋白，具有牙周韌帶的生物學特性。李霞[31]用L-抗壞血酸-2-磷酸酯誘導PDLSCs合成Ⅰ型膠原，增加細胞外基質的聚積，促進細胞膜片形成；嘗試應用內皮培養基體外誘導脂肪來源MSCs向內皮細胞分化。實驗成功構建了操作性能較強的PDLSCs膜片三維聚合體和3層復合膜片，但在脂肪來源MSCs向內皮分化過程中，未檢測到CD31的表達，有待進一步研究。Hasegawa等[32]將人牙周膜細胞膜片移植至免疫缺陷大鼠的牙周缺損區，4周后觀察到牙本質表面均有新生纖維斜插入其中，且纖維另一端有薄層牙骨質樣硬組織形成，表明CST可用于牙周組織的再生。Iwata等[33]采用乙醇酸編織片作載體，將3層犬牙周膜細胞膜片重疊后植于牙周缺損的牙根表面，周圍用多孔β-磷酸三鈣充填，觀察到缺損區有新生骨和牙骨質，并有定向排列的膠原纖維連接；表明牙周膜細胞膜片可重建牙周組織的軟、硬組織，具有良好力學特性，更接近于正常組織。還有其他研究結果均顯示CST在牙周組織再生中具有重要作用[34-36]。
4.2 應用CST構建口腔黏膜修復軟組織缺損
目前對于黏膜缺損的修復基本采用皮膚移植或口腔黏膜移植方法，但存在以下問題：可供移植的黏膜瓣或同源性皮片來源有限；增加第2術區疼痛和感染；皮膚移植后不會轉化為口腔黏膜，在外觀及分泌、潤滑、咀嚼等功能方面與正常口腔黏膜有很大差距，不能滿足臨床需要。近年有研究以CST為基礎，通過同種或異種細胞膜片疊加、細胞膜片結合支架以及細胞膜片折疊等方法成功構建了三維結構的口腔黏膜組織[37]。應用體外培養的黏膜角化上皮細胞膜片進行先天性顎裂修補，可有效解決顎裂成形治療后因顎黏膜組織量不足而導致的瘢痕攣縮、骨面暴露和頜骨發育受限的問題[38]。李宏衛等[39]應用傳統組織工程方法制備了口腔黏膜組織，并臨床修復7例口腔良性腫瘤患者切除術后口內黏膜缺損；結果顯示組織工程口腔黏膜與創面生長良好，但存在種子細胞損失較多、細胞間基質缺乏、操作性較差等缺點。宋慶高[38]應用轉染γ-干擾素的口腔黏膜細胞膜片修復3周齡SD大鼠裸露硬腭，結果表明，細胞膜片的修復對于預防上頜骨繼發畸形有積極意義。采用CST構建口腔黏膜細胞膜片用于修復口腔腫瘤切除術后缺損，可明顯促進局部黏膜角化上皮修復和頜骨再生，抑制瘢痕形成。體外培養的口腔黏膜上皮細胞較皮膚表皮細胞增殖能力高，更適宜作為體內組織缺損修復的細胞來源，研究者們還將口腔黏膜細胞片成功應用于其他組織器官修復。如將口腔黏膜分離的上皮干細胞作為種子細胞，與3T3細胞復合培養形成多層細胞膜片，用于角膜、食管潰瘍、尿道組織缺損的修復。結果顯示，膜片修復的組織無需使用載體材料，提高了角膜的透光性；移植的細胞片層和受區基質直接接觸，可加速創口愈合，降低炎性反應，并顯示良好功能[40-44]。
4.3 應用CST構建骨組織修復頜面部骨缺損
腫瘤、外傷、畸形是導致頜面部骨和牙槽骨缺損的主要原因，研究合適的骨缺損修復材料對頜面部的結構、功能、面部形態的恢復尤為重要。傳統組織工程方法是將細胞直接接種至支架材料，存在細胞利用率低、附著效率差、分布不均勻的缺點。CST通過形成多層或混合細胞膜片疊加，不斷產生細胞外基質，最終形成細胞-基質聚集體，并與傳統支架塑形方法相結合，在組織工程骨構建方面表現出巨大潛力[3-4]。Chen等[45]制備了犬BMSCs細胞膜片，并以含富血小板血漿的犬脫鈣骨為基質，將二者構成細胞-基質聚集體植入犬左側背闊肌深面，其成骨效果明顯優于不加細胞膜片的組織工程骨。姚超等[46]應用BMSCs細胞膜片包裹含有重組人BMP-2、VEGF生長因子的聚乳酸羥基乙酸共聚物支架表面，成功構建組織工程骨并修復犬下頜骨缺損；結果顯示新生骨血管豐富、硬度良好，既有密質骨也有松質骨成分，為頜面部骨組織缺損修復提供了良好的組織來源。
隨著生物相容性材料的發展，口腔種植技術已成為牙缺失及顏面部缺損患者最理想的義齒修復及固位方式。種植體與頜骨形成良好的骨結合是種植體成功最重要的因素，良好的骨結合要求負載咬合力的種植體表面與有活力的骨組織之間存在結構和功能上的直接聯系，種植體與骨組織之間不間隔任何組織，CST對促進種植體周圍骨結合的形成具有重要意義[47-48]。于淼[49]應用CST構建2型糖尿病大鼠BMSCs組織工程種植體，結果顯示包裹種植體的細胞膜片具有良好活力，能分泌大量細胞外基質，并形成礦質小球。BMSCs細胞膜片與種植體的整合顯示了良好的生物活性及成骨能力，可成為提高系統性疾病患者種植體骨結合的新方法。然而，種植體骨結合并不是最理想的愈合方式，與天然牙相比，骨整合種植體由于缺乏牙周膜這一特殊生理結構，種植體缺乏應力緩沖結構和天然免疫封閉區，不是真正意義的生物整合種植體，易發生骨組織慢性應力疲勞和種植體周圍炎。多年來，學者們對種植體的牙周膜再生進行了相關研究，先后研究了PDLSCs與種植體純鈦表面的相互作用，可形成牙骨質層、骨、膠原纖維結構[50-53]。各研究均提示構建種植體周圍類似天然牙的牙周韌帶可行。鑒于CST在構建牙周膜組織再生中展示了較傳統組織工程更大的優勢，Huang等[54]提出了利用CST能有效促進種植體牙周膜再生的假說，目前尚未見相關研究。
綜上述，CST克服了傳統組織工程技術的不足，在口腔組織工程中具有廣闊應用前景。但目前尚處于實驗室研究階段，缺乏臨床觀察，仍存在一些問題亟待解決，如種子細胞較難獲得；疊加的細胞膜片超過一定厚度時，會因為氧氣和營養供應障礙導致內部細胞壞死；構建較大體積、較高強度的組織器官仍是該技術面臨的難題。隨著科學技術的不斷發展，CST與傳統組織工程技術相結合，經不斷完善和創新，有望加速口腔組織工程學的發展，為患者提供更多更好的治療手段。
組織工程學是上世紀80年代末提出的一個嶄新概念，它不僅為解除患者痛苦提供了一種新的治療方法，更重要的是提出了復制組織、器官的新思想，是人類醫學史上的一次革命。經歷了20余年的發展，組織工程學有了很大進步，但仍存在種子細胞流失大、支架材料降解引起免疫反應、無法控制細胞與支架的相互作用等諸多缺點。為克服上述缺點，研究者們提出了細胞片層技術（cell sheet technology，CST），該技術無需對細胞進行胰蛋白酶消化等處理，保留了培養過程中細胞自分泌的細胞外基質，使構建的組織結構更接近正常組織，從而實現受損組織或器官的協同高效再生治療[1-2]。口腔健康是全身健康的重要組成部分，牙周病、口腔頜面部腫瘤、外傷、畸形等均會導致組織破壞或缺損，既影響患者生活質量，還伴隨心理功能和社會功能障礙[3-4]。CST在口腔組織工程中具有廣泛應用前景，現就其在口腔組織修復和器官再生方面的研究現狀作一綜述。
1 CST的生物學特點
CST是組織工程中能更有效的獲取種子細胞的一項新技術。該技術是將溫度反應性聚合物——聚異丙基丙烯酰胺[poly（N-isopropylacrylamide），PIPAAm]共價結合至普通培養皿表面，形成溫度反應性的培養皿，用于細胞培養。PIPAAm同時具有疏水性異丙基和親水性酰胺基，當溶液溫度高于臨界溫度（32℃）時表現為疏水性，細胞吸附于培養皿底壁，在其表面附著、增殖，形成單層細胞膜片；當溶液溫度低于臨界溫度時，聚合物表面變為親水性，并在培養皿表面和培養的細胞之間形成水化層，融合細胞呈膜片狀結構，可依附于細胞外基質從培養皿底壁分離。與傳統的組織工程技術相比，CST細胞接種率高、基質豐富、可根據需要構建相應厚度和大小的細胞膜片，具有良好的生物相容性和理想的操作性，有利于細胞移植成活和組織功能重建[5-8]。目前，應用CST構建口腔組織和器官主要有3種方式：將單層細胞膜片植入受區位點，構建牙周韌帶、口腔黏膜上皮；同種或異種多層細胞膜片植入受區位點，構建牙周組織；同種多層細胞膜片包裹支架材料后植入受區位點，構建骨三維結構組織。
2 口腔CST種子細胞常見來源及存在問題
2.1 種子細胞供體來源分類
種子細胞是CST最基本要素，形成新生組織需要足夠數量、增殖力強且不會引起機體免疫排斥反應的種子細胞。根據種子細胞個體來源差異可分為自體細胞、同種異體細胞、細胞系、異種細胞。①自體細胞可通過在體外培養特定細胞，經一段時間擴增至足以滿足植入物功能需要的數量，以達到治療需要。其優點是可避免受者免疫系統的排斥反應，但也存在以下問題，如取自體細胞不可避免要增加創傷，細胞培養的組織量受限，細胞培養、純化、擴增需較長時間，某些情況下會延誤治療[9-10]。②同種異體細胞可預先在體外培養至足夠數量并保存，即使是立即需要也可得到。但同種異體來源的細胞同樣也存在供者創傷、細胞組織來源受限、培養中細胞變異和體外擴增受限等制約因素[11-12]。③細胞系通常經分子生物學技術處理，使細胞發生遺傳學改變，適于無限生長；可誘導分化為有特定功能的細胞、產生所需的治療性蛋白、避免宿主免疫反應。但當使用細胞系時需考慮其安全性，細胞系表現出部分腫瘤樣改變的性質是移植后必須關注的問題。④對于不能通過自體、同種異體來源滿足細胞數量需求時，可采用異種細胞培養。體外系統培養和基因技術可對異種細胞進行改造、免疫保護等，使異種細胞應用成為可能，一旦成功則只需通過繁殖動物即可滿足需要。但也存在以下問題：補體介導的超急性排斥反應被認為是異種移植的主要障礙；由于失去正常生存環境，在培養過程中常發生損傷和活力喪失或減弱；傳代后有可能發生變異[13-15]。
2.2 種子細胞分化狀態來源
CST需要大量細胞，如何從少量組織中獲取大量細胞已成為組織工程研究中亟待解決的問題之一。目前，常見種子細胞來源有：與缺損組織細胞同源的自體細胞、MSCs、胚胎干細胞（embryonic stem cells，ES）。①與缺損組織細胞同源的自體細胞理論上是最理想的種子細胞源，不僅功能相同，無需誘導分化培養，而且不存在免疫排斥反應；但其取材受限，細胞增殖能力低，難以達到需要的細胞數量。②MSCs是屬于中胚層的一類多能干細胞，來源廣泛、易于分離、培養，具有強大的增殖能力和多向分化潛能，不存在免疫排斥反應等特性，作為種子細胞構建細胞膜片具有廣闊應用前景。口腔CST可使用的MSCs包括BMSCs、脂肪來源MSCs和牙源性MSCs。其中頜骨BMSCs和牙源性MSCs具有較強的增殖和成骨分化能力，較易誘導分化形成需要的口腔黏膜、牙體、牙周或骨組織。③ES是來源于著床前的囊胚內細胞團或早期胎兒原始生殖細胞的一類未分化的全能性、多能性干細胞，可分化為3個胚層細胞。不同體外培養條件可使ES向不同細胞系分化，并能維持整個生命過程中細胞的更新和正常功能。但用ES作為種子細胞，體外培養要求嚴格，安全性難于把握，自發分化難以控制，且分化多具致瘤性，臨床使用尚存在倫理學問題[16-20]。
優選不同組織來源的同一功能最佳種子細胞、同種異體與異種移植的免疫反應，以及種子細胞與細胞外基質的相互影響、相互作用，仍是CST今后研究方向。
3 CST溫度反應性的聚合物研究進展
CST的優勢在于解決了細胞和培養皿間的分離難題。該技術通過將溫敏性聚合物PIPAAm這種大分子水凝膠涂布于普通培養皿底部，制備溫敏性培養皿，使細胞膜片在溶液溫度低于臨界溫度時可依附于細胞外基質，自動從培養皿底壁分離釋放。近年來，如何進一步改善PIPAAm的生物學性能，學者們進行了相關研究。①采用原子轉移自由基聚合和電化學原理直接合成具有溫敏性超長鏈化合物，提高了聚合效率，聚合物的聚合度具有較高可調控性，還能有效利用電化學反應快速對其外端進行改性，有利于與靶向分子結合，誘導細胞增殖、分化[21-22]。②PIPAAm是一種在溫度稍低于臨界溶解溫度時可溶，溫度稍高于臨界溶解溫度時不溶的材料。PIPAAm多孔膜是在PIPAAm下增加滲透性膜片，能夠為該多聚物提供更多水分子，增加水合率，從而提高其解離速度。PIPAAm共聚乙二醇多孔膜不僅在底部增加高滲透性膜，還通過和乙二醇交聯形成網狀結構，使得水接觸角更大，從而實現快速解離[23-25]。③納米材料是上世紀80年代發展的新材料，最大特點是表面積大，其表面能和活性增大，可大大增加細胞的遷移、增殖及分化功能。利用納米技術制備的納米級溫敏性聚合物PIPAAm，可促進細胞膜片種子細胞的增殖、分化和組織器官的三維再生[26-27]。④通過對PIPAAm表面的生物修飾，制成攜帶生物信息的材料，如將細胞因子、酶、黏附蛋白等固定在材料表面，可促進細胞增殖和細胞間的信號傳遞、細胞外基質合成、細胞膜片血管網絡形成以及誘導細胞定向分化。以上研究既改進了細胞膜片的生物學性能，又拓寬了其應用領域[28-29]。
4 CST在口腔組織工程中的研究進展
隨著發育生物學、細胞生物學、干細胞學、分子生物學以及生物材料學等領域的進展，CST或CST與傳統組織工程方法結合在口腔組織工程中取得了長足發展。
4.1 CST在口腔牙周組織修復重建中的應用
牙周炎是一種慢性感染性疾病，可破壞牙周細胞、結締組織基質、牙槽骨，最終導致牙齒缺失。傳統方法如自體骨、同種異體骨及骨替代材料的移植、引導組織再生術等，均不能達到牙周組織的完全再生，CST為實現牙周組織再生提供了新的思路和方法。張劍英等[30]通過酶聯組織塊法體外培養人牙周韌帶干細胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs），構建PDLSCs膜片并鑒定膜片細胞外基質的主要結構蛋白；結果表明PDLSCs來源于間充質并具有干細胞潛在分化能力，茜素紅及油紅O染色陽性結果提示PDLSCs具有良好的成骨及成脂分化能力，HE染色及免疫組織化學染色發現PDLSCs膜片高表達細胞外基質主要結構蛋白Ⅰ型膠原、層粘連蛋白及纖連蛋白，具有牙周韌帶的生物學特性。李霞[31]用L-抗壞血酸-2-磷酸酯誘導PDLSCs合成Ⅰ型膠原，增加細胞外基質的聚積，促進細胞膜片形成；嘗試應用內皮培養基體外誘導脂肪來源MSCs向內皮細胞分化。實驗成功構建了操作性能較強的PDLSCs膜片三維聚合體和3層復合膜片，但在脂肪來源MSCs向內皮分化過程中，未檢測到CD31的表達，有待進一步研究。Hasegawa等[32]將人牙周膜細胞膜片移植至免疫缺陷大鼠的牙周缺損區，4周后觀察到牙本質表面均有新生纖維斜插入其中，且纖維另一端有薄層牙骨質樣硬組織形成，表明CST可用于牙周組織的再生。Iwata等[33]采用乙醇酸編織片作載體，將3層犬牙周膜細胞膜片重疊后植于牙周缺損的牙根表面，周圍用多孔β-磷酸三鈣充填，觀察到缺損區有新生骨和牙骨質，并有定向排列的膠原纖維連接；表明牙周膜細胞膜片可重建牙周組織的軟、硬組織，具有良好力學特性，更接近于正常組織。還有其他研究結果均顯示CST在牙周組織再生中具有重要作用[34-36]。
4.2 應用CST構建口腔黏膜修復軟組織缺損
目前對于黏膜缺損的修復基本采用皮膚移植或口腔黏膜移植方法，但存在以下問題：可供移植的黏膜瓣或同源性皮片來源有限；增加第2術區疼痛和感染；皮膚移植后不會轉化為口腔黏膜，在外觀及分泌、潤滑、咀嚼等功能方面與正常口腔黏膜有很大差距，不能滿足臨床需要。近年有研究以CST為基礎，通過同種或異種細胞膜片疊加、細胞膜片結合支架以及細胞膜片折疊等方法成功構建了三維結構的口腔黏膜組織[37]。應用體外培養的黏膜角化上皮細胞膜片進行先天性顎裂修補，可有效解決顎裂成形治療后因顎黏膜組織量不足而導致的瘢痕攣縮、骨面暴露和頜骨發育受限的問題[38]。李宏衛等[39]應用傳統組織工程方法制備了口腔黏膜組織，并臨床修復7例口腔良性腫瘤患者切除術后口內黏膜缺損；結果顯示組織工程口腔黏膜與創面生長良好，但存在種子細胞損失較多、細胞間基質缺乏、操作性較差等缺點。宋慶高[38]應用轉染γ-干擾素的口腔黏膜細胞膜片修復3周齡SD大鼠裸露硬腭，結果表明，細胞膜片的修復對于預防上頜骨繼發畸形有積極意義。采用CST構建口腔黏膜細胞膜片用于修復口腔腫瘤切除術后缺損，可明顯促進局部黏膜角化上皮修復和頜骨再生，抑制瘢痕形成。體外培養的口腔黏膜上皮細胞較皮膚表皮細胞增殖能力高，更適宜作為體內組織缺損修復的細胞來源，研究者們還將口腔黏膜細胞片成功應用于其他組織器官修復。如將口腔黏膜分離的上皮干細胞作為種子細胞，與3T3細胞復合培養形成多層細胞膜片，用于角膜、食管潰瘍、尿道組織缺損的修復。結果顯示，膜片修復的組織無需使用載體材料，提高了角膜的透光性；移植的細胞片層和受區基質直接接觸，可加速創口愈合，降低炎性反應，并顯示良好功能[40-44]。
4.3 應用CST構建骨組織修復頜面部骨缺損
腫瘤、外傷、畸形是導致頜面部骨和牙槽骨缺損的主要原因，研究合適的骨缺損修復材料對頜面部的結構、功能、面部形態的恢復尤為重要。傳統組織工程方法是將細胞直接接種至支架材料，存在細胞利用率低、附著效率差、分布不均勻的缺點。CST通過形成多層或混合細胞膜片疊加，不斷產生細胞外基質，最終形成細胞-基質聚集體，并與傳統支架塑形方法相結合，在組織工程骨構建方面表現出巨大潛力[3-4]。Chen等[45]制備了犬BMSCs細胞膜片，并以含富血小板血漿的犬脫鈣骨為基質，將二者構成細胞-基質聚集體植入犬左側背闊肌深面，其成骨效果明顯優于不加細胞膜片的組織工程骨。姚超等[46]應用BMSCs細胞膜片包裹含有重組人BMP-2、VEGF生長因子的聚乳酸羥基乙酸共聚物支架表面，成功構建組織工程骨并修復犬下頜骨缺損；結果顯示新生骨血管豐富、硬度良好，既有密質骨也有松質骨成分，為頜面部骨組織缺損修復提供了良好的組織來源。
隨著生物相容性材料的發展，口腔種植技術已成為牙缺失及顏面部缺損患者最理想的義齒修復及固位方式。種植體與頜骨形成良好的骨結合是種植體成功最重要的因素，良好的骨結合要求負載咬合力的種植體表面與有活力的骨組織之間存在結構和功能上的直接聯系，種植體與骨組織之間不間隔任何組織，CST對促進種植體周圍骨結合的形成具有重要意義[47-48]。于淼[49]應用CST構建2型糖尿病大鼠BMSCs組織工程種植體，結果顯示包裹種植體的細胞膜片具有良好活力，能分泌大量細胞外基質，并形成礦質小球。BMSCs細胞膜片與種植體的整合顯示了良好的生物活性及成骨能力，可成為提高系統性疾病患者種植體骨結合的新方法。然而，種植體骨結合并不是最理想的愈合方式，與天然牙相比，骨整合種植體由于缺乏牙周膜這一特殊生理結構，種植體缺乏應力緩沖結構和天然免疫封閉區，不是真正意義的生物整合種植體，易發生骨組織慢性應力疲勞和種植體周圍炎。多年來，學者們對種植體的牙周膜再生進行了相關研究，先后研究了PDLSCs與種植體純鈦表面的相互作用，可形成牙骨質層、骨、膠原纖維結構[50-53]。各研究均提示構建種植體周圍類似天然牙的牙周韌帶可行。鑒于CST在構建牙周膜組織再生中展示了較傳統組織工程更大的優勢，Huang等[54]提出了利用CST能有效促進種植體牙周膜再生的假說，目前尚未見相關研究。
綜上述，CST克服了傳統組織工程技術的不足，在口腔組織工程中具有廣闊應用前景。但目前尚處于實驗室研究階段，缺乏臨床觀察，仍存在一些問題亟待解決，如種子細胞較難獲得；疊加的細胞膜片超過一定厚度時，會因為氧氣和營養供應障礙導致內部細胞壞死；構建較大體積、較高強度的組織器官仍是該技術面臨的難題。隨著科學技術的不斷發展，CST與傳統組織工程技術相結合，經不斷完善和創新，有望加速口腔組織工程學的發展，為患者提供更多更好的治療手段。