引用本文： 何廣輝, 陳松, 馬映雪, 楊婧, 王健, 陳莉, 王玉川, 郝朋. 人臍帶間充質干細胞外泌體對藍光損傷人視網膜色素上皮細胞血管內皮生長因子A表達的影響. 中華眼底病雜志, 2016, 32(6): 605-610. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2016.06.010 復制
視網膜色素上皮(RPE)是成年人眼后節血管內皮生長因子(VEGF)生成的主要部位[1]。在老年性黃斑變性(AMD)的發病過程中，外層視網膜缺氧導致RPE細胞分泌VEGF增加是形成脈絡膜新生血管(CNV)的主要原因[2]。外泌體是一種活細胞分泌的直徑在50~100 nm之間的具有脂質雙分子層結構的微小囊泡，囊泡內含有與其分泌細胞相關的蛋白質、mRNA、miRNA、脂質及信號因子等[3]。外泌體可以在細胞間穿梭，將其內蛋白質及RNA帶到靶細胞，使靶細胞產生相應反應[4]。已有研究證實，間充質干細胞(MSC)可通過細胞轉化、分泌神經營養因子或調節炎性介質水平等方式對于某些視網膜疾病具有潛在治療作用[5, 6]。來源于MSC的外泌體對于腫瘤細胞具有明顯的抗VEGF作用，能夠明顯抑制體內及體外環境腫瘤細胞所致新生血管形成[7]。如能證實MSC外泌體對于類似AMD改變的RPE細胞具有明確的抗VEGF作用，將會為AMD的治療提供更多選擇。為此，本研究通過藍光誘導建立人RPE細胞光損傷模型模仿AMD損傷的RPE，觀察人臍帶MSC (hUCMSC)外泌體對藍光損傷后人RPE細胞VEGF-A蛋白和mRNA的影響，探討是否具有抗VEGF作用。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 實驗材料
hUCMSC由中國醫學科學院血液學研究所惠贈。人RPE細胞株ARPE-19細胞(美國ATCC公司)，MSC培養基(美國Sciencell公司)，Dulbecco改良Eagle (DMEM)培養基、胎牛血清(美國Gibco公司)，去外泌體胎牛血清(exo-FBS，美國SBI公司)，BioTrace?NT硝酸纖維素膜(美國Millipore公司)，Trizol RNA提取試劑盒(美國Invitrogen公司)，M-MLV逆轉錄酶、RNA酶抑制劑(日本Takara公司)，增強化學發光試劑盒(ECL，美國PerkinElmer公司)，噻唑藍(MTT，上海碧云天生物技術有限公司)，小鼠抗人CD63、CD90單克隆抗體(亞諾法生技股份有限公司)，VEGF-A一抗、二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒(沈陽萬類生物科技有限公司)，辣根過氧化物酶(HRP)標記二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司)，TES1332A數字照度計(中國臺灣泰仕電子工業股份有限公司)，20W醫用藍光燈管(上海電工儀器廠)，低溫超速離心機(美國Beckman公司)。
1.2 hUCMSC外泌體的提取與鑒定
hUCMSC用含10%胎牛血清的MSC培養基(含青霉素、鏈霉素各100 U/ml)，置于37℃、5%CO2培養箱中培養，每隔3~4天換液，待細胞長至培養瓶底80%~90%面積時，用0.25%胰蛋白酶進行細胞消化，傳代培養。取5~7代生長良好細胞，以含10% exo-FBS的培養液培養48 h后，收集培養上清液，2000×g離心30 min除去細胞碎片，再經0.45 μm無菌濾膜過濾到15 ml規格的超濾離心管中，4℃條件下1000×g離心70 min，得到外泌體濃縮液。將濃縮液移至15 ml超速離心管中，4℃條件下，100 000×g離心70 min，收集底部沉淀用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋后，再次100 000×g離心70 min，洗滌1次，最后將收集的外泌體濃縮液以0.22 μm濾膜過濾除菌，于-80℃冷藏備用。
按1：10的比例稀釋外泌體樣本，銅網蘸取少量稀釋后樣品，用鑷子將銅網放入3%磷鎢酸溶液中染色5 min加深背景，濾紙去除多余染色劑，采用透射電子顯微鏡觀察并拍攝照片。
參照文獻[7, 8]的方法，采用蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測hUCMSC外泌體表面特異性標志蛋白CD63及hUCMSC表面蛋白CD90的表達。將外泌體樣品與含有β-巰基乙醇的5倍上樣緩沖液混合后，煮沸變性5 min，冰浴5 min。取30 μg蛋白樣品上樣進行十二烷基磺酸鈉(SDS)變性，10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳至目的蛋白有效分離。轉膜，脫脂奶粉封閉。將膜置于含對應小鼠抗人CD63及CD90單克隆抗體的蛋白免疫雜交封閉(Blotto)溶液中，搖床上4℃輕輕搖動過夜。洗膜緩沖液洗滌后，將膜浸入含相應HRP標記二抗的Blotto溶液中，室溫輕輕搖動2 h。最后用ECL試劑盒檢測，顯影。以磷酸甘油醛脫氫酶(GADPH)為參照。
1.3 RPE細胞光損傷模型建立及實驗分組
ARPE-19細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養液(含青霉素、鏈霉素各100 U/ml)置于37℃、5% CO2培養箱中培養，每2天換液，細胞將近鋪滿時以0.25%胰蛋白酶消化并按1：2進行傳代，取第6~10代生長良好細胞用于實驗。同代生長良好的細胞融合至80%~90%時，隨機將細胞分為正常對照組、光損傷組、hUCMSC外泌體處理組。將波長為425~475 nm的20W醫用藍光燈管自制為光照器，懸掛于37℃恒溫培養箱頂部，調整光源與細胞培養瓶之間距離。照度計檢測同一被照平面細胞光照度為(2000±500) Lux。光照時該水平溫度變化在36.5~37.5℃，密閉恒溫箱內確保無自然光干擾。正常對照組細胞培養瓶用遮光錫紙遮蓋，置于恒溫箱內36 h結束培養。光損傷組在持續光照12 h后停止光照，并繼續培養24 h后結束培養。hUCMSC外泌體處理組在持續光照12 h后停止光照，細胞培養液中分別加入25、50、75 μg/ml的hUCMSC外泌體，并以此分為低濃度、中濃度、高濃度3個亞組。各濃度亞組繼續培養8、16、24 h結束培養[9]。
1.4 Western blot、實時定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)及免疫熒光檢測VEGF-A表達
采用Western blot檢測各組RPE細胞VEGF-A蛋白表達。細胞培養結束后徹底棄凈培養液，1 ml PBS浸洗細胞1遍并吸棄。用1 ml RIPA裂解液重懸，冰上作用30 min，其間不時搖動，然后吹打細胞，收集裂解后的細胞碎片及釋放出的蛋白，-80℃保存。
采用RT-PCR檢測各組RPE細胞VEGF-A mRNA表達。按照Trizol試劑盒說明書提取細胞總RNA，-80℃保存。運用Premier 5.0軟件設計上下游引物。VEGF-A：上游引物5′-GGCTGTTCTCGCT TCG-3′，下游引物5′ -TGTCCACCAGGGTCTCG-3′，擴增片段長度544堿基對(bp)。內參β-管蛋白(tublin)：上游引物5′-ATCCCATCACCATCTTCC-3′，下游引物5′-ATCACGCCACAGTTTCC-3′，擴增片段長度380 bp。按RT-PCR試劑盒說明書配制逆轉錄體系，條件為50℃ 30 min。配制聚合酶鏈反應(PCR)反應體系:總RNA 50 ng、5倍RNA探針緩沖液10 μl、25 mmol/L MgCl2 6 μl、10 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸5 μl、5 U/μl的逆轉錄DNA聚合酶1 μl、VEGF上游引物各1 μl，加焦碳酸二乙酯水至50 μl。反應條件為94℃ 30 s，62℃ 30 s，72℃ 1 min，重復30個循環。PCR產物1%瓊脂糖凝膠電泳30 min，紫外燈下觀察DNA條帶并拍照。采用sensiAnsys凝膠圖像分析軟件分析PCR產物。以VEGF-A條帶吸光度[A，舊稱光密度(OD)]值與β-tublin條帶A值的比值表示VEGF-A mRNA表達。
采用免疫熒光檢測各組RPE細胞VEGF-A蛋白表達。將正常對照組、光損傷組細胞及不同濃度hUCMSC外泌體干預16 h的細胞分別用無菌蓋玻片放置于6孔培養板中，將經過計數的細胞懸浮液移入培養板，使蓋玻片完全浸在培養液中，用預溫的1倍PBS洗3次。4%甲醛室溫固定20 min，0.2%聚乙二醇辛基苯基醚透化5 min，5%牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉30 min，加入1%BSA稀釋的抗VEGF-A一抗放在濕盒4℃過夜。加入1%BSA稀釋的二抗，閉光孵育120 min。95%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。
1.5 統計學分析
采用SPSS 19.0統計軟件進行統計學分析，實驗數據用均數±標準差(x±s)表示。組間比較采用方差分析。方差齊性時組間兩兩比較采用最小顯著差法，方差不齊時采用Dunnet t檢驗。P < 0.05為差異有統計學意義。
2 結果
透射電子顯微鏡觀察發現，hUCMSC外泌體為圓形或橢圓形膜性小囊泡，直徑50~100 nm，囊泡內存在低電子密度成分(圖 1)。Western blot檢測結果顯示，hUCMSC外泌體表達外泌體表面特異性標志蛋白CD63及hUCMSC表面蛋白CD90(圖 2)。
圖1
hUCMSC外泌體透射電子顯微鏡像。可見hUCMSC外泌體呈圓形或橢圓形膜性小囊泡，囊泡內存在低電子密度成分??圖 2? hUCMSC外泌體表面標志物CD63及CD90 Western blot檢測像。2A.CD63；2B.CD90
Western blot檢測結果顯示，光損傷組RPE細胞VEGF-A蛋白表達較正常對照組明顯增加，差異有統計學意義(t=-16.553，P < 0.05)。hUCMSC外泌體處理組RPE細胞培養8、16、24 h時，低濃度(t=2.945、4.477、6.657)、中濃度(t=4.713、6.421、8.836)、高濃度(t=6.539、12.194、12.783)亞組RPE細胞VEGF-A蛋白表達較光損傷組均下降，差異有統計學意義(P < 0.05)(圖 3)。hUCMSC外泌體處理組組內比較，相同濃度條件下，不同細胞培養時間的VEGF-A蛋白表達間差異均有統計學意義(F=3.980、11.148、45.496，P < 0.05)；相同細胞培養時間下，不同濃度的VEGF-A蛋白表達間差異均有統計學意義(F=5.306、29.989、25.724，P < 0.05)。
圖3
各組RPE細胞VEGF-A蛋白表達比較。*與正常對照組比較，P < 0.05；#與光損傷組比較，P < 0.05
RT-PCR檢測結果顯示，光損傷組RPE細胞VEGF-A mRNA表達較正常對照組明顯增加，差異有統計學意義(t=-19.456，P < 0.05)。hUCMSC外泌體處理組RPE細胞培養8、16、24 h時，低濃度(t=6.485、7.959、9.286)、中濃度(t=7.517、10.170、13.413)、高濃度(t=10.317、12.234、14.592)亞組RPE細胞VEGF-A mRNA表達較光損傷組均下降，差異有統計學意義(P < 0.05)(圖 4)。hUCMSC外泌體處理組組內比較，相同濃度條件下，不同細胞培養時間的VEGF-A mRNA表達間差異均有統計學意義(F=3.706、17.693、10.729，P < 0.05)；相同細胞培養時間下，不同濃度的VEGF-A mRNA表達間差異均有統計學意義(F=6.478、8.872、23.704，P < 0.05)。
圖4
各組RPE細胞VEGF-A mRNA表達比較。*與正常對照組比較，P < 0.05；#與光損傷組比較，P < 0.05
免疫熒光檢測結果顯示，光損傷組RPE細胞VEGF-A蛋白表達明顯強于正常對照組；隨著作用濃度提高，hUCMSC外泌體處理組VEGF-A蛋白表達呈明顯下降趨勢(圖 5)。
圖5
各組RPE細胞VEGF-A蛋白表達熒光顯微鏡像。5A.正常對照組；5B.光損傷組；5C.hUCMSC外泌體處理組低濃度亞組；5D.hUCMSC外泌體處理組中濃度亞組；5E.hUCMSC外泌體處理組高濃度亞組。光損傷組RPE細胞VEGF-A表達明顯強于正常對
3 討論
視網膜外層光感受器代謝主要依靠RPE細胞完成，缺氧以及長時間光照會激發針對RPE細胞氧化應激反應引起代謝異常，導致RPE細胞內脂褐素沉積及細胞外玻璃膜疣形成[10]。而玻璃膜疣中的糖基化終產物(AGE)可以與進展期AMD的RPE細胞及脈絡膜毛細血管中的AGE受體相結合，誘導RPE細胞中VEGF表達和分泌，從而激發CNV形成[11]。近年來國內外研究證實，通過藍光誘導損傷后的RPE細胞可促進VEGF分泌，與AMD長期慢性光損傷所引起的RPE細胞結構和功能變化類似[9, 12]。因此，我們選擇了藍光照射培養ARPE-19細胞制作高VEGF表達的RPE細胞損傷模型[13]。
MSC是一種具有多分化潛能細胞，可以分化為成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞等中胚層細胞。有研究證實MSC通過抑制血管生成能實現抗腫瘤效果[14, 15]。但如果直接將MSC移植作為治療手段，有照組；hUCMSC外泌體處理組RPE細胞VEGF-A表達隨作用濃度提高呈明顯下降趨勢苯基吲哚+HRP
可能出現體內細胞分化無法精準控制及腫瘤形成等副作用[16-18]。隨著外泌體研究的逐漸深入，將MSC外泌體作為細胞生物制劑用于疾病治療既可以準確傳遞MSC的細胞信息，又能避免MSC直接移植產生的風險。Lee等[7]發現，MSC外泌體可以通過下調VEGF表達、抑制血管生長的方式抑制腫瘤生長。這為本研究開拓了思路，即探索MSC外泌體潛在的抗VEGF作用是否能夠用于治療AMD等眼部高VEGF表達的疾病。我們成功從hUCMSC中提取出外泌體，并經過檢測鑒定，其中含有所有外泌體共性標志CD63及hUCMSC標志物CD93，證實其成分可靠。目前外泌體研究中所應用的提取方式主要有梯度超速離心法、試劑盒提取法及分離純化層析柱過濾提取[19]。前一種方式費時，但確保外泌體純度；后兩種方式省時，但有可能在提取物中摻雜雜蛋白成分[20]。為確保研究真實可靠，排除雜質蛋白干擾，故本研究采取梯度超速離心法。有研究提出，外泌體提取所用上清液應為無血清培養液[21]。但本研究在預實驗中發現無血清培養造成細胞形態異常，數量減少，故選取去外泌體專用血清；既保證細胞營養獲取，又確保外泌體中不包含血清相關外泌體。
本研究結果顯示，hUCMSC外泌體對于藍光損傷ARPE-19細胞具有明顯的抗VEGF作用；且隨濃度及時間增加，效果越強。該結果與Lee等[7]報道的抗VEGF作用相吻合。但其安全性需要進一步細胞活性試驗來驗證，hUCMSC外泌體在體內實驗中抗VEGF作用的有效性及安全性則需要動物試驗來明確。此外，在進一步體外及體內實驗中，應考慮設置hUCMSC直接干預組，通過與hUCMSC外泌體干預組比較，以明確hUCMSC外泌體是否存在明顯的治療優勢。
外泌體內富含mRNA及miRNA。有研究證實，miRNA可能參與VEGF分泌調節[22]。驗證何種miRNA存在于hUCMSC外泌體，并通過何種機制發揮抗VEGF作用有待于今后進一步實驗驗證。目前關于MSC對VEGF的調節仍有不同意見，在促進組織損傷修復方面，有研究證實其具有上調VEGF作用[23]。而在腫瘤研究方面，則有研究證實其下調VEGF[7, 14]。提示我們MSC有可能根據細胞內外環境不同，在VEGF表達異常時，存在自動識別、調控機制從而達到環境穩態。而MSC來源的外泌體是否具有這一特性亦是進一步研究的重點。
視網膜色素上皮(RPE)是成年人眼后節血管內皮生長因子(VEGF)生成的主要部位[1]。在老年性黃斑變性(AMD)的發病過程中，外層視網膜缺氧導致RPE細胞分泌VEGF增加是形成脈絡膜新生血管(CNV)的主要原因[2]。外泌體是一種活細胞分泌的直徑在50~100 nm之間的具有脂質雙分子層結構的微小囊泡，囊泡內含有與其分泌細胞相關的蛋白質、mRNA、miRNA、脂質及信號因子等[3]。外泌體可以在細胞間穿梭，將其內蛋白質及RNA帶到靶細胞，使靶細胞產生相應反應[4]。已有研究證實，間充質干細胞(MSC)可通過細胞轉化、分泌神經營養因子或調節炎性介質水平等方式對于某些視網膜疾病具有潛在治療作用[5, 6]。來源于MSC的外泌體對于腫瘤細胞具有明顯的抗VEGF作用，能夠明顯抑制體內及體外環境腫瘤細胞所致新生血管形成[7]。如能證實MSC外泌體對于類似AMD改變的RPE細胞具有明確的抗VEGF作用，將會為AMD的治療提供更多選擇。為此，本研究通過藍光誘導建立人RPE細胞光損傷模型模仿AMD損傷的RPE，觀察人臍帶MSC (hUCMSC)外泌體對藍光損傷后人RPE細胞VEGF-A蛋白和mRNA的影響，探討是否具有抗VEGF作用。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 實驗材料
hUCMSC由中國醫學科學院血液學研究所惠贈。人RPE細胞株ARPE-19細胞(美國ATCC公司)，MSC培養基(美國Sciencell公司)，Dulbecco改良Eagle (DMEM)培養基、胎牛血清(美國Gibco公司)，去外泌體胎牛血清(exo-FBS，美國SBI公司)，BioTrace?NT硝酸纖維素膜(美國Millipore公司)，Trizol RNA提取試劑盒(美國Invitrogen公司)，M-MLV逆轉錄酶、RNA酶抑制劑(日本Takara公司)，增強化學發光試劑盒(ECL，美國PerkinElmer公司)，噻唑藍(MTT，上海碧云天生物技術有限公司)，小鼠抗人CD63、CD90單克隆抗體(亞諾法生技股份有限公司)，VEGF-A一抗、二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒(沈陽萬類生物科技有限公司)，辣根過氧化物酶(HRP)標記二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司)，TES1332A數字照度計(中國臺灣泰仕電子工業股份有限公司)，20W醫用藍光燈管(上海電工儀器廠)，低溫超速離心機(美國Beckman公司)。
1.2 hUCMSC外泌體的提取與鑒定
hUCMSC用含10%胎牛血清的MSC培養基(含青霉素、鏈霉素各100 U/ml)，置于37℃、5%CO2培養箱中培養，每隔3~4天換液，待細胞長至培養瓶底80%~90%面積時，用0.25%胰蛋白酶進行細胞消化，傳代培養。取5~7代生長良好細胞，以含10% exo-FBS的培養液培養48 h后，收集培養上清液，2000×g離心30 min除去細胞碎片，再經0.45 μm無菌濾膜過濾到15 ml規格的超濾離心管中，4℃條件下1000×g離心70 min，得到外泌體濃縮液。將濃縮液移至15 ml超速離心管中，4℃條件下，100 000×g離心70 min，收集底部沉淀用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋后，再次100 000×g離心70 min，洗滌1次，最后將收集的外泌體濃縮液以0.22 μm濾膜過濾除菌，于-80℃冷藏備用。
按1：10的比例稀釋外泌體樣本，銅網蘸取少量稀釋后樣品，用鑷子將銅網放入3%磷鎢酸溶液中染色5 min加深背景，濾紙去除多余染色劑，采用透射電子顯微鏡觀察并拍攝照片。
參照文獻[7, 8]的方法，采用蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測hUCMSC外泌體表面特異性標志蛋白CD63及hUCMSC表面蛋白CD90的表達。將外泌體樣品與含有β-巰基乙醇的5倍上樣緩沖液混合后，煮沸變性5 min，冰浴5 min。取30 μg蛋白樣品上樣進行十二烷基磺酸鈉(SDS)變性，10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳至目的蛋白有效分離。轉膜，脫脂奶粉封閉。將膜置于含對應小鼠抗人CD63及CD90單克隆抗體的蛋白免疫雜交封閉(Blotto)溶液中，搖床上4℃輕輕搖動過夜。洗膜緩沖液洗滌后，將膜浸入含相應HRP標記二抗的Blotto溶液中，室溫輕輕搖動2 h。最后用ECL試劑盒檢測，顯影。以磷酸甘油醛脫氫酶(GADPH)為參照。
1.3 RPE細胞光損傷模型建立及實驗分組
ARPE-19細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養液(含青霉素、鏈霉素各100 U/ml)置于37℃、5% CO2培養箱中培養，每2天換液，細胞將近鋪滿時以0.25%胰蛋白酶消化并按1：2進行傳代，取第6~10代生長良好細胞用于實驗。同代生長良好的細胞融合至80%~90%時，隨機將細胞分為正常對照組、光損傷組、hUCMSC外泌體處理組。將波長為425~475 nm的20W醫用藍光燈管自制為光照器，懸掛于37℃恒溫培養箱頂部，調整光源與細胞培養瓶之間距離。照度計檢測同一被照平面細胞光照度為(2000±500) Lux。光照時該水平溫度變化在36.5~37.5℃，密閉恒溫箱內確保無自然光干擾。正常對照組細胞培養瓶用遮光錫紙遮蓋，置于恒溫箱內36 h結束培養。光損傷組在持續光照12 h后停止光照，并繼續培養24 h后結束培養。hUCMSC外泌體處理組在持續光照12 h后停止光照，細胞培養液中分別加入25、50、75 μg/ml的hUCMSC外泌體，并以此分為低濃度、中濃度、高濃度3個亞組。各濃度亞組繼續培養8、16、24 h結束培養[9]。
1.4 Western blot、實時定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)及免疫熒光檢測VEGF-A表達
采用Western blot檢測各組RPE細胞VEGF-A蛋白表達。細胞培養結束后徹底棄凈培養液，1 ml PBS浸洗細胞1遍并吸棄。用1 ml RIPA裂解液重懸，冰上作用30 min，其間不時搖動，然后吹打細胞，收集裂解后的細胞碎片及釋放出的蛋白，-80℃保存。
采用RT-PCR檢測各組RPE細胞VEGF-A mRNA表達。按照Trizol試劑盒說明書提取細胞總RNA，-80℃保存。運用Premier 5.0軟件設計上下游引物。VEGF-A：上游引物5′-GGCTGTTCTCGCT TCG-3′，下游引物5′ -TGTCCACCAGGGTCTCG-3′，擴增片段長度544堿基對(bp)。內參β-管蛋白(tublin)：上游引物5′-ATCCCATCACCATCTTCC-3′，下游引物5′-ATCACGCCACAGTTTCC-3′，擴增片段長度380 bp。按RT-PCR試劑盒說明書配制逆轉錄體系，條件為50℃ 30 min。配制聚合酶鏈反應(PCR)反應體系:總RNA 50 ng、5倍RNA探針緩沖液10 μl、25 mmol/L MgCl2 6 μl、10 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸5 μl、5 U/μl的逆轉錄DNA聚合酶1 μl、VEGF上游引物各1 μl，加焦碳酸二乙酯水至50 μl。反應條件為94℃ 30 s，62℃ 30 s，72℃ 1 min，重復30個循環。PCR產物1%瓊脂糖凝膠電泳30 min，紫外燈下觀察DNA條帶并拍照。采用sensiAnsys凝膠圖像分析軟件分析PCR產物。以VEGF-A條帶吸光度[A，舊稱光密度(OD)]值與β-tublin條帶A值的比值表示VEGF-A mRNA表達。
采用免疫熒光檢測各組RPE細胞VEGF-A蛋白表達。將正常對照組、光損傷組細胞及不同濃度hUCMSC外泌體干預16 h的細胞分別用無菌蓋玻片放置于6孔培養板中，將經過計數的細胞懸浮液移入培養板，使蓋玻片完全浸在培養液中，用預溫的1倍PBS洗3次。4%甲醛室溫固定20 min，0.2%聚乙二醇辛基苯基醚透化5 min，5%牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉30 min，加入1%BSA稀釋的抗VEGF-A一抗放在濕盒4℃過夜。加入1%BSA稀釋的二抗，閉光孵育120 min。95%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。
1.5 統計學分析
采用SPSS 19.0統計軟件進行統計學分析，實驗數據用均數±標準差(x±s)表示。組間比較采用方差分析。方差齊性時組間兩兩比較采用最小顯著差法，方差不齊時采用Dunnet t檢驗。P < 0.05為差異有統計學意義。
2 結果
透射電子顯微鏡觀察發現，hUCMSC外泌體為圓形或橢圓形膜性小囊泡，直徑50~100 nm，囊泡內存在低電子密度成分(圖 1)。Western blot檢測結果顯示，hUCMSC外泌體表達外泌體表面特異性標志蛋白CD63及hUCMSC表面蛋白CD90(圖 2)。
圖1
hUCMSC外泌體透射電子顯微鏡像。可見hUCMSC外泌體呈圓形或橢圓形膜性小囊泡，囊泡內存在低電子密度成分??圖 2? hUCMSC外泌體表面標志物CD63及CD90 Western blot檢測像。2A.CD63；2B.CD90
Western blot檢測結果顯示，光損傷組RPE細胞VEGF-A蛋白表達較正常對照組明顯增加，差異有統計學意義(t=-16.553，P < 0.05)。hUCMSC外泌體處理組RPE細胞培養8、16、24 h時，低濃度(t=2.945、4.477、6.657)、中濃度(t=4.713、6.421、8.836)、高濃度(t=6.539、12.194、12.783)亞組RPE細胞VEGF-A蛋白表達較光損傷組均下降，差異有統計學意義(P < 0.05)(圖 3)。hUCMSC外泌體處理組組內比較，相同濃度條件下，不同細胞培養時間的VEGF-A蛋白表達間差異均有統計學意義(F=3.980、11.148、45.496，P < 0.05)；相同細胞培養時間下，不同濃度的VEGF-A蛋白表達間差異均有統計學意義(F=5.306、29.989、25.724，P < 0.05)。
圖3
各組RPE細胞VEGF-A蛋白表達比較。*與正常對照組比較，P < 0.05；#與光損傷組比較，P < 0.05
RT-PCR檢測結果顯示，光損傷組RPE細胞VEGF-A mRNA表達較正常對照組明顯增加，差異有統計學意義(t=-19.456，P < 0.05)。hUCMSC外泌體處理組RPE細胞培養8、16、24 h時，低濃度(t=6.485、7.959、9.286)、中濃度(t=7.517、10.170、13.413)、高濃度(t=10.317、12.234、14.592)亞組RPE細胞VEGF-A mRNA表達較光損傷組均下降，差異有統計學意義(P < 0.05)(圖 4)。hUCMSC外泌體處理組組內比較，相同濃度條件下，不同細胞培養時間的VEGF-A mRNA表達間差異均有統計學意義(F=3.706、17.693、10.729，P < 0.05)；相同細胞培養時間下，不同濃度的VEGF-A mRNA表達間差異均有統計學意義(F=6.478、8.872、23.704，P < 0.05)。
圖4
各組RPE細胞VEGF-A mRNA表達比較。*與正常對照組比較，P < 0.05；#與光損傷組比較，P < 0.05
免疫熒光檢測結果顯示，光損傷組RPE細胞VEGF-A蛋白表達明顯強于正常對照組；隨著作用濃度提高，hUCMSC外泌體處理組VEGF-A蛋白表達呈明顯下降趨勢(圖 5)。
圖5
各組RPE細胞VEGF-A蛋白表達熒光顯微鏡像。5A.正常對照組；5B.光損傷組；5C.hUCMSC外泌體處理組低濃度亞組；5D.hUCMSC外泌體處理組中濃度亞組；5E.hUCMSC外泌體處理組高濃度亞組。光損傷組RPE細胞VEGF-A表達明顯強于正常對
3 討論
視網膜外層光感受器代謝主要依靠RPE細胞完成，缺氧以及長時間光照會激發針對RPE細胞氧化應激反應引起代謝異常，導致RPE細胞內脂褐素沉積及細胞外玻璃膜疣形成[10]。而玻璃膜疣中的糖基化終產物(AGE)可以與進展期AMD的RPE細胞及脈絡膜毛細血管中的AGE受體相結合，誘導RPE細胞中VEGF表達和分泌，從而激發CNV形成[11]。近年來國內外研究證實，通過藍光誘導損傷后的RPE細胞可促進VEGF分泌，與AMD長期慢性光損傷所引起的RPE細胞結構和功能變化類似[9, 12]。因此，我們選擇了藍光照射培養ARPE-19細胞制作高VEGF表達的RPE細胞損傷模型[13]。
MSC是一種具有多分化潛能細胞，可以分化為成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞等中胚層細胞。有研究證實MSC通過抑制血管生成能實現抗腫瘤效果[14, 15]。但如果直接將MSC移植作為治療手段，有照組；hUCMSC外泌體處理組RPE細胞VEGF-A表達隨作用濃度提高呈明顯下降趨勢苯基吲哚+HRP
可能出現體內細胞分化無法精準控制及腫瘤形成等副作用[16-18]。隨著外泌體研究的逐漸深入，將MSC外泌體作為細胞生物制劑用于疾病治療既可以準確傳遞MSC的細胞信息，又能避免MSC直接移植產生的風險。Lee等[7]發現，MSC外泌體可以通過下調VEGF表達、抑制血管生長的方式抑制腫瘤生長。這為本研究開拓了思路，即探索MSC外泌體潛在的抗VEGF作用是否能夠用于治療AMD等眼部高VEGF表達的疾病。我們成功從hUCMSC中提取出外泌體，并經過檢測鑒定，其中含有所有外泌體共性標志CD63及hUCMSC標志物CD93，證實其成分可靠。目前外泌體研究中所應用的提取方式主要有梯度超速離心法、試劑盒提取法及分離純化層析柱過濾提取[19]。前一種方式費時，但確保外泌體純度；后兩種方式省時，但有可能在提取物中摻雜雜蛋白成分[20]。為確保研究真實可靠，排除雜質蛋白干擾，故本研究采取梯度超速離心法。有研究提出，外泌體提取所用上清液應為無血清培養液[21]。但本研究在預實驗中發現無血清培養造成細胞形態異常，數量減少，故選取去外泌體專用血清；既保證細胞營養獲取，又確保外泌體中不包含血清相關外泌體。
本研究結果顯示，hUCMSC外泌體對于藍光損傷ARPE-19細胞具有明顯的抗VEGF作用；且隨濃度及時間增加，效果越強。該結果與Lee等[7]報道的抗VEGF作用相吻合。但其安全性需要進一步細胞活性試驗來驗證，hUCMSC外泌體在體內實驗中抗VEGF作用的有效性及安全性則需要動物試驗來明確。此外，在進一步體外及體內實驗中，應考慮設置hUCMSC直接干預組，通過與hUCMSC外泌體干預組比較，以明確hUCMSC外泌體是否存在明顯的治療優勢。
外泌體內富含mRNA及miRNA。有研究證實，miRNA可能參與VEGF分泌調節[22]。驗證何種miRNA存在于hUCMSC外泌體，并通過何種機制發揮抗VEGF作用有待于今后進一步實驗驗證。目前關于MSC對VEGF的調節仍有不同意見，在促進組織損傷修復方面，有研究證實其具有上調VEGF作用[23]。而在腫瘤研究方面，則有研究證實其下調VEGF[7, 14]。提示我們MSC有可能根據細胞內外環境不同，在VEGF表達異常時，存在自動識別、調控機制從而達到環境穩態。而MSC來源的外泌體是否具有這一特性亦是進一步研究的重點。
