引用本文： 張海峰, 韓冬. 體內生物反應器在骨組織工程血管化中的研究進展. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(9): 1173-1176. doi: 10.7507/1002-1892.20140253 復制
目前，骨組織工程發展存在大塊骨移植難以成活的問題，解決問題的關鍵是組織工程骨血管化。組織工程骨植入體內后，早期所需氧供和營養物質主要來自組織滲透以及血液黏附，但僅限于200 μm范圍內[1]，超過該范圍細胞只能通過重建血運系統獲得營養物質[2]。提示組織工程骨植入體內后如短期內未新生大量血管，細胞將面臨死亡。隨著組織工程學的發展及骨誘導性生物材料異位成骨現象機制研究的深入，學者們發現在生物體內某些特定的組織或器官空間內，如骨膜下、肌肉、腹膜腔、脂肪、皮下等，具有某些特定功能（如異位成骨），他們將這些具有特定功能的空間稱為“體內生物反應器”。與經典的使用生長因子方法相比，采用體內生物反應器能顯著提高組織工程骨在短期內血管化成功率，血管化速度相對較快，血管新生效果明顯[3-6]。而且，采用體內生物反應器形成的血管化組織工程骨能夠通過顯微外科方法修復異位骨缺損，骨移植方法相對簡便、有效[7]。因此，采用體內生物反應器在種植細胞的支架上形成宿主樣血管，構建血管化組織工程骨成為研究熱點[8]。現就體內生物反應器在骨組織工程血管化中的研究進展作一綜述。
1 骨膜構建體內生物反應器
骨膜是骨組織血供主要來源，富含多核潛能干細胞，這些細胞能被激活、增殖、分化為成骨細胞，能傳遞新生骨所需的生物分子信號。通過骨膜包繞體內組織或生物材料形成一定空間，構建體內生物反應器的方法，已廣泛應用于醫學研究。Patel等[9]通過測量頭顳部皮瓣可切取范圍，提出頭顳部皮瓣以及頭皮下骨膜能滿足下頜骨缺損修復需要，并能為下頜骨處的骨組織提供血供，他們認為體內生物反應器的使用有利于下頜骨的修復重建。Han等[10]使用脛骨骨膜、大隱動靜脈以及β-磷酸三鈣（β-tricalcium phosphate，β-TCP）成功構建了體內生物反應器，通過觀測支架中新生血管及新生血管內VEGF表達情況，發現β-TCP支架中央的新生血管與外周脛骨骨膜血管相連，并在支架內形成血管網；VEGF主要在新生編織骨及成熟骨組織中表達。該研究結果提示通過骨膜構建體內生物反應器并植入血管束的方法，能顯著促進微血管的血液灌注，有利于血管新生。
Stevens等[11]利用兔脛骨骨膜和脛骨間的空間腔隙（為防止空間塌陷注入生物相容性海藻酸鈣）作為體內生物反應器，構建血管化組織工程骨，并將制備的組織工程骨移植修復對側脛骨缺損；結果顯示骨缺損完全修復，并且在生物受力方面恢復至缺損前狀態。但Stevens等同時指出在該空間腔隙內通過抑制血管生成并形成一缺氧環境，具有顯著促進軟骨和骨生成的作用。Service[12]也對骨膜與骨間腔隙所構成的體內生物反應器進行了評價，認為該方法能促進新骨形成，與Stevens等[11]結論一致。
2 肌肉構建體內生物反應器
目前，以肌肉作為體內生物反應器的研究中，應用較多的是背闊肌和胸大肌。以背闊肌構建體內生物反應器，具有以下優點：所含細胞數量多以及血管豐富，有利于組織工程骨血管化[13]；其為扁平狀肌肉，面積較大且血管相對容易定位，術中血管蒂制備簡便[14]。Casabona等[15]將人BMSCs-多孔陶瓷支架復合物植入小鼠背闊肌，8周后支架外周及中央均可見大量血管生長，新生骨機械強度能滿足自身應力需要。Kokemueller等[16]使用TCP支架及胸背動脈中央血管束在羊背闊肌內預構血管化組織工程骨，結果表明該方法能促進骨生長及血管新生。之后他們通過以羊背闊肌構建體內生物反應器及聯合植入胸背動脈軸向血管提供血供的方法，探討制備特定形狀組織工程骨并修復頭面部骨缺損的可行性；組織學觀察示支架材料內部形成高血管化纖維組織，表明體內生物反應器內的軸向血管有利于構建具有相對穩定血管化的組織工程骨[17]。此外，也有學者于豬背闊肌內構建體內生物反應器，制備血管化組織工程骨，并成功修復豬下頜骨缺損[14, 18-19]。
隨著動物實驗的成功，學者們進行了臨床試驗。Warnke等[20-21]收治1例56歲因口底癌行下頜骨次全切除手術的患者，通過在背闊肌下放置包裹骨礦塊的鈦網，待骨誘導成功后切取骨肌皮瓣修復下頜骨缺損。骨礦塊植入背闊肌4周后骨顯像檢查提示骨誘導成功，7周后將帶有胸背動、靜脈的骨肌皮瓣移植修復下頜骨缺損；移植后11 d骨顯像檢查示移植骨連續塑形和礦化，提示新生血管血液灌注良好，4周后患者恢復了部分咀嚼功能。該研究表明以肌肉作為體內生物反應器形成血管化骨組織方法應用于頜面外科切實可行。Heliotis等[22]收治1例60歲因口腔鱗狀上皮癌行舌、下頜以及頸部大面積切除手術患者，以胸大肌作為體內生物反應器，經6個月成功構建血管化組織工程骨并移植修復下頜部缺損。盡管移植后5個月因細菌感染手術失敗，但該研究驗證了以胸大肌作為體內生物反應器的可行性。
針對以人體自身作為體內生物反應器的成功預構，MacArthur等[23]提出使用數學模型方法，根據實際缺損大小構建組織工程骨，以促進組織工程骨早日個體化治療的應用。
3 肌層膜構建體內生物反應器
Han等[7]研究了肌層膜構建體內生物反應器的可行性，首先于新西蘭兔后肢分離大隱動、靜脈，獲取自體肌層膜，將隱血管束嵌入肌層膜內，最后將復合單純BMSCs或BMP-2基因修飾的BMSCs的TCP支架植入膜內。4周后復合BMP-2基因修飾的BMSCs支架上可見新生板層骨周圍有血管形成，且新生血管密度顯著高于復合單純BMSCs支架。該研究表明由肌層膜構建體內生物反應器的方法在促進新骨形成同時，也促進了骨血管新生。
4 筋膜瓣構建體內生物反應器
由于帶蒂筋膜瓣具有血管網豐富以及蒂部位置不受動脈血流方向限制等優點，臨床常用其包裹缺血組織，以促進組織建立血循環，該技術為組織工程骨血管化提供了參考。陳濱等[24]以帶蒂筋膜瓣包裹復合經成骨誘導分化的BMSCs的珊瑚羥基磷灰石，觀察組織工程骨血管化程度。12周后組織學檢查表明筋膜瓣對組織工程骨體內血管化過程有明顯促進作用，支架中新生血管分布均勻，中央種子細胞也可獲取營養物質，為組織工程骨成活奠定了基礎。王耀一等[25]使用帶蒂筋膜瓣包裹組織工程骨修復骨缺損，各時間點組織學觀察其對組織工程骨血管化以及成骨作用影響，結果表明帶蒂筋膜瓣具有顯著促進組織工程骨血管化作用。金丹等[26]的研究也表明筋膜瓣可提供可靠的血供來源，用其構建體內生物反應器能加速組織工程骨修復骨缺損的過程。
5 生物材料構建體內生物反應器
除以自身器官作為體內生物反應器外，也可以使用生物材料在體內構建生物反應器，例如多孔鈦網、多孔陶瓷盒子[27]、硅材料等。目前以硅材料構建體內生物反應器研究較多。Tomin等[28]將由硅聚合物制造的骨反應器小盒子植入大鼠腹股溝組織間隙內，構建血管化骨移植物。結果表明新生骨形成需要聯合使用骨髓細胞、骨誘導信號分子重組人BMP-2以及血管束，但不需要骨傳導基質材料。該研究同時指出，一條開放的血管對促進骨生長和保持骨生物反應器成骨活力具有重要意義。Holt等[8]將大鼠腹壁淺血管分離后結扎，并使用圓形珊瑚材料環繞其血管周圍，最外層以硅膠套包繞進而構成體內生物反應器，結果顯示在腹壁淺血管外周見到新生血管以及骨組織生長，6周后支架橫截面的中央和外周新生骨呈指狀突起，在支架切片4個象限觀察到新生小血管并且向外周生長。在該研究中，硅膠套的主要作用是形成封閉環境阻止外源性纖維長入新生骨，為新生骨的生長提供適宜環境。由此可見，使用生物材料在體內構建生物反應器也能促進組織工程骨血管化。
6 總結與展望
綜上述，體內生物反應器具有促進組織工程骨血管化作用，為解決當前所面臨的血管化問題提供了新思路。然而，使用肌肉、骨膜、腹膜等組織構建體內生物反應器均面臨二次手術問題，對機體有一定損傷，但與傳統骨缺損修復金標準自體骨移植相比，手術創傷明顯減小，而且不會導致供區缺損和畸形[29]。隨著對體內生物反應器研究的進一步深入以及對生物材料、細胞及生長因子相關機制的不斷探討，體內生物反應器將會在骨組織工程中展現更廣泛的應用前景。
目前，骨組織工程發展存在大塊骨移植難以成活的問題，解決問題的關鍵是組織工程骨血管化。組織工程骨植入體內后，早期所需氧供和營養物質主要來自組織滲透以及血液黏附，但僅限于200 μm范圍內[1]，超過該范圍細胞只能通過重建血運系統獲得營養物質[2]。提示組織工程骨植入體內后如短期內未新生大量血管，細胞將面臨死亡。隨著組織工程學的發展及骨誘導性生物材料異位成骨現象機制研究的深入，學者們發現在生物體內某些特定的組織或器官空間內，如骨膜下、肌肉、腹膜腔、脂肪、皮下等，具有某些特定功能（如異位成骨），他們將這些具有特定功能的空間稱為“體內生物反應器”。與經典的使用生長因子方法相比，采用體內生物反應器能顯著提高組織工程骨在短期內血管化成功率，血管化速度相對較快，血管新生效果明顯[3-6]。而且，采用體內生物反應器形成的血管化組織工程骨能夠通過顯微外科方法修復異位骨缺損，骨移植方法相對簡便、有效[7]。因此，采用體內生物反應器在種植細胞的支架上形成宿主樣血管，構建血管化組織工程骨成為研究熱點[8]。現就體內生物反應器在骨組織工程血管化中的研究進展作一綜述。
1 骨膜構建體內生物反應器
骨膜是骨組織血供主要來源，富含多核潛能干細胞，這些細胞能被激活、增殖、分化為成骨細胞，能傳遞新生骨所需的生物分子信號。通過骨膜包繞體內組織或生物材料形成一定空間，構建體內生物反應器的方法，已廣泛應用于醫學研究。Patel等[9]通過測量頭顳部皮瓣可切取范圍，提出頭顳部皮瓣以及頭皮下骨膜能滿足下頜骨缺損修復需要，并能為下頜骨處的骨組織提供血供，他們認為體內生物反應器的使用有利于下頜骨的修復重建。Han等[10]使用脛骨骨膜、大隱動靜脈以及β-磷酸三鈣（β-tricalcium phosphate，β-TCP）成功構建了體內生物反應器，通過觀測支架中新生血管及新生血管內VEGF表達情況，發現β-TCP支架中央的新生血管與外周脛骨骨膜血管相連，并在支架內形成血管網；VEGF主要在新生編織骨及成熟骨組織中表達。該研究結果提示通過骨膜構建體內生物反應器并植入血管束的方法，能顯著促進微血管的血液灌注，有利于血管新生。
Stevens等[11]利用兔脛骨骨膜和脛骨間的空間腔隙（為防止空間塌陷注入生物相容性海藻酸鈣）作為體內生物反應器，構建血管化組織工程骨，并將制備的組織工程骨移植修復對側脛骨缺損；結果顯示骨缺損完全修復，并且在生物受力方面恢復至缺損前狀態。但Stevens等同時指出在該空間腔隙內通過抑制血管生成并形成一缺氧環境，具有顯著促進軟骨和骨生成的作用。Service[12]也對骨膜與骨間腔隙所構成的體內生物反應器進行了評價，認為該方法能促進新骨形成，與Stevens等[11]結論一致。
2 肌肉構建體內生物反應器
目前，以肌肉作為體內生物反應器的研究中，應用較多的是背闊肌和胸大肌。以背闊肌構建體內生物反應器，具有以下優點：所含細胞數量多以及血管豐富，有利于組織工程骨血管化[13]；其為扁平狀肌肉，面積較大且血管相對容易定位，術中血管蒂制備簡便[14]。Casabona等[15]將人BMSCs-多孔陶瓷支架復合物植入小鼠背闊肌，8周后支架外周及中央均可見大量血管生長，新生骨機械強度能滿足自身應力需要。Kokemueller等[16]使用TCP支架及胸背動脈中央血管束在羊背闊肌內預構血管化組織工程骨，結果表明該方法能促進骨生長及血管新生。之后他們通過以羊背闊肌構建體內生物反應器及聯合植入胸背動脈軸向血管提供血供的方法，探討制備特定形狀組織工程骨并修復頭面部骨缺損的可行性；組織學觀察示支架材料內部形成高血管化纖維組織，表明體內生物反應器內的軸向血管有利于構建具有相對穩定血管化的組織工程骨[17]。此外，也有學者于豬背闊肌內構建體內生物反應器，制備血管化組織工程骨，并成功修復豬下頜骨缺損[14, 18-19]。
隨著動物實驗的成功，學者們進行了臨床試驗。Warnke等[20-21]收治1例56歲因口底癌行下頜骨次全切除手術的患者，通過在背闊肌下放置包裹骨礦塊的鈦網，待骨誘導成功后切取骨肌皮瓣修復下頜骨缺損。骨礦塊植入背闊肌4周后骨顯像檢查提示骨誘導成功，7周后將帶有胸背動、靜脈的骨肌皮瓣移植修復下頜骨缺損；移植后11 d骨顯像檢查示移植骨連續塑形和礦化，提示新生血管血液灌注良好，4周后患者恢復了部分咀嚼功能。該研究表明以肌肉作為體內生物反應器形成血管化骨組織方法應用于頜面外科切實可行。Heliotis等[22]收治1例60歲因口腔鱗狀上皮癌行舌、下頜以及頸部大面積切除手術患者，以胸大肌作為體內生物反應器，經6個月成功構建血管化組織工程骨并移植修復下頜部缺損。盡管移植后5個月因細菌感染手術失敗，但該研究驗證了以胸大肌作為體內生物反應器的可行性。
針對以人體自身作為體內生物反應器的成功預構，MacArthur等[23]提出使用數學模型方法，根據實際缺損大小構建組織工程骨，以促進組織工程骨早日個體化治療的應用。
3 肌層膜構建體內生物反應器
Han等[7]研究了肌層膜構建體內生物反應器的可行性，首先于新西蘭兔后肢分離大隱動、靜脈，獲取自體肌層膜，將隱血管束嵌入肌層膜內，最后將復合單純BMSCs或BMP-2基因修飾的BMSCs的TCP支架植入膜內。4周后復合BMP-2基因修飾的BMSCs支架上可見新生板層骨周圍有血管形成，且新生血管密度顯著高于復合單純BMSCs支架。該研究表明由肌層膜構建體內生物反應器的方法在促進新骨形成同時，也促進了骨血管新生。
4 筋膜瓣構建體內生物反應器
由于帶蒂筋膜瓣具有血管網豐富以及蒂部位置不受動脈血流方向限制等優點，臨床常用其包裹缺血組織，以促進組織建立血循環，該技術為組織工程骨血管化提供了參考。陳濱等[24]以帶蒂筋膜瓣包裹復合經成骨誘導分化的BMSCs的珊瑚羥基磷灰石，觀察組織工程骨血管化程度。12周后組織學檢查表明筋膜瓣對組織工程骨體內血管化過程有明顯促進作用，支架中新生血管分布均勻，中央種子細胞也可獲取營養物質，為組織工程骨成活奠定了基礎。王耀一等[25]使用帶蒂筋膜瓣包裹組織工程骨修復骨缺損，各時間點組織學觀察其對組織工程骨血管化以及成骨作用影響，結果表明帶蒂筋膜瓣具有顯著促進組織工程骨血管化作用。金丹等[26]的研究也表明筋膜瓣可提供可靠的血供來源，用其構建體內生物反應器能加速組織工程骨修復骨缺損的過程。
5 生物材料構建體內生物反應器
除以自身器官作為體內生物反應器外，也可以使用生物材料在體內構建生物反應器，例如多孔鈦網、多孔陶瓷盒子[27]、硅材料等。目前以硅材料構建體內生物反應器研究較多。Tomin等[28]將由硅聚合物制造的骨反應器小盒子植入大鼠腹股溝組織間隙內，構建血管化骨移植物。結果表明新生骨形成需要聯合使用骨髓細胞、骨誘導信號分子重組人BMP-2以及血管束，但不需要骨傳導基質材料。該研究同時指出，一條開放的血管對促進骨生長和保持骨生物反應器成骨活力具有重要意義。Holt等[8]將大鼠腹壁淺血管分離后結扎，并使用圓形珊瑚材料環繞其血管周圍，最外層以硅膠套包繞進而構成體內生物反應器，結果顯示在腹壁淺血管外周見到新生血管以及骨組織生長，6周后支架橫截面的中央和外周新生骨呈指狀突起，在支架切片4個象限觀察到新生小血管并且向外周生長。在該研究中，硅膠套的主要作用是形成封閉環境阻止外源性纖維長入新生骨，為新生骨的生長提供適宜環境。由此可見，使用生物材料在體內構建生物反應器也能促進組織工程骨血管化。
6 總結與展望
綜上述，體內生物反應器具有促進組織工程骨血管化作用，為解決當前所面臨的血管化問題提供了新思路。然而，使用肌肉、骨膜、腹膜等組織構建體內生物反應器均面臨二次手術問題，對機體有一定損傷，但與傳統骨缺損修復金標準自體骨移植相比，手術創傷明顯減小，而且不會導致供區缺損和畸形[29]。隨著對體內生物反應器研究的進一步深入以及對生物材料、細胞及生長因子相關機制的不斷探討，體內生物反應器將會在骨組織工程中展現更廣泛的應用前景。