目的觀察人臍帶間充質干細胞(hUCMSC)對糖尿病(DM)大鼠血糖的影響及對視網膜病變的治療作用。 方法健康雄性Sprague-Dawley大鼠45只, 隨機分為正常對照組(A組)、DM組, 分別為10、35只大鼠。DM組經尾靜脈注射鏈脲佐菌素誘導DM模型。10周時, A組、DM組分別隨機選取2只大鼠行視網膜血管鋪片。DM組剩余的33只大鼠隨機分為糖尿病視網膜病變組(B組)、尾靜脈注射hUCMSC組(C組)、玻璃體腔注射hUCMSC組(D組), 各組均為11只大鼠。A、B組不進行干預。干預后2、4、6、8周為觀察處理時間點。各處理時間點前, 連續3 d每次隨機選取2只大鼠檢測隨機血糖。DM組大鼠血糖與同期A組大鼠血糖比較, 差異均有統計學意義(t=-64.400、-60.601、-44.065、-43.872, P=0.000)。8周時從B、C、D組隨機選取2只大鼠行視網膜血管鋪片。免疫組織化學法觀察視網膜腦源性神經營養因子(BDNF)陽性染色情況; 實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測視網膜BDNF mRNA相對表達量。 結果干預后, 不同處理時間點A、B、C、D組大鼠血糖比較, 差異均有統計學意義(F=400.017、404.410、422.043、344.109, P=0.000);C組大鼠血糖與B、D組大鼠血糖比較, 差異有統計學意義(t=4.447、4.990、P＜0.01)。免疫組織化學染色結果顯示, A組BDNF表達呈陽性, 主要分布在神經節細胞層; B組BDNF表達呈弱陽性; C、D組BDNF表達增多。RT-PCR檢測結果顯示, 4、6、8周時, B、C、D組間視網膜BDNF mRNA相對表達量比較, 差異均有統計學意義(F=29.372、188.492、421.537, P=0.000);C、D組視網膜BDNF mRNA相對表達量與B組比較, 差異均有統計學意義(t=66.781、72.401、63.880、88.423、75.120、83.002, P＜0.01);C組視網膜BDNF mRNA相對表達量與D組比較, 僅8周時差異有統計學意義(t=127.321, P=0.005)。 結論尾靜脈注射hUCMSC能夠顯著降低大鼠血糖水平; 尾靜脈或玻璃體腔注射hUCMSC均可增加BDNF的表達。
目的 觀察缺氧誘導因子-1alpha;(HIF-1alpha;)特異性小干擾RNA（siRNA）對糖尿病大鼠視網膜組織中血管內皮生長因子（VEGF）mRNA表達的抑制作用。方法 隨機對照研究。以pSilencer 2.1-U6neo 為質粒載體，構建HIF-1alpha; siRNA 重組質粒。雄性Sprague-Dawley大鼠54只，隨機分為正常對照組和實驗組，分別為15、39只大鼠。實驗組大鼠尾靜脈注射鏈尿佐菌素（STZ）誘導建立糖尿病動物模型，再分為糖尿病模型組、空載體組和基因治療組，分別為15、12、12只大鼠。脂質體LipofectamineTM 2000介導，空載體組和基因治療組分別轉染pSilencer空載體質粒和HIF-1alpha;siRNA 重組質粒，糖尿病模型組和正常組對照組不做轉染。采用實時逆轉錄（RT）聚合酶鏈式反應（PCR）檢測各組大鼠VEGF mRNA的表達。分別于干擾后24、48、72 h，1周時計算VEGF mRNA的抑制效率。采用單因素方差分析和LSD-t檢驗進行統計學分析。結果 HIF-1alpha; siRNA 重組質粒經酶切、測序鑒定，確定為目的序列。實時 RT-PCR檢測結果顯示，正常對照組僅見弱的VEGF mRNA表達，糖尿病模型組及空載體組表達明顯上調，基因治療組表達下調；各時間點空載體組與糖尿病模型組比較，差異無統計學意義（t=0.669，0.142,0.151，0.025；P=0.514，0.889，0.882，0.980)，基因治療組較糖尿病模型組及空載體組表達下調，差異有統計學意義(t=8.768、13.695、11.285、8.253，t=9.437、13.554、11.436、8.228;P值均=0.000)；VEGF mRNA抑制率24、48、72 h和1周時分別為32.76%、43.60%、47.70%、50.86%。結論 HIF-1alpha; siRNA 重組質粒能有效抑制糖尿病大鼠視網膜中VEGFmRNA的表達。
目的觀察人臍帶間充質干細胞（hUCMSC）外泌體對藍光損傷后人視網膜色素上皮（RPE）細胞血管內皮生長因子A（VEGF-A）表達的影響。 方法培養hUCMSC，收集上清液，采取梯度超速離心法分離純化外泌體。應用透射電子顯微鏡觀察外泌體形態；蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測hUCMSC外泌體表面特異性標志蛋白CD63及hUCMSC表面蛋白CD90的表達。取生長良好的人RPE細胞，隨機分為正常對照組、光損傷組和hUCMSC外泌體處理組。光損傷組和hUCMSC外泌體處理組以藍光（2000±500）Lux照射RPE細胞12 h建立光損傷模型；hUCMSC外泌體處理組細胞培養液中分別加入25、50、75 μg/ml的hUCMSC外泌體，并以此分為低濃度、中濃度、高濃度3個亞組。各濃度亞組繼續培養8、16、24 h結束培養。采用Western blot及免疫熒光檢測各組RPE細胞VEGF-A蛋白表達，實時定量聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測各組RPE細胞VEGF-A mRNA表達。 結果透射電子顯微鏡觀察發現，hUCMSC外泌體為圓形或橢圓形膜性小囊泡，直徑50~100 nm。Western blot檢測結果顯示，hUCMSC外泌體表達外泌體表面特異性標志蛋白CD63及hUCMSC表面蛋白CD90。Western blot及RT-PCR檢測結果顯示，光損傷組RPE細胞VEGF-A蛋白及mRNA表達較正常對照組明顯增加，差異有統計學意義（t=-16.553、-19.456，P < 0.05）。hUCMSC外泌體處理組RPE細胞培養8、16、24 h時，低濃度、中濃度、高濃度亞組RPE細胞與光損傷組RPE細胞相比，VEGF-A蛋白及mRNA表達均有下降，差異均有統計學意義（P < 0.05）。隨hUCMSC外泌體作用時間延長及作用濃度增強，RPE細胞VEGF-A蛋白及mRNA下調作用越強（P < 0.05）。免疫熒光檢測結果顯示，相同作用時間隨著hUCMSC外泌體作用濃度提高，VEGF-A蛋白表達不斷下降。 結論hUCMSC外泌體能夠有效降低藍光損傷后人RPE細胞VEGF-A的表達，其效應與hUCMSC外泌體作用濃度、時間呈正相關。